CN1602203A

CN1602203A - gp130激活剂在糖尿病性神经病变中的应用

Info

Publication number: CN1602203A
Application number: CNA028247272A
Authority: CN
Inventors: M·德雷诺; P·－A·怀特
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-10
Publication date: 2005-03-30
Also published as: DK1434597T3; US20100189684A1; JP2005505608A; PL369296A1; EP1434597B1; US7465441B2; BR0213183A; HRP20040292A2; ATE542542T1; WO2003033015A1; ZA200402351B; YU29804A; EP1434597A1; US20090169506A1; CA2463020A1; EA006881B1; US8278286B2; EA200400520A1; IL161310A0; US20050058623A1

Abstract

本发明涉及通过gp130传导信号的物质在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。优选使用IL－6。

Description

gp130激活剂在糖尿病性神经病变中的应用

技术领域

本发明是糖尿病和周围神经系统疾病领域。具体地说，本发明涉及通过gp130传导信号的物质在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。此特定医学症状优选使用IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物。

发明背景

糖尿病是一种糖类化合物代谢疾病，即以胰岛素分泌和/或胰岛素作用绝对或相对受损而引起高血糖为特征的一种综合征。

糖尿病的分类采用美国国家糖尿病资料小组和世界卫生组织的方法。以前糖尿病分类基于发病年龄、患病持续的时间和疾病的并发症。妊娠糖尿病是妊娠期发生或首次发现的不同程度糖类化合物耐受不良。I型糖尿病也称胰岛素依赖型糖尿病或发生于青少年的糖尿病，I型糖尿病患者可发展为糖尿病酮症酸中毒(DKA)。II型糖尿病也称非胰岛素依赖型糖尿病，II型糖尿病患者可发展为非酮症性高血糖高渗性昏迷(NKHHC)。常见的晚期微血管并发症包括视网膜病、肾病以及周围和自主神经病变。大血管并发症包括粥样硬化冠状动脉和周围动脉疾病。

I型糖尿病：虽然可发生于任何年龄，但最常发生于儿童或青少年，30岁以下诊断的糖尿病主要是I型糖尿病。此种糖尿病占糖尿病病例的10-15％，临床特征是血糖高，容易发生糖尿病酮酸症。胰腺分泌少量胰岛素或不分泌胰岛素。

约80％I型糖尿病患者具有与可检测血清胰岛细胞胞质抗体和胰岛细胞表面抗体(在同样比例的病例中发现抗谷氨酸脱羧酶抗体和抗胰岛素抗体)相关的特异性HLA表型。

I型糖尿病患者有90％胰岛素分泌细胞具有遗传易感免疫介导的选择性破坏。他们的胰岛发生胰岛炎，特征是T淋巴细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞浸润，损失大部分β细胞，不涉及分泌胰高血糖素的α细胞。诊断发现的抗体通常在数年后就检测不到。它们可能主要是对β细胞破坏的应答，但一些对β细胞有毒性，导致β细胞的损失。一些患者不知不觉发生潜伏的自身免疫过程数年后，在临床上可能发展为I型糖尿病。很多正在进行的预防性研究包括这些抗体的筛选。

II型糖尿病：II型糖尿病通常的发病年龄在30岁以后，但也可发生于儿童和青少年。临床症状是高血糖和胰岛素抵抗。糖尿病酮症酸中毒较罕见。虽然大部分患者通过饮食、锻炼与口服药物治疗，但是某些患者间歇或持续地要求用胰岛素控制症状性高血糖，并预防非酮症性高血糖高渗性昏迷。单卵双胞胎同时发生II型糖尿病的机率大于90％。II型糖尿病一般与肥胖，特别是上身(内脏/腹部)肥胖有关，往往在增重一段时间后出现。年龄相关的葡萄糖耐受不良与典型的体重增加有密切关系。内脏/腹部肥胖的II型糖尿病在体重减轻后回复正常葡萄糖水平。

II型糖尿病是一组异源疾病，对葡萄糖的胰岛素分泌应答受损以及胰岛素在通过骨胳肌刺激葡萄糖摄取以及抑制肝葡萄糖产生的效能减低(胰岛素抵抗)，导致高血糖症。不过胰岛素抵抗是一种常见现象，大多数有胰岛素抵抗的患者不会发展为糖尿病，因为身体以适当增加胰岛素分泌来补偿。常见II型糖尿病中的胰岛素抵抗不是因为胰岛素受体或葡萄糖转运蛋白的基因突变所致。然而，通过基因确定的受体后胞内缺陷可能起一定作用。所造成的高胰岛素血症可导致其他一些常见病情，例如肥胖(腹部)、高血压、高血脂以及冠状动脉疾病(胰岛素抵抗综合征)。

遗传因素似乎是发生II型糖尿病的主要决定因素，但II型糖尿病与特异性HLA表型或与胰岛细胞胞质抗体之间的关联尚未得到证实。一个例外是有可检测胰岛细胞胞质抗体的非肥胖成人亚型，他们带其中一种HLA表型，并最后发展为I型糖尿病。

发生糖尿病之前，患者一般会丧失对葡萄糖的早期胰岛素分泌应答，可分泌相对大量的胰岛素原。在已确定的糖尿病中，虽然II型糖尿病患者体内空腹血浆胰岛素水平可能是正常的，或者甚至上升，但葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显下降。胰岛素水平下降导致胰岛素介导的葡萄糖摄取量减少，不能抑制肝葡萄糖的产生。

高血糖症既是糖尿病患者对葡萄糖的进一步耐受不良(葡萄糖中毒)的结果，又是原因，这是因为高血糖症使胰岛素敏感性降低，肝葡萄糖产量增加。一旦患者的代谢控制改善了，一般可以减低胰岛素低血糖药物剂量。

一些II型糖尿病病例发生于常染色体显性遗传的非肥胖青少年(年青的成年发病型糖尿病(MODY))。许多MODY家族的葡萄糖激酶基因发生突变。已经证实，这些患者在胰岛素分泌与肝葡萄糖调节方面是不良的。

糖尿病中较罕见的是胰岛素病变，其临床症状是II型糖尿病，由缺陷基因杂合遗传性引起，可导致分泌正常情况下不与胰岛素受体结合的胰岛素。这些患者体内与对外源胰岛素的正常血糖应答相关的血浆免疫反应性胰岛素水平大幅上升。

糖尿病也可归因于胰腺疾病：慢性胰腺炎特别是酗酒者的慢性胰腺炎往往与糖尿病有关。这些患者失去分泌胰岛素和分泌葡萄糖的胰岛。所以，他们可能有中度高血糖症，对低剂量胰岛素敏感。假若缺乏有效的反调节(葡萄糖不对抗的外源胰岛素)，通常他们很快会发生高血糖症。在亚洲、非洲和加勒比海地区，糖尿病常见于有蛋白质严重缺乏症和胰腺疾病的严重营养不良年青患者；这些患者不易发展为糖尿病酮症酸中毒，但可能需要胰岛素。

糖尿病的诊断：当非对称性患者满足空腹高血糖症的诊断标准：成人或儿童两次隔晚空腹后血浆(或血清)葡萄糖水平大于等于140毫克/分升(大于等于7.77毫摩尔/升)时，可确诊为糖尿病。

口服葡萄糖耐受测试有助于诊断空腹葡萄糖在115至140毫克/分升(6.38至7.77毫摩尔/升)之间的患者以及临床症状与未确定的糖尿病(例如多发性神经病变、视网膜病)有关的患者是否有II型糖尿病。

糖尿病的治疗：大部分长期糖尿病微血管并发症由高血糖症引起。已经证明了Hb A_1c(见下文)水平与并发症发生率之间的线性关系。其他一些研究也提出，HbA_1c＜8％是可预防大部分并发症的下限。所以，治疗I型糖尿病应尝试加强代谢控制以降低Hb A_1c，同时避免出现高血糖。然而，治疗必须因人而异，当情况有可能产生不可接受的高血糖症风险时(例如对于生命期可能缩短的患者和有脑血管病或心脏病的患者)，或者当患者发生高血糖症的风险增大时(例如对于不可靠或有自主神经病变的患者)，应作出改变。

对于II型糖尿病超重患者，控制饮食以达到减轻体重是最重要的。如果通过控制饮食还不能改善高血糖症，则应该开始尝试口服药物。

应对患者作定期评估，检查是否有并发症症状或迹象，包括检查足、足和腿的脉搏和感觉，并进行尿液测试以检查清蛋白。周期性实验评估包括血脂检查、血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐水平、ECG和每年全面的眼科评估。

高胆固醇血症或高血压会增加特异性晚期并发症的风险，需要特别注意和适当治疗。虽然β肾上腺素受体阻断剂(β阻断剂如普萘洛尔)可安全地用在大多数糖尿病患者中，但它们可遮蔽胰岛素诱导的高血糖症的β肾上腺素症状，并能减弱正常反调节应答。因此，通常选择的药物是ACE抑制剂和钙拮抗剂。

所有患者都应进行血糖监测，因此应教导用胰岛素治疗的患者调节他们的胰岛素剂量。以容易使用的家用分析计分析指尖血滴，就可测试葡萄糖水平。推荐使用装有弹簧的刺血针来采指尖血液样品。测试频率视乎个人而定。用胰岛素治疗的糖尿病患者最好应于每日餐前、餐后1至2小时以及睡觉时测试他们的血糖。

大多数医生在之前1至3个月定期测定糖化血红蛋白(Hb A_1c)，以估算血糖的控制情况。Hb A_1c是通过血糖非酶解糖化血红蛋白所得到的稳定产物，其形成速率随着血糖水平上升而增加。大部分实验室中正常Hb A_1c水平约6％；难以控制的糖尿病患者的水平在9％至12％之间。Hb A_1c不是诊断糖尿病的特异性测试，但Hb A_1c水平上升往往意味着存在糖尿病。

有另一种测试测定果糖胺水平。果糖胺是葡萄糖与血浆蛋白化学反应而形成，反映前面1至3星期的葡萄糖控制情况。所以，该测试可显示Hb A_1c之前的控制变化，在采用深切治疗时以及在短期临床试验中通常都很有用。

至于胰岛素治疗，一般优选采用人胰岛素来开始胰岛素治疗，因为它的抗原性较动物物种低。然而，大多数以胰岛素治疗的患者，包括接受人胰岛素制剂的那些患者，其体内可检测的胰岛素抗体水平通常极低。

胰岛素一般配成含100U/ml(U-100胰岛素)的制剂，用一次性胰岛素注射器皮下注射。一般注射剂量少于等于50U的患者通常优选采用1/2毫升注射器，因为它们能更容易读数，有利于准确测量较小剂量。多剂胰岛素注射器(NovolinPen)一般称为笔型胰岛素注射器，设计成使用含几天剂量的注射筒。胰岛素应冷藏，但不应冷冻；不过，大部分胰岛素制剂在室温下可稳定储存数月，这有利于工作和旅行时使用。

糖尿病可与其他内分泌疾病相关。II型糖尿病可由库兴氏综合征(Cushing’ssyndrome)、肢端肥大症、嗜铬细胞瘤、胰高血糖素瘤、原发性醛固酮增多症、或生长抑制素瘤引起。这些疾病中大部分与周围或肝胰岛素抵抗有关。一旦胰岛素分泌减少，很多患者就会转为糖尿病。一些自身免疫内分泌疾病(例如格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎和特发性阿狄森氏病)患者患上I型糖尿病的人数不断增加。

糖尿病也可受β细胞毒素诱导。例如，链脲菌素(STZ)可诱发大鼠实验性糖尿病，但很少能导致人发生糖尿病。

糖尿病的晚期并发症发生于难以控制的高血糖症几年之后。除了葡萄糖摄取受胰岛素介导的细胞外(主要是肌肉)，其余全部细胞的葡萄糖水平都上升，导致糖化增加以及其他代谢途径活性增大，这可由并发症引起。通过严格控制血糖，即达到近正常空腹和餐后葡萄糖水平，反映为近正常糖化血红蛋白(Hb A_1c)，可延迟、防止、或者甚至逆转大部分微血管并发症。大血管疾病例如动脉粥样硬化症可导致症状性冠状动脉病、跛行、皮肤开裂和感染。虽然高血糖症可加速动脉粥样硬化，但糖尿病(有胰岛素抵抗)发病之前有多年高胰岛素血症病史可能起着主要引发作用。重度周围血管疾病、间歇性跛行和坏疽的患者截去下肢仍然是普遍做法。背景性视网膜病(检眼镜检查或视网膜拍片中看到视网膜开始有所改变)对视力影响不大，但可逐渐发展为黄斑水肿或增殖性视网膜病，导致视网膜脱离或出血，可能致盲。全部糖尿病患者中约85％最终会发展为一定程度的视网膜病。糖尿病性神经病变通常是非对称的，直至发展为终末期肾病，但它可引起肾病综合征。

糖尿病性神经病变是糖尿病的另一种并发症，但通常也与其他疾病有关连。

多发性单一神经病变通常由胶原血管疾病(例如结节性多动脉炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、类风湿性关节炎)、肉样瘤病、代谢疾病(例如糖尿病、淀粉样变性病)或感染疾病(例如莱姆病、HIV感染)引起。微生物通过直接侵入神经可引起多发性单一神经病变(例如在麻疯病中)。

毒素(例如在白喉中)或自身免疫反应(例如在格-巴二氏综合征中)可导致急性发热病引起的多发性神经病变；在免疫之后发生的多发性神经病变有时也可能有自身免疫作用。

毒剂一般引起多发性神经病变，但有时也引起单一神经病变。它们包括依米丁、环己烯巴比妥、巴比妥、氯丁醇、磺酰胺、苯妥因、呋喃妥因、长春花生物碱、重金属、一氧化碳、磷酸三邻甲苯酯、邻二硝基酚、很多溶剂、其他工业毒剂和一些AIDS药物(例如扎西他滨、去羟肌苷)。

营养不良和代谢紊乱可导致多发性神经病变。缺乏维生素B通常是诱因(例如在酒精中毒、脚气病、恶性贫血、异烟肼诱导的维生素B6缺乏、吸收不良综合征和妊娠剧吐中)。多发性神经病变也可发生于甲状腺机能减退、卟啉症、肉样瘤病、淀粉样变性病和尿毒症。

恶性肿瘤可通过单克隆丙种球蛋白病(多发性骨髓瘤、淋巴瘤)、淀粉样侵入或营养不良或副肿瘤综合征而引起多发性神经病变。

因代谢紊乱如糖尿病或肾衰竭引起的多发性神经病变发生得较慢，一般要数月或数年。通常，发病早期是下肢感觉异常，下肢远端往往比近端严重得多。通常主要为周围针刺样、麻木、灼痛或关节本体感受和振动感觉不良。一般来说，夜间疼痛更严重，触摸患病组织或改变温度可加重疼痛。重度病症有一些失去感觉的客观病征，一般呈袜套和手套型分布。阿希利斯及其他深部跟腱反射减少或者不存在。当感觉丧失加深时，脚趾或夏科氏关节可能出现无痛溃疡。缺乏感觉或本体感受可导致步法异常。运动受累引致远端肌肉无力和萎缩。还可能附加地或选择性地累及自主神经系统，导致夜间腹泻、尿液和排泄物失禁、阳萎或姿态性低血压。血管收缩症状改变。皮肤可能比正常皮肤苍白和干燥，有时伴有变暗；出汗过多。重度、长期患者常伴有营养性改变(皮肤变滑和有光泽、指甲有凹凸痕、骨质疏松)。

治疗全身性疾病(例如糖尿病、肾衰竭、多发性骨髓瘤、肿瘤)可使疾病停止发展，并改善症状，但恢复是缓慢的。嵌压性神经病变可能需要注射皮质类固醇或作减压手术。物理治疗和夹板能减低发生挛缩的可能性和严重性。

糖尿病可引起感觉运动远端多发性神经病变(最常见)、多发性单一神经病变和局灶性单一神经病变(例如动眼或外展颅神经)。多发性神经病变通常是远端、对称性、主要是感觉神经病变(能引起感觉缺陷，早期呈袜套-手套型分布，并通常以此种分布为特征)。

一般而言，周围神经病变定义为丧失感觉、肌肉无力和萎缩、深部跟腱反射减少以及血管舒缩单独一项症状或其任何组合症状的综合征。该疾病可影响单根神经(单一神经病变)、不同区域内的两或多根神经(多发性单一神经病变)，或同时影响很多根神经(多发性神经病变)。主要受影响的可能是轴突(例如在糖尿病、莱姆病、或尿毒症或由毒剂引起的疾病中)、髓鞘或许旺细胞(例如在急性或慢性炎症多发性神经病变、脑白质病变或格-巴二氏综合征中)。无髓鞘或有髓鞘小纤维受损主要引致对温度的感觉及痛觉丧失；有髓鞘大纤维受损引致运动或本体感觉缺陷。一些神经病变(例如由铅中毒、使用氯苯砜、蜱螫伤、卟啉症或格-巴二氏综合征引起的神经病变)主要影响运动纤维；其他神经病变(例如由癌症背根神经节炎、麻疯病、爱滋病、糖尿病或慢性维生素B₆中毒引起的神经病变)主要影响背根神经节或感觉纤维，产生感觉症状。有时还会累及颅神经(例如在格-巴二氏综合征、莱姆病、糖尿病和白喉中)。

创伤是导致单根神经局部受损的最常见原因。激烈的肌肉活动或关节受迫过度拉伸都可能引起局灶性神经病变，不断发生小创伤(例如小器具夹伤、气锤引起的过分震动)也可引致同样结果。压力或挤压性麻痹通常影响骨突起物(例如在瘦削或虚弱的人的酣睡或麻醉过程中，常发生于酗酒者)或狭窄管(例如在腕管综合征中)上的浅神经(尺骨神经、桡神经、腓神经)。肿瘤、骨肥大、投掷、持拐、或长期夹紧姿势(例如从事园艺工作)也可导致压力性麻痹。神经出血以及暴露于冷却或辐射环境中也可引起神经病变。单一神经病变还可以由直接肿瘤侵犯引起。

糖尿病性神经病变可引起肢端麻木、针刺样、和麻痹，较少情况下会导致疲惫、剧烈深度疼痛和感觉过敏。通常，踝反射减少或不存在。必须排除引起多发性神经病变的其他原因。影响第3、4或6根颅神经以及其他神经如股神经的急性痛性单一神经病变在数星期至数月内自发地好转，更多发生于老年糖尿病患者，进而导致神经梗塞。自主神经病变主要发生于多发性神经病变糖尿病患者，可引起姿态性低血压、出汗异常、男性阳萎和逆行射精、膀胱功能障碍、胃排空延迟(有时出现倾倒综合征)、食道功能障碍、便秘或腹泻、以及夜间腹泻。糖尿病患者的自主神经病变的表现为瓦耳萨耳瓦动作或站立心率下降，深呼吸时心率波动不变。

糖尿病性多发性神经病变是足溃疡和关节问题的主要原因，而足溃疡和关节问题又是糖尿病发病的重要起因。在糖尿病性多发性神经病变中，去感觉神经削弱了诸如不合穿鞋子或小石等常见原因引起的创伤感觉。本体感觉改变导致负重模式反常，有时还会发展为夏科氏关节。

患上足溃疡的患者因为神经病变往往感受不到疼痛，一直到无知觉后期全身都没有症状。深部溃疡，特别是与任何可检测的蜂窝组织炎相关的溃疡需要即时住院治疗，因为可能发展为全身中毒和永久残废。在早期进行外科清创是治疗不可或缺的一部分，但有时也需要进行切除手术。

白介素-6(IL-6)是一种由多种不同类型的细胞产生和分泌的多功能细胞因子。这种多效细胞因子在包括免疫反应、急相反应和造血在内的细胞防御机制中起中心作用。IL-6是具有185个氨基酸的20至26kDa糖蛋白，早已被人克隆出来(May等，1986；Zilberstin等，1986；Hirano等，1986)。以前IL-6被称为B细胞刺激因子2(BSF-2)、干扰素-β2和肝细胞刺激因子。IL-6由许多不同组织包括肝、脾和骨髓以及不同类型的细胞包括单细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B和T细胞分泌出来。IL-6在转录水平上被多种信号，包括病毒、双链RNA、细菌和细菌脂多糖以及IL-1和TNF等炎症细胞因子所激活。

IL-6牵涉于人炎性中枢神经系统疾病的发病机理。例如，已经证实，多发性硬化症患者体内IL-6的血浆和脑脊液水平上升(Frei等，1991)。

最近关于IL-6对中枢和周围神经系统细胞的作用所进行的实验表明，IL-6对神经元细胞有保护作用，对炎症性神经变性过程有一定影响(Gadient和Otten，1997；Mendel等，1998)。已经发现，IL-6能防止海马回(Yamada等，1994)和纹状体(Toulmond等，1992)神经元中谷氨酸诱导的细胞死亡。在表达较高水平人IL-6和人可溶性IL-6R(sIL-6-R)的转基因小鼠中，如脑中舌下神经核退变所示，观察到舌下神经损伤后，神经的再生加速(Hirota等，1996)。此外，有证据显示，IL-6参与神经系统疾病、脱髓鞘疾病和多发性硬化症(Mendel等，1998)。缺少IL-6基因的小鼠抵抗实验性诱导疾病。另一方面，也有报导指出，IL-6对神经损伤后的早期后创伤阶段的神经元存活有负面作用(Fisher等，2001)。

IL-6的生物活性由膜受体系统介导，该膜受体系统含有两个不同蛋白，一个是IL-6受体或称gp80，另一个是gp130(Hirano等综述，1994)。gp130是长918个氨基酸包括277个氨基酸胞内结构域的跨膜糖蛋白，是组成一些细胞因子受体包括IL-6、IL-11、LIF、制癌蛋白M、CNTF(睫状神经营养因子)、CT-1受体的亚基。IL-6是通过gp130作用的细胞因子原型，该细胞因子家族也称“IL-6型细胞因子”。

gp130通过结合低亲和力受体链而参与形成这些细胞因子的高亲和力受体。因此，gp130也称“亲和力转换器”。结合细胞因子受体的配体导致gp130二聚化(如IL-6受体所示)或与gp130相关蛋白(称为ILFRβ亚基)异二聚化(如LIF、制癌蛋白M和CNTF受体所示)。各配体的结合与称之Janus激酶(JAK)的酪氨酸家族的激活/缔合相关，这是胞内信号转导的第一步。胞内信号传导过程包括酪氨酸磷酸化和激活因子STAT(细胞转导与转录激活因子)。

人gp130基因产物似乎与染色体5和17上两个不同染色体基因座同源。存在两个不同gp130基因序列限于灵长类动物，未在其他脊椎动物中发现。

已经发现，针对gp130的不同单克隆抗体能特异性地封闭IL-6、IL-11、CNTF、制癌蛋白M和LIF的活性。另外，已经发现直接激活gp130的单克隆抗体，与是否存在细胞因子或其受体无关。

针对gp130的其他单克隆抗体已经显示能抑制IL-6介导的功能。在人的血清中发现分子量为90和110kDa的gp130可溶性形式(sgp130)。它们能抑制那些细胞因子(使用以gp130为组分的受体系体)的生物功能。

对应于gp80的胞外结构域的IL-6R gp80可溶性形式(sIL-6R)是作为血液和尿中的糖蛋白发现的人体天然产物(Novick等，1990，1992)。sIL-6R分子的例外特性是它们在许多细胞类型包括人细胞上作为IL-6的潜在拮抗剂作用(Taga等，1989；Novick等，1992)。这是因为即使没有gp80的胞质内结构域，sIL-6R仍然能够引发应答IL-6的gp130的二聚化，这依次介导了随后的IL-6特异的信号转导和生物效应(Murakami等，1993)。sIL-6R与gp130具有两种类型的相互作用，这两种作用是IL-6特异的生物活性所必须的(Halimi等，1995)，活性的IL-6受体复合物是由于两条gp130链、两个IL-6R和两个IL-6配体形成六聚体结构(Ward等，1994；Paonessa等，1995)。

把可溶性IL-6受体和IL-6连接在一起的嵌合分子已有描述(Chebath等，1997；Fisher等，1997；WO 99/02552和WO 97/32891)。它们分别被命名为IL-6R/IL-6嵌合物和Hyper-IL-6，下文称IL-6R/IL-6。使编码可溶性IL-6受体(sIL-6R)的cDNA的整个编码区与IL-6融合，可产生IL-6R/IL-6嵌合物(Fisher等，1997；Chebath等，1997)。重组的IL-6R/IL-6嵌合物在CHO细胞中产生(Chebath等，1997；WO99/02552)。与IL-6和sIL-6R的混合物相比，IL-6R/IL-6嵌合物在体外与gp130链以较高效率相结合(Kollet等，1999)。

发明内容

本发明已经发现，给予通过gp130传导信号的物质对已建立的糖尿病性神经病变的动物模型产生了明显的有益效果。测试的示范物质是IL-6和IL-6R/IL-6嵌合物。涉及神经活力的多个参数有所改善表明，两种物质对糖尿病性神经病变有很有益的作用。

所以，本发明涉及通过gp130传导信号的物质在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

本发明另一个目的是表达通过gp130传导信号的物质的细胞在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。此外，根据本发明，含有通过gp130传导信号的物质的编码序列的载体用于制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物。

附图说明

图1所示为实验性动物体重的进展情况。

图2所示为接受腹腔内给药的实验系列动物诱导糖尿病10天(A)和40天(B)后的血糖值。

图3所示为接受腹腔内给药的动物置于热源时甩尾所用的时间，以秒计。

图4所示为接受腹腔内给药的动物的复合肌肉动作电位(CMAP)，以潜伏期/秒表示。

图5所示为接受腹腔内给药的实验性动物的感觉神经传导速度(SNCV)，以米/秒表示。

图6所示为接受腹腔内给药的实验性动物的轴突直径，以微米表示。

图7所示为接受腹腔内给药的实验性动物的纤维直径，以微米表示。

图8所示为接受腹腔内给药的实验性动物的髓鞘质厚度，以微米表示。

图9所示为接受腹腔内给药的实验性动物的有髓鞘纤维数目/区域。

图10所示为IL-6R/IL-6嵌合物结构的示意图。

图11所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物体重的进展情况。

图12所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物诱导糖尿病10天和41天后的血糖值。

图13所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物置于热源时甩尾所用的时间。

图14所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物跨越方块(crossed squares)的数目(A)和后脚站立(rearings)次数(B)。

图15所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的复合肌肉动作电位(CMAP)，以潜伏期/秒表示。

图16示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的感觉神经传导速度(SNCV)，以米/秒表示。

图17所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的纤维直径，以微米表示。

图18所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的轴突直径，以微米表示。

图19所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的髓鞘质厚度，以微米表示。

图20所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的变性纤维百分比。

图21所示为接受皮下给药的动物中A组实验性动物的有髓鞘纤维百分比。

图22所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物体重的进展情况。

图23所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物诱导糖尿病10天和40天后的血糖值。

图24所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物置于热源时甩尾所用的时间。

图25所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的跨越方块的数目(A)和后脚站立次数(B)。

图26为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的复合肌肉动作电位(CMAP)，以潜伏期/秒表示。

图27示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的感觉神经传导速度(SNCV)，以米/秒表示。

图28所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的纤维直径，以微米表示。

图29所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的轴突直径，以微米表示。

图30所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的髓鞘质厚度，以微米表示。

图31所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的变性纤维百分比。

图32所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的有髓鞘纤维百分比。

图33所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物体重的进展情况。

图34所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物诱导糖尿病10天和40天后的血糖值。

图35所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物置于热源时甩尾所用的时间。

图36所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物的跨越方块的数目(A)和后脚站立次数(B)。

图37为接受皮下给药的动物中C组实验性动物的复合肌肉动作电位(CMAP)，以潜伏期/秒表示。

图38示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物的感觉神经传导速度(SNCV)，以米/秒表示。

图39所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物的纤维直径，以微米表示。

图40所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物的轴突直径，以微米表示。

图41所示为接受皮下给药的动物中C组实验性动物的髓鞘质厚度，以微米表示。

图42所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的变性纤维百分比。

图43所示为接受皮下给药的动物中B组实验性动物的有髓鞘纤维百分比。

具体实施方式

本发明基于给予通过gp130传导信号的物质对已建立的糖尿病性神经病变的动物模型产生了明显的抗伤害和神经再生作用的发现。所以，本发明涉及通过人白介素-6(IL-6)受体gp130启动信号传导的物质在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

本文所述的“通过gp130传导信号的物质”是通过gp130激活信号传导级联的任何分子，即IL-6受体复合物的gp130部分的任何激动剂、刺激剂或激活剂。刺激可以是直接的，即激活可以通过直接结合gp130来引发。这样一种直接激活剂的例子是IL-6R/IL-6嵌合物。刺激也可以是间接的，与另一种细胞表面受体结合，该细胞表面受体与gp130形成复合物，从而使其激活。gp130的这样一种间接激活剂的例子是IL-6。通过gp130传导信号的物质的其他例子包括IL-11、LIF、制癌蛋白M(OSM)、CNTF(睫状神经营养因子)和心脏营养因子(CT-1)，它们统称“IL-6型细胞因子”。这些细胞因子引发JAK/STAT通道，其中第一件事是配体诱导的信号转导受体亚基同或异二聚化。全部IL-6型细胞因子都能使gp130募集到它们的受体复合物。它们或者通过gp130单独的或者与LIFR或OSRM(它们都能激活JAK，并募集STAT蛋白)联合传导信号。IL-6诱导gp130同二聚化，而CNTF、LIF和CT-1通过gp130与LIFR异二聚化来传导信号。

本发明所用的术语“治疗”和“预防”，指预防、抑制、减缓、改善或扭转糖尿病性神经病变的一种或多种症状，以及伴随糖尿病性神经病变的症状、疾病或并发症。“治疗”糖尿病性神经病变是在发病后给予本发明的物质，“预防”指在看到患者出现任何发病迹象之前给予本发明的物质。预防性给予特别适用于高风险患者，如那些长期患有糖尿病的患者。

术语“糖尿病性神经病变”指任何形式的糖尿病性神经病变，或者伴随糖尿病性神经病变或影响神经的糖尿病并发症，或者由糖尿病性神经病变或影响神经的糖尿病并发症引起的一种或多种症状或疾病，详述见前面的背景技术介绍。

在本发明的一优选实施例中，糖尿病性神经病变是多发性神经病变。糖尿病性神经病变同时影响很多神经。

在另一优选实施例中，糖尿病性神经病变是单一神经病变。局灶性单一神经病变影响一根神经，例如动眼或外展颅神经。当影响不同区域的两或多根神经时，该疾病称为多发性单一神经病变。

优选的物质是：

a)IL-6；

b)a)的与gp80结合，并启动通过gp130传导信号的片段；

c)a)或b)的与a)或b)具有至少70％序列同一性，并启动通过gp130传导信号的变体；

d)a)或b)的被一DNA序列编码并启动通过gp130传导信号的变体，所述DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的天然DNA序列的互补序列杂交；或者

e)a)、b)、c)或d)的启动通过gp130传导信号的盐、融合蛋白或功能性衍生物。

本发明高度优选使用IL-6本身。IL-6可以是天然IL-6，即从天然来源分离出来的IL-6，或者是重组产生的IL-6。IL-6是本发明特别优选的。

在本发明另一优选实施例中，该物质是：

a)IL-6R/IL-6嵌合物；

b)a)的启动通过gp130传导信号的片段；

d)a)或b)的被一DNA序列编码并启动通过gp130传导信号的变体，所述DNA序列在中等严谨条件下与编码a)或b)的DNA序列的互补序列杂交；或者

本文术语“IL-6R/IL-6嵌合物”(也称“IL-6R/IL-6”或“IL-6嵌合物”)是一种嵌合分子，它含有与白介素-6的全部或具有生物活性的一部分融合的gp130的可溶性部分。嵌合蛋白的分子部分可直接与另一部分融合，或者它们可通过任何合适的接头(例如二硫键桥或多肽接头)连接。接头可以是短接头肽，长度可短至1-3个氨基酸残基或较长，如长13或18个氨基酸残基。例如，所述接头可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽，或含有13个氨基酸的接头序列，其包含导入在可溶性IL-6受体gp130序列和IL-6序列之间的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。IL-6R/IL-6嵌合物的例子已为本领域所知，在WO 99/02552或WO 97/32891中有详细描述。在图2中示意表示的是本发明可用的IL-6R/IL-6嵌合分子的例子。

本文所用的术语“IL-6R/IL-6嵌合物”指IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物的类似物，其中IL-6R/IL-6的天然存在的组分中一或多个氨基酸被另外一些氨基酸取代，或者缺失，或在IL-6或IL-6R/IL-6的原始序列中加入了一或多个氨基酸，所得产物的活性与原来的IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物相比无显着的改变。这些变体由已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。

本发明的变体包括在中等严谨或严谨条件下与编码IL-6或IL-6R/IL-6的DNA或RNA进行杂交的DNA或RNA类核酸编码的蛋白。术语“严谨条件”指杂交和随后的洗涤条件，这些条件是本领域普通技术人员常规所指“严谨的”条件。参见上述文献Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

没有限制作用的严谨条件的例子包括以下洗涤条件：例如在比研究计算的杂交温度Tm低12-20℃的温度下用2×SSC和0.5％SDS洗5分钟，用2×SSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃用0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分钟，然后在68℃用0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域普通技术人员知道严谨条件还取决于DNA序列、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合寡核苷酸探针的长度。如果使用的是混合探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。参见上述引用的文献Ausubel。“中等严谨条件”指较低温度、较低盐浓度或较低去污剂浓度的洗涤条件，如42℃用2×SSC/0.1％SDS洗涤(上述引用的Ausubel等，1989)。

任何这样一种变体最好具有IL-6或IL-6R/IL-6氨基酸序列充分复制的氨基酸序列，例如具有与IL-6或IL-6R/IL-6基本上相似的，甚至更好的活性。

IL-6的特征活性是它结合IL-6受体的gp80部分的能力，而IL-6R/IL-6嵌合物的特征活性是它结合gp130的能力。测定IL-6R/IL-6嵌合物与gp130结合的酶联免疫吸附试验(ELISA)在WO 99/02552的第39页实施例7中有详细叙述，纳入WO99/02552的全部内容作为参考。本领域的技术人员懂得，可用类似的ELISA试验测定IL-6与gp80的结合。只要该变体对其gp80或gp130的各结合区具有很大的结合活性，就可认为其具有与IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物基本上相似的活性。因此，可借助常规实验方法来确定任何一个给定的变体是否具有至少与IL-6或IL-6R/IL-6基本相同的活性，方法包括对这样一种变体进行诸如简单的夹心竞争试验(simplesandwich competition assay)来确定它是否能与固定的gp80或gp130结合，如WO99/02552实施例7中所述。

在一优选实施例中，任何这样一种变体与WO 99/02552所包含的成熟IL-6或IL-6R/IL-6嵌合分子的序列具有至少40％同一性或同源性。更优选具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％同一性或同源性。

同一性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过对这些序列作对比而确定。通常，同一性指两个多核苷酸或两个多肽序列在各自要比较的序列长度中，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。

对于其对应不是完全一样的序列，可以确定“同一性百分比”。通常把待比较的两个序列进行序列对比，得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“缺口(gap)”以增加对比度。比较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local alignment))可确定同一性百分比，前者特别适合长度相等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列。

两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如，Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)，找出两个序列间最佳的单个相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知，例如BLAST程序家族(Altschul S F等人，1990，Altschul S F等人，1997，登入NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov可查询得到)与FASTA(Pearson W R，1990，Pearson 1988)。

本发明使用的IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物、或其编码核酸的变体包括一套有限的基本对应的序列作为置换肽或核苷酸，根据在此给出的说明和指导，运用该领域普通技术无需过多的试验就可常规获得。

根据本发明，变体的优选变化是所谓的“保守性”取代。IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物的保守性氨基酸取代可包括使用理化性质足够相似以致于组内成员间的取代将保留分子的生物功能的同组内的同义氨基酸(Grantham，1974)。显然，在以上定义出的序列中还可以进行氨基酸的插入和缺失而不改变其功能，特别是这种插入或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或插入所产生的蛋白质和变体也属于本发明范围。

优选同义氨基酸组是表1列出的那些；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些。

表1 优选同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser，Thr，Gly，Asn

Arg Arg，Gln，Lys，Glu，His

Leu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu

Pro Gly，Ala，Thr，Pro

Thr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr

Ala Gly，Thr，Pro，Ala

Val Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val

Gly Ala，Thr，Pro，Ser，Glv

Ile Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile

Phe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe

Tyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr

Cys Ser，Thr，Cys

His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His

Gln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln

Asn Gln，Asp，Ser，Asn

Lys Glu，Gln，His，Arg，Lys

Asp Glu，Asn，Asp

Glu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu

Met Phe，Ile，Val，Leu，Met

Trp Trp

表2 更好的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg His，Lys，Arg

Leu Leu，Ile，Phe，Met

Pro Ala，Pro

Thr Thr

Ala Pro，Ala

Val Val，Met，Ile

Gly Gly

Ile Ile，Met，Phe，Val，Leu

Phe Met，Tyr，Ile，Leu，Phe

Tyr Phe，Tyr

Cys Cys，Ser

His His，Gln，Arg

Gln Glu，Gln，His

Asn Asp，Asn

Lys Lys，Arg

Asp Asp，Asn

Glu Glu，Gln

Met Met，Phe，Ile，Val，Leu

Trp Trp

表3 最好的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu，Ile，Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile，Met，Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys，Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met，Ile，Leu

Trp Met

用于获得本发明所用的IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物的突变蛋白而在蛋白质中进行氨基酸取代的实例，包括下述专利所提供的已知方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691专利中提出的方法，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。

可用于本发明的IL-6特异性变体已有描述(WO 9403492A1)。另外，EP667872B1描述了较野生型IL-6具有更好生物活性的突变体IL-6。除此之外，EP656117B1也描述了IL-6高效激动剂的分离方法。这些突变体或高效激动剂可用于本发明中。

术语“融合蛋白”指一多肽，它包含与另一蛋白质融合的IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物或其变体或片段，例如这个另一蛋白在体液内有更长的滞留时间。这样，IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物可与另一蛋白质、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。

本文使用的“功能性衍生物”，包括IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物衍生物及其变体和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从残基或N端或C端基团上以侧链存在的功能性基团制备。只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物活性基本上相似的蛋白质活性，并且不会使含它的组合物具有毒性，均包括在本发明中。

这些衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，其可遮蔽抗原位并延长IL-6R/IL-6在体液内的滞留时间。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分分子形成的O-酰基衍生物。

本发明的“片段”可以是例如IL-6或IL-6R/IL-6的活性片段。术语片段指分子的任何亚群，它是保留了所希望的生物活性即具有与gp130激动剂活性的较短肽。片段可以很容易制成，方法是去除IL-6或IL-6R/IL-6分子两端的氨基酸，并测试所得片段分别与gp80或gp130的结合性质。同时去除多肽N端或C端一个氨基酸的蛋白酶已为本领域所知，而测定保留了所希望的生物活性的片段仅涉及常规实验。

在本发明中，IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物、其变体和融合蛋白的片段还包括单纯或者联有例如糖或磷酸基之类相关分子或残基的蛋白分子多肽链的任何片段或前体，或者蛋白分子或其糖残基的凝聚物，只要这些片段具有对gp80特别是对gp130的激动剂活性。

本文所用的术语“盐”指IL-6或IL-6R/IL-6分子或其类似物的羧基盐和氨基的酸加成盐。羧基盐可通过本技术领域公知的方法形成，包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及有机碱盐，例如三乙醇胺等胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、普鲁卡因(procaine)等形成的盐。酸加成盐包括例如与盐酸或硫酸为例的无机酸所形成的盐，以及与乙酸或草酸为例的有机酸所形成的盐。当然，任何这样的一种盐必须保留与IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物的生物活性，即具有激活通过gp130的信号传导的能力。

在本发明一优选实施例中，本发明的物质在一或多个位点糖基化。

IL-6R/IL-6嵌合物的糖基化形式已在WO 99/02552(PCT/IL98/00321)中有所描述，这种糖基化形式是本发明高度优选的嵌合物分子。该文献中描述的IL-6R/IL-6嵌合物是一种重组糖蛋白，将天然存在的可溶性IL-6受体δ-Val(Novick等，1990)的完全编码序列与天然存在的成熟IL-6的完全编码序列(二者均来自人)融合而制成。本领域技术人员懂得，糖基化IL-6可通过重组方法即通过在真核表达系统中表达来生产。

本发明的激动剂可在任何充分的真核或原核细胞类型，如酵母细胞、昆虫细胞、细菌等中生产。如WO 99/02552中关于IL-6R/IL-6的描述，较好在哺乳动物细胞，最好在经过基因改造的CHO细胞中生产。而优选使用源自人的蛋白，本领域技术人员懂得，本发明可使用任何其它来源的类似融合蛋白，只要它保留本文所述的生物活性。

在本发明的另一实施例中，本发明的物质非糖基化。较好的情况是，嵌合物分子可在不能合成糖基残基但生产重组蛋白通常有很高得率的细菌细胞中生产。例如，EP 504751B1描述了非糖基化IL-6的生产方法。

在又一实施例中，本发明的物质包含一种免疫球蛋白融合，即本发明的分子与免疫球蛋白的全部或一部分，特别是与免疫球蛋白的Fc片段融合。制作免疫球蛋白融合的方法已为本领域公知，例如WO 01/03737中所描述的方法。本领域技术人员懂得，本发明所得到的融合蛋白保留了IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物的生物活性，即能刺激gp130传导信号。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的滞留期(半衰期)延长，比活性提高，表达水平增加或有利于该融合蛋白的纯化。

本发明的物质最好与Ig分子的恒定区融合。它可融合于重链区，例如，人IgG1的CH2和CH3区。Ig分子的其它同种型也适合用来产生本发明的融合蛋白，例如，同种型IgG2或IgG4，或其它Ig类，如IgM或IgA。融合蛋白可以是单体或多聚体，异或同多聚体。

可将本发明物质的功能性衍生物与聚合物偶联以改进该蛋白质的性能，如稳定性、半衰期、生物利用性、人体耐受性、或免疫原性。

所以，本发明一优选实施例涉及本发明物质的功能性衍生物，其至少包含连接于以氨基酸残基上一个或多个侧链形式存在的一个或多个官能团的一部分。

高度优选的实施例涉及与聚乙二醇(PEG)连接的本发明物质。例如，可按已知方法，如WO 92/13095所述的方法进行聚乙二醇化。

通过gp130传导信号的物质的优选用量约0.1-1000微克/千克，或约1-500微克/千克，或约少于100微克/千克。通过gp130传导信号的物质的更好用量约1微克/千克，或约3微克/千克，或约10微克/千克，或约30微克/千克。

在本发明一优选实施例中，通过gp130传导信号的物质每日给予。在另一优选实施例中，通过gp130传导信号的物质每星期给予3次。在又一优选实施例中，通过gp130传导信号的物质每星期给予1次。

本发明的物质可经任何合适的途径给予。皮下途径是本发明高度优选采用的。

本发明的物质可以任何合适的配剂递送到它的作用位点。优选以表达和/或分泌IL-6、IL-6R/IL-6嵌合物、其变体、融合蛋白或活性片段的细胞形式递送。如下面实施例所示，用合适的表达载体转染到细胞内产生了足够量的表达和/或分泌IL-6R/IL-6嵌合物的细胞。

所以，本发明还涉及一种表达本发明物质的细胞在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。这些细胞可以任何合适的形式给予。然而，递送IL-6R/IL-6嵌合物的高度优选模式是装有表达，最好分泌IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物的细胞的多聚微包囊。微包囊程序已有详细描述，例如Emerich等，(1994)或US5,853,385。合适的细胞系和稳定的表达系统已为本领域公知。

本发明物质的递送也可用含IL-6、IL-6R/IL-6嵌合物、其变体、融合蛋白或活性片段编码序列的载体，如表达载体来进行。该载体含有在人体内，最好在周围神经细胞内表达期望的蛋白所需要的全部调节序列。表达载体的调节序列已为本领域技术人员所知。所以，本发明还涉及含有本发明物质编码序列的载体在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

根据本发明，可使用本领域公知的任何表达载体。不过，高度优选使用病毒衍生基因治疗载体。

本发明的物质最好以药物组合物形式给予人体。药物组合物可含有本发明的多肽，或者表达所述多肽的细胞，或者表达载体，特别是含IL-6、IL-6R/IL-6嵌合物或其变体、融合蛋白或活性片段编码序列的慢病毒基因治疗载体，任选地还含有一或多种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂，用于治疗和/或预防糖尿病性神经病变。

定义“药学上可接受的”指包含不会干扰活性成分的生物活性作用，并对给予的宿主无毒性的任何载体。例如，对于肠胃外给药而言，可将这些活性成分以注射用单位剂量形式配制在赋形剂中，如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液。

活性成分可以以各种途径给予患者。给药途径包括皮内、透皮(如在缓释制剂中)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬脑膜外、局部和鼻内途径。也可采用其他治疗上有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织吸收或基因治疗，基因治疗时将DNA分子给予患者(如通过载体)，导致体内表达和分泌该活性多肽。此外，活性分子可与其他生物活性成分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和运载体一起给予。

对于肠胃外(如静脉内、皮下、肌肉内)给药，可将活性成分与药学上可接受的肠胃外赋形剂(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起配制成溶液、悬浮液、乳剂或冻干粉末。用常规技术将制剂灭菌。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗和/或预防糖尿病性神经病变的方法，该方法包括把有效量的启动通过人gp130受体传导信号的物质，任选地与药学上可接受的运载体一起给予有需要的患者。

“有效量”指足以影响到上述疾病病程和严重程度、导致病情减轻或缓和的有效成分的量。有效量取决于给药途径和患者状况。

以单剂或多剂给予患者的剂量视各种因素而不同，包括药物动力学性质、给药途径、患者情况和特点(性别、年龄、体重、健康和体型)、疾病程度、同时的治疗、治疗频率和要求的效果。已确定剂量范围的调整和控制是技术人员能力中的事。

本发明还考虑一种治疗糖尿病性神经病变的方法，该方法包括把有效量的表达IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物、其变体、融合蛋白或活性片段的细胞给予有需要的患者。本发明另一个目的是一种治疗糖尿病性神经病变的方法，该方法包括把含IL-6或IL-6R/IL-6嵌合物、其变体、融合蛋白或活性片段编码序列的表达载体给予有需要的患者。

在本发明一优选实施例中，表达载体是基因治疗载体。高度优选使用病毒载体，特别是慢病毒载体。

以下，将结合非限制性实施例和所附附图对本发明进行更详细叙述。

现在，对本发明作完整叙述，本领域技术人员懂得，在不偏离本发明的精神和范围下，无需进行过多实验就可在等效参数、浓度和条件的较宽范围内进行本发明。

虽然本发明结合具体实施例作了描述，但应明白可作进一步的改进。本申请旨在覆盖任何变化、应用和适应性变化，它们一般来说遵循本发明原则，是本发明所属领域已知的或可从常规实践中得出的，以及如所附权利要求范围所述适合上述基本特征的未在本发明中公开的内容。本发明的原理和不脱离本文公开的内容都可如本发明权利要求所述的基本特征应用本领域已知的或习惯的方法实施。

本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均整体纳入本文参考文献中，包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。

参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中公开得到、启发或者暗示。

上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，根据本文所述和指引，意味着这样一些改变和/或调整在本发明所公开的实施例相等的范围内。需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所述和提供的指引，并结合本领域普通技术人员所知道的常识作出解释。

实施例1 IL-6和IL-6R/IL-6嵌合物在CHO细胞中的产生IL-6和IL-6R/IL-6嵌合物

编码可溶性IL-6受体(在尿中找到的sIL-6R的天然形式，Oh等，1997)的cDNA序列已经与成熟IL-6的编码序列融合。也存在3个桥连氨基酸(EFM)的序列。在CMV启动子的调控下将该融合蛋白插在一表达载体中，再引入CHO细胞内。已经研究出一种生产方法，制成的重组蛋白用抗IL-6R单克隆抗体以免疫纯化方法来纯化。纯化的IL-6嵌合物已经糖基化，表观分子量为85,000。

图10表示IL-6R/IL-6嵌合物组成的示意图。成熟蛋白含有524个氨基酸。

按照上述方法产生和纯化的蛋白适合用于本发明中。

IL-6

重组人IL-6(r-hIL-6)在经过基因改造的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。该产生方法开始阶段是使来自工作细胞库的细胞生长和扩增，在r-hIL-6分泌进入培养基的条件下继续进行。用特异性抗IL-6单克隆抗体以免疫层析法提纯收集r-hIL-6的培养基。还使用其他纯化步骤，以便获得很高纯度的产物。

r-hIL-6制成含有合适赋形剂的无菌冻干制剂。它有两种不同的量：35微克和350微克，与水重组配制成适合注射用。一小瓶最终配制产品的重组体积通常是0.5毫升水。该产品应在25℃以下储存于它原来的容器内。

r-hIL-6的结构已用快速原子撞击质谱(FAB-MS)、胰蛋白酶作图和氨基酸测序确认。用FAB和电喷雾质谱来确定IL-6中糖分子的组成和结构。残基天冬酰胺-46被确定为N-糖基化位点，而对N联糖类的初步分析显示，优势种类是单唾液酸基岩藻糖基双触角结构(monosialyl fucosyl biantennary structure))和二唾液酸基岩藻糖基双触角结构。而苏氨酸-138或-139被确定为O-糖基化位点。

实施例2 腹腔内给予IL-6后在链脲菌素诱导的糖尿病性神经病变模型中的作用

材料和方法

动物

按照随机分组将6周龄雄性Sprague Dawley大鼠(Janvier，Le Genest-St-Isle，France)分成9个实验组(n＝10)：(a)介质对照组，注射0.02％(重量/体积)生理盐水-BSA无菌溶液；(b)对照组，由注射溶于0.02％生理盐水-BSA无菌溶液中的100微克/千克IL-6的动物组成；(c)链脲菌素(streptozotocin)诱导糖尿病组，由注射0.02％生理盐水-BSA无菌溶液的动物组成；(d)接受5种治疗的链脲菌素诱导糖尿病组，由注射5种剂量1、3、10、30和100微克/毫克IL-6化合物的动物组成；(e)接受参考化合物治疗的链脲菌素诱导糖尿病组，注射10微克/毫克参考化合物4-甲基儿茶酚。

它们按组别在笼子中饲养(每个笼子中2只动物)，并置于温控(21-22℃)、明暗周期交迭(12小时/12小时)的房间内，自由摄食饮水。所有实验均按学院指引进行。

糖尿病的诱导和药理治疗

通过外科手术使左大隐静脉裸露，再注射链脲菌素缓冲液(Sigma，L’Isled’Abeau Chesnes，France)诱导糖尿病，所用剂量是55毫克/千克体重。注射之前才将该药物溶于0.1摩尔/升pH4.5柠檬酸盐缓冲液中。把注射链脲菌素那天定为第0天。

一星期后，在第10天用血糖计(Glucotrend test，Roche，Mannheim，Germany)检测每只动物尾静脉的血糖。把血糖值在260毫克/分升以下的动物排除于研究之外。实验结束时即第40天再测一次血糖。

从第11天至第40天进行腹腔内给药治疗(介质，IL-6和4-甲基儿茶酚)。

实验计划

每天记录体重和生存率。

按下列时间每周进行1次甩尾和肌电图描记(EMG)测试：

7天前：基准线(甩尾和肌电图描记)

第0天：注射链脲菌素诱导糖尿病

第10天：测量血糖

第11天：开始给予化合物治疗(IL-6和4-甲基儿茶酚)

第25天：EMG和甩尾测试

第40天：控制血糖，EMG和甩尾测试，切除坐骨神经

敏感性试验：甩尾测试

将大鼠尾巴置于作为热源的快门控制的灯(Bioseb，Paris，France)下。记下大鼠从热源甩尾之前的潜伏期。感觉改变使甩尾的潜伏期长了。进行两次试验，计算平均值，保留作为特征值。

肌电图描记

用Neuromatic 2000M肌电图描记器(Dantec，Les Ulis，France)记录电生理数据。腹腔内注射60毫克/千克盐酸氯胺酮(Imalgene 500， Mérieux，Lyon，France)麻醉大鼠。用加热灯使正常体温保持在30℃，利用置于尾部表面的接触式温度计(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，France)调节。

刺激坐骨神经后记录腓肠肌内复合肌肉动作电位(CMAP)。在后爪放置一个参考电极和一个活动针式电极。接地针插在大鼠的下背上。坐骨神经用超强度单次0.2毫秒脉冲刺激。记录运动波速度，以毫秒表示。

还记录感觉神经传导速度(SNCV)。按下列方法放置尾部皮肤电极：尾底部插一参考电极，朝尾部尖端方向距离参考针式电极30毫米处放置一阳电极。接地针式电极插在阳电极和参考电极之间。尾神经用12.8mA强度的连续20次脉冲刺激(0.2毫秒)。速度以米/秒表示。

形态计量分析

研究结束时(第40天)进行形态计量分析。通过腹腔内注射100毫克/千克Imalgéne 500^麻醉动物。切除5毫米坐骨神经切片作组织分析。把该组织置于在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的4％戊二醛(Sigma，L’Isle d’Abeau-chesnes，France)溶液中固定一晚，在4℃保存于30％蔗糖中直至使用。把神经样品置于在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的2％四氧化锇(Sigma，L’Isle d’Abeau-chesnes，France)溶液中固定2小时，在连续醇溶液中使其脱水，包埋于环氧树脂Epon内。在3天聚合时间内把包埋的组织置于70℃下。用切片机切成2.5微米的横切片，所述横切片以1％甲苯胺蓝溶液(Sigma，L’Isle d’Abeau-chesnes，France)染色2分钟，脱水，并封固于Eukitt中。每个样品取20块切片用光学显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)检查，随机选取6块切片用半自动数字影像分析软件(Biocom，France)分析。每块切片随机选取两个区域进行研究。计算下列参数：(a)纤维直径，(b)轴突直径，(c)髓鞘质厚度(见下文)。

为了计算每块神经切片含有的纤维总数目，每个样品随机选取3块切片，每块切片分析两处区域。

数据分析

用单因素(one factor)或重复测量的方差分析(ANOVA)以及单因子(one way)ANOVA对数据作全局性分析。当ANOVA检验表示有显着差异时用Dunnett’s检验。不进行事后比较分析(post-hoc analyses)。差异水平设定在p＜0.05。全部结果以平均值±平均值的标准差(s.e.m)表示。

结果

动物体重

如图1所示，本研究注意到各组之间体重的进展有显着差异[f(8，296)＝19.47，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。从第5天至第40天，链脲菌素诱导糖尿病/IL-6治疗的动物体重明显下降(p＜0.05；单因子ANOVA，p＜0.05，对照组与链脲菌素；对照/IL-6(100微克/千克)与链脲菌素；对照与链脲菌素+IL-6以及对照/IL-6(100微克/千克)与链脲菌素+IL-6；Dunnett’s检验)。

以10微克/千克剂量IL-6治疗的糖尿病动物的体重比给予其他剂量IL-6的动物的体重高很多[f(5，185)＝1.16，p＝0.08；重复测量的ANOVA]。

由此可知，在整个研究过程中，链脲菌素诱导糖尿病/IL-6(100微克/千克)治疗的动物体重下降(以开始治疗作为起点)。

血糖

图2a显示对照动物在第10天的血糖值等于100毫克/分升。另一方面，链脲菌素诱导糖尿病的大鼠的血糖浓度大于260毫克/分升，认为它们有糖尿病。

图2b显示链脲菌素诱导糖尿病的大鼠在第40天仍有糖尿病。

敏感性试验：甩尾

各组之间甩尾测试表现的进展有显着差异[f(8，16)＝2.07，p＝0.013；重复测量的ANOVA](图3)。大鼠从热源甩尾之前的潜伏期在糖尿病未经治疗的动物中明显延长(对照/介质与链脲菌素/介质p＜0.001；Dunnett’s检验)。在第25天和第40天，对于用剂量1、3、10和100微克/千克IL-6以及10微克/千克4-甲基儿茶酚治疗的动物，它们的反应时间无增加。事实上，发现这些组之间无显着差异(p＞0.05；Dunnett’s检验)。

电生理数据测定

复合肌肉动作电位(CMAP)的潜伏期

整个研究过程中，各组之间CMAP的潜伏期有显着差异[f(8，16)＝5.901，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。糖尿病未经治疗的大鼠的潜伏期有明显的延长(第25天与第40天：p＜0.001；单因子ANOVA)。这种延长对于已用IL-6治疗的组来说并不重要；特别对于用IL-6(10微克/千克)治疗的一组动物，它们在第25天和第40天与对照/介质组的潜伏期相比无显着差异(图4)。

此外，在第25天，每组IL-6治疗/链脲菌素动物CMAP的潜伏期比介质/CMAP组CMAP的潜伏期短得多(p＝0.001，Dunnett’s检验)。

第40天得到相同的结论。

由此可见，IL-6治疗/链脲菌素动物(10微克/千克)与IL-6治疗的其他4组动物(1、3、10、30和100微克/千克)有显着差异(第25天：p＝0.002，第40天：p＝0.003；单因子ANOVA检验)。用3微克/千克和10微克/千克治疗的动物第25天和第40天的潜伏期都比1、30和100微克/千克IL-6治疗/链脲菌素组短得多(p＜0.05，Dunnett’s检验)。

感觉神经传导速度(SNCV)

整个研究过程中，各组之间SNCV有显着差异[f(8，16)＝5.518，p＜0.001；重复测量的ANOVA](图5)。糖尿病大鼠的SNCV与对照/介质组相比明显降低(第25天和第40天：p＜0.001；单因子ANOVA)。此外，在第25天观察到对照/介质组与10微克/千克IL-6治疗组之间无显着差异(p＝0.426；Dunnett’s检验)，而其余各组之间则有显着差异。在第25天，只有10和30微克/千克治疗组与链脲菌素/介质组之间有显着差异(10微克/千克组与链脲菌素/介质组：p＜0.001；30微克/千克组与链脲菌素组：p＝0.004，Dunnett’s检验)。在第40天，用10微克/千克治疗的动物与链脲菌素/介质治疗的动物相比无任何显着差异，不过，该组的SNCV值比用链脲菌素/IL-6治疗的其他动物高。

由此可见，在整个研究过程中，对照/介质动物因为周围神经结构是正常成熟，故它们的SNCV逐渐增大(Gao等，1995，Malone等，1996)。

形态计量分析

轴突直径

已经发现，各组之间的轴突直径有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)(图6)。与对照大鼠相比，介质/链脲菌素动物的轴突直径明显减小(p＜0.001；Dunnett’s检验)。用IL-6治疗扭转了轴突直径的这种减小(IL-6治疗的大鼠与链脲菌素/介质治疗的动物：p＜0.001；Dunnett’s检验)。此外，对照组与对照/IL-6(100微克/千克)组之间有显着差异(p＜0.001；Dunnett’s检验)。还发现对照/介质组与4-甲基儿茶酚治疗组之间无显着差异(p＝0.657；Dunnett’s检验)。

纤维直径

图7显示9组之间的纤维直径有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)。给予链脲菌素导致纤维直径大大减小(对照/介质与链脲菌素/介质：p＝0.005；Dunnett’s检验)。观察到介质/链脲菌素大鼠与IL-6治疗/链脲菌素大鼠之间有显着差异(p＜0.005；Dunnett’s检验)。用IL-6治疗的动物具有比介质/链脲菌素动物大的纤维直径。此外，还发现对照组与对照/IL-6(100微克/千克)组之间有显着差异(p＜0.001；Dunnett’s检验)。用10微克/千克4-甲基儿茶酚治疗过的动物与对照/介质组相比无显着差异(p＝0.628；Dunnett’s检验)。

髓鞘质厚度

对9组之间的髓鞘质厚度作了比较，结果显示有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)(图8)。介质/链脲菌素动物的髓鞘质厚度比对照/介质动物以及IL-6治疗的动物(3、10、30和100微克/千克)都小很多(p＜0.01；Dunnett’s检验)。由此可见，所有IL-6治疗/链脲菌素动物的髓鞘质厚度远远大于介质/链脲菌素动物。此外，我们还发现对照/介质组与对照/IL-6(100微克/千克)组之间有显着差异(p＜0.001；Dunnett’s检验)。

有髓鞘纤维总数目

如图9所示，各组之间有髓鞘纤维总数目有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)。介质/链脲菌素动物的纤维数目比对照动物少(p＜0.001；Dunnett’s检验)。相反，与介质/链脲菌素动物相比，IL-6治疗/链脲菌素动物有较多的纤维(p＜0.001；Dunnett’s检验)。用4-甲基儿茶酚治疗过的链脲菌素诱导糖尿病动物具有与对照动物相接近的纤维总数目。此外，还发现对照/介质组与对照/IL-6(100微克/千克)组之间无显着差异。

结论

在本研究中，用链脲菌素使动物诱导糖尿病，数天后它们发展为糖尿病，以这些动物作为诱导的神经病变模型。这些动物在诱导后3-4天发展为糖尿病。

糖尿病动物在30天内持续地用不同剂量IL-6(1、3、10、30和100微克/千克)治疗。这种治疗在诱导后第10天开始每日经腹腔内给予，直至用链脲菌素诱导后第40天处死动物。可将这种治疗看成为治愈性治疗，因为在长期高血糖导致第一个分子破坏之前已经给予了IL-6。

本方案显示，用IL-6治疗30天诱导神经保护，免于发生糖尿病性神经病变。甩尾和EMG测试(感觉和运动速度)的行为分析显示，IL-6特别是3和10微克/千克剂量IL-6具有神经保护作用。

低剂量与高浓度都有神经保护作用。实际上，治疗剂量越大，神经保护作用越不明显。此外，最高剂量(100微克/千克)无明显作用，而且似乎对链脲菌素动物的一般行为有毒性作用。与介质对照动物或用低浓度IL-6治疗的链脲菌素动物相比，用100微克/千克IL-6治疗过的对照动物(没有用链脲菌素治疗)显得更兴奋。另外，实验人员不易操作这些动物(100微克/千克IL-6)。在链脲菌素/IL-6(100微克/千克)动物中也观察到相同的结果。然而，这些动物的兴奋程度看起来并太高(可能是因为它们体重下降得较多引致无力)。

神经保护作用集中在感觉纤维和运动纤维(CMAP速度不随IL-6治疗而改变)。

至于形态分析，由全部剂量IL-6治疗所诱导的神经保护都很明显。在链脲菌素/介质动物的纤维中，髓鞘减少，轴突发生改变，最后诱导纤维变性(纤维总数目减少)。

本研究已经证明，IL-6治疗(特别是10微克/千克)能保护髓鞘，并防止轴突变性。

必须注意的是，高剂量IL-6(100微克/千克)诱导产生对健康动物体内纤维的有害作用。事实上，纤维似乎有所损害，虽然纤维数目没有减少，但纤维的护套和总体状况已发生改变。而这种作用在用此高剂量IL-6治疗的糖尿病动物中并无出现(毒性作用主要集中在动物的一般行为上，特征表现为体重大幅下降)。

结论是这样的：用IL-6持续治疗30天后，IL-6诱导出现一种明显的神经保护作用，而且对感觉纤维的作用比运动纤维的明显，这可能是通过对纤维的直接影响起作用以及减少神经退化的炎性过程之故。

实施例3 皮下给予IL-6后在链脲菌素诱导的糖尿病性神经病变模型中的作用

本研究的目的在于评估皮下途径在不同时间给予不同剂量的IL-6在同一个神经病变模型中的作用

动物

研究A

按照随机分组将6周龄雄性Sprague Dawley大鼠(Janvier，Le Genest-St-Isle，France)分成6个实验组：(a)介质对照组(n＝4)，注射0.02％(重量/体积)生理盐水-BSA无菌溶液；(b)链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，注射0.02％生理盐水-BSA无菌溶液；(c)接受4种治疗的链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，由每日接受皮下注射4种不同剂量1、3、10、30微克/千克IL-6化合物的动物组成。

它们按组别在笼子中饲养(每个笼子有2只动物)，并置于温控(21-22℃)、明暗周期交迭(12小时/12小时)的房间内，自由摄食饮水。所有实验均按学院指引进行。

研究B

按照随机分组将6周龄雄性Sprague Dawley大鼠(Janvier，Le Genest-St-Isle，France)分成7个实验组：(a)介质对照组(n＝4)，注射0.02％(重量/体积)生理盐水-BSA无菌溶液；(b)链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，注射0.02％生理盐水-BSA无菌溶液；(c)接受4种治疗的链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，由每星期接受3次皮下注射4种不同剂量1、3、10、30微克/千克IL-6化合物的动物组成；(d)接受1种治疗的链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，由接受腹腔内注射10微克/千克IL-6化合物的动物组成。

研究C

按照随机分组将6周龄雄性Sprague Dawley大鼠(Janvier，Le Genest-St-Isle，France)分成6个实验组：(a)介质对照组(n＝4)，注射0.02％(重量/体积)生理盐水-BSA无菌溶液；(b)链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，注射0.02％生理盐水-BSA无菌溶液；(c)接受4种治疗的链脲菌素诱导糖尿病组(n＝10)，由每星期接受1次皮下注射4种不同剂量1、3、10、30微克/千克IL-6化合物的动物组成。

糖尿病的诱导和药理治疗

从第11天至第40天进行腹膜治疗(介质和IL-6)。

实验计划

每天记录体重和生存率。

按下列时间每周进行1次甩尾和肌电图描记(EMG)测试：

7天前：基准线(甩尾、活动能力和肌电图肌电图描记)

第0天：注射链脲菌素诱导糖尿病

第10天：测量血糖

第11天：开始给予化合物治疗(IL-6)

第24天：甩尾测试

第25天：在开放场地中的活动能力

第26天：EMG测试

第38天：甩尾测试

第39天：在开放场地中的活动能力

第40天：控制血糖，EMG测试，切除坐骨神经

敏感性试验：甩尾测试

在开放场地中的活动能力

把动物置于有机玻璃(80×80×40厘米)开放场地中。把地板分成16个相等的方形。记录每只动物在10分钟内的自发活动能力和后脚站立次数。

肌电图描记

用Neuromatic 2000M肌电图描记器(Dantec，Les Ulis，France)记录电生理数据。腹腔内注射60毫克/千克盐酸氯胺酮(Imalgene 500，Rhne Mérieux，Lyon，France)麻醉大鼠。用加热灯使正常体温保持在30℃，利用置于尾部表面的接触式温度计(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，France)调节。

形态计量分析

研究结束时(第40天)进行形态计量分析。通过腹腔内注射100毫克/千克Imalgéne 500^麻醉动物。切除5毫米坐骨神经切片作组织分析。把该组织置于在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的4％戊二醛(Sigma，L’Isle d’Abeau-chesnes，France)溶液中固定一晚，在4℃保存于30％蔗糖中直至使用。把神经样品置于在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的2％四氧化锇(Sigma，L’Isle d’Abeau-chesnes，France)溶液中固定2小时，在连续醇溶液中使其脱水，包埋于环氧树脂Epon内。在3天聚合时间内把包埋的组织置于70℃下。用切片机切成2.5微米的横切片，所述横切片以1％甲苯胺蓝溶液(Sigma，L’Isle d’Abeau-chesnes，France)染色2分钟，脱水，并封固于Eukitt中。每个样品取20块切片用光学显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)检查，随机选取6块切片用半自动数字影像分析软件(Biocom，France)分析。每块切片随机选取两个区域进行研究。计算下列参数：(a)纤维直径，(b)轴突直径，(c)髓鞘质厚度。

数据分析

用单因素或重复测量的方差分析(ANOVA)以及单因子ANOVA对数据作全局性分析。当ANOVA检验表示有显着差异时用Dunnett’s检验。不进行事后比较分析(post-hoc analyses)。差异水平设定在p＜0.05。全部结果以平均值±平均值的标准差(s.e.m)表示。

结果

研究A

动物体重

如图11所示，本研究注意到各组之间体重的进展有显着差异[f(5，185)＝9.20，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。从第5天至第40天，链脲菌素诱导糖尿病/IL-6治疗的动物体重明显下降(p＜0.05；单因子ANOVA，p＜0.05，对照组与链脲菌素；对照与链脲菌素+IL-6；Dunnett’s检验)。

以10微克/千克剂量IL-6治疗的糖尿病动物的体重比给予其他剂量IL-6的动物的体重高很多[f(4，148)＝2.93，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。

血糖

图12显示对照动物在第10天的血糖值等于120毫克/分升。另一方面，链脲菌素诱导糖尿病的大鼠的血糖浓度大于260毫克/分升，认为它们有糖尿病。

已经发现，链脲菌素诱导糖尿病的大鼠在第41天仍有糖尿病(将链脲菌素/IL-6(10微克/千克)组中编号2的大鼠排除出本研究之外，因为它的血糖值低于260毫克/分升)。

敏感性试验：甩尾

各组之间甩尾测试表现的进展无显着差异[f(5，10)＝1.81，p＝0.072；重复测量的ANOVA](图13)。然而，大鼠从热源甩尾之前的潜伏期在糖尿病未经治疗以及用高剂量IL-6治疗的动物中延长了。在第38天，对于用剂量1和3微克/千克IL-6治疗的动物，它们的反应时间无增加。事实上，发现这些组之间无显着差异(p＞0.05；Dunnett’s检验)。

在开放场地中的活动能力

如图14A和14B所示，在整个研究过程中，各组之间跨越方块数目和后脚站立次数有显着差异[分别为f(5，10)＝5.99，p＜0.001和f(5，10)＝4.22，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。在第25天和第40天，糖尿病有否被治疗，动物的活动能力都降低，特征表现为跨越方块数目和后脚站立次数大幅减少(对照组与链脲菌素/介质组以及对照组与链脲菌素/IL-6组：p＜0.01；Dunnett’s检验)。

由此可见，以1和3微克/千克剂量治疗的动物具有比链脲菌素/介质大鼠更高的活动能力。

电生理数据测定

复合肌肉动作电位(CMAP)的潜伏期

整个研究过程中，各组之间CMAP的潜伏期有显着差异[f(5，10)＝5.71，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。糖尿病未经治疗的大鼠的潜伏期有明显的延长(第26天和第41天，p＜0.01；单因子ANOVA)。此外，这种延长对于已用IL-6治疗的每组动物来说并不重要(图15)。

对于用链脲菌素/IL-6治疗的各组动物，它们在第26天和第41天的CMAP的潜伏期与链脲菌素/介质组相比大大缩短(p＝0.05；Dunnett’s检验)。

感觉神经传导速度(SNCV)

整个研究过程中，各组之间SNCV有显着差异[f(5，10)＝3.78，p＜0.001；重复测量的ANOVA](图16)。糖尿病大鼠的SNCV与对照/介质组相比明显降低(第26天和第41天：p＜0.01；单因子ANOVA)。

在第26天和第41天，所有用IL-6治疗的动物与链脲菌素/介质组之间有显着差异(p＜0.05；Dunnett’s检验)。此外，在第41天，发现对照/介质组与3和30微克/千克IL-6治疗的组之间无显着差异(分别为p＝0.054和p＝0.184；Dunnett’s检验)，而其余所有组之间有显着差异。

形态计量分析

纤维直径

如图17所示，各组之间的纤维直径有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)。观察到糖尿病大鼠的纤维直径比对照/介质组小(p＜0.001；Dunnett’s检验)。此外，全部测试剂量IL-6的治疗都能显着地防止该直径减小(链脲菌素/介质组与链脲菌素/IL-6治疗组：p＜0.05；Dunnett’s检验)。

轴突直径

各组之间的轴突直径有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)(图18)。链脲菌素/介质组的轴突直径明显减小(对照/介质与链脲菌素/介质：p＜0.001；Dunnett’s检验)。用全部剂量IL-6治疗的动物的轴突直径远远大于糖尿病未经治疗的大鼠(p＜0.05；Dunnett’s检验)。

髓鞘质厚度

各组之间的髓鞘质厚度有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)(图19)。糖尿病大鼠的髓鞘质厚度比对照/介质动物小很多(p＜0.01；Dunnett’s检验)。此外，这种减小对用IL-6治疗的组并不重要(p＜0.05；Dunnett’s检验)。

变性纤维百分比

如图20和21所示，糖尿病大鼠和未经治疗的大鼠的有髓鞘纤维数目明显减少(p＜0.001；单因子ANOVA)。与链脲菌素/介质动物相比，每日以3、10和30微克/千克剂量的IL-6治疗，可以使变性纤维百分比显着降低(p＜0.001；Dunnett’s检验)。

研究B

动物体重

各组之间体重的进展有显着差异[f(6，168)＝9.24，p＜0.001；重复测量的ANOVA](图22)。从第5天至第40天，链脲菌素诱导糖尿病的动物体重明显下降(p＜0.05；单因子ANOVA，p＜0.001，对照/介质与链脲菌素；对照/介质与链脲菌素+IL-6治疗组；Dunnett’s检验)。

发现链脲菌素/IL-6治疗组之间的体重从第5天至第40天都无显着差异[f(5，125)＝1.08，p＝0.26；重复测量的ANOVA]。

血糖

如图23所示，在第10天，链脲菌素诱导糖尿病的大鼠的血糖浓度大于260毫克/分升，而对照动物的血糖值约100毫克/分升。

此外，链脲菌素诱导糖尿病的大鼠在第40天仍有糖尿病，事实上它们的血糖大于500毫克/分升。

敏感性试验：甩尾

各组之间甩尾测试表现的进展有显着差异[f(6，12)＝2.13，p＝0.02；重复测量的ANOVA](图24)。在第24天和第38天，糖尿病大鼠和未经治疗的大鼠与对照/介质组以及链脲菌素/IL-6治疗组相比，它们的反应时间明显增加(p＜0.05；Dunnett’s检验)。

另外，在用10和30微克/千克剂量的IL-6治疗的动物中，它们的反应时间增加的幅度较小。

在开放场地中的活动能力

如图25A和25B所示，在整个研究过程中，各组之间跨越方块数目和后脚站立次数有显着差异[分别为f(5，10)＝5.99，p＜0.001和f(5，10)＝4.22，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。在第25天和第40天，糖尿病有否被治疗，动物的活动能力都下降，特征表现为跨越方块数目和后脚站立次数大幅下降(对照组与链脲菌素/介质组以及对照组与链脲菌素/IL-6组，p＜0.05；Dunnett’s检验)。

电生理数据测定

复合肌肉动作电位(CMAP)的潜伏期

如图26所示，整个研究过程中，各组之间CMAP的潜伏期有显着差异[f(6，12)＝3.97，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。在第26天和第40天，糖尿病未经治疗的大鼠以及以低剂量IL-6治疗的动物的潜伏期有明显的延长(p＜0.001；单因子ANOVA)。此外，对照/介质组与链脲菌素/IL-6治疗(10和30微克/千克)组之间无显着差异(p＞0.05；单因子ANOVA)。

感觉神经传导速度(SNCV)

整个研究过程中，各组之间SNCV有显着差异[f(6，12)＝3.38，p＜0.001；重复测量的ANOVA](图17)。从第26天起，糖尿病有否被治疗，大鼠的SNCV都有所降低(第26天：p＜0.001，第41天：p＜0.001；单因子ANOVA)。

在第26天，对照/介质动物与链脲菌素/IL-6治疗动物的SNCV与链脲菌素/介质大鼠相比很大的提高(p＜0.05；Dunnett’s检验)。

在第40天，以高剂量IL-6治疗的大鼠的SNCV值比链脲菌素/介质组更重要性。

形态计量分析

纤维直径

如图28所示，已经发现各组之间的纤维直径有显着差异(p＝0.045；单因子ANOVA)。链脲菌素诱导糖尿病的动物与对照/介质大鼠相比，纤维直径明显减小(p＜0.05；Dunnett’s检验)。每日腹腔内给予IL-6，能显着地防止该纤维直径减小(链脲菌素/介质与链脲菌素/IL-6(腹腔内)治疗：p＝0.026；Dunnett’s检验)。

轴突直径

各组之间的轴突直径有显着差异(p＝0.034；单因子ANOVA)(图29)。观察到链脲菌素诱导糖尿病的动物的轴突直径明显减小(p＜0.05；Dunnett’s检验)。经腹腔内给予10微克/千克IL-6治疗的大鼠与链脲菌素/介质动物之间有显着差异(p＝0.45；Dunnett’s检验)。

髓鞘质厚度

各组之间的髓鞘质厚度有显着差异(p＝0.05；单因子ANOVA)(图30)。链脲菌素诱导糖尿病的动物的髓鞘质厚度小很多(p＜0.05；Dunnett’s检验)。每日以腹腔内给予IL-6治疗能防止髓鞘质厚度减小(链脲菌素/介质与链脲菌素/IL-6(腹腔内)：p＜0.005；Dunnett’s检验)。

变性纤维百分比

如图30和31所示，发现各组之间变性纤维百分比有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)。链脲菌素/介质组的这一百分比明显比对照/介质组高(p＜0.001；Dunnett’s检验)。用IL-6治疗的动物的该百分比大大减少(链脲菌素/介质与链脲菌素/IL-6：p＜0.001；Dunnett’s检验)。

研究C

动物体重

如图33所示，整个研究过程中，观察到各组之间体重的进展有显着差异[f(5，145)＝15.46，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。从第5天至第40天，链脲菌素诱导糖尿病的动物体重明显下降(p＜0.001；单因子ANOVA，p＜0.001，对照/介质组与链脲菌素组；对照/介质组与链脲菌素+IL-6治疗组；Dunnett’s检验)。

此外，以30微克/千克IL-6治疗的动物体重下降比给予其他剂量IL-6的动物的重要性明显低[f(4，104)＝2.17，p＜0.001；重复测量的ANOVA]。

血糖

图34显示对照/介质组动物在第10天和第40天的血糖值都低于120毫克/分升。另一方面，链脲菌素诱导糖尿病的大鼠的血糖浓度大于260毫克/分升，所以认为它们在第10天和第40天有糖尿病。

敏感性试验：甩尾

整个研究过程中，各组之间反应时间有显着差异[f(5，10)＝2.30，p＝0.02；重复测量的ANOVA](图35)。大鼠从热源甩尾之前的潜伏期在链脲菌素/介质动物中有明显的延长(第24天和第38天：p＜0.005；单因子ANOVA)。在第24天，对照/介质和链脲菌素/IL-6(30微克/千克)组之间的反应潜伏期无显着差异(p＝0.31；Dunnett’s检验)。在第38天，用10和30微克/千克IL-6治疗的大鼠的反应时间与对照动物相接近(p＝0.3；Dunnett’s检验)。

在开放场地中的活动能力

整个研究过程中，各组之间跨越方块数目和后脚站立次数有显着差异[分别为f(5，10)＝，p＜和f(5，10)＝2.15，p＝0.028；重复测量的ANOVA](图26A和26B)。

在第25天和第39天，对于链脲菌素诱导糖尿病的动物，无论它们的糖尿病有否被治疗，其活动能力与对照大鼠相比大大降低(p＜0.05；Dunnett’s检验)。这种差异性表现在整个记录期间跨越方块平均数目和后脚站立平均次数。然而，用30微克/千克剂量IL-6治疗的一组动物具有比链脲菌素/介质组更高的活动能力。

电生理数据测定

复合肌肉动作电位(CMAP)的潜伏期

整个研究过程中，各组之间CMAP的潜伏期无显着差异[f(5，10)＝1.33，p＝0.23；重复测量的ANOVA](图27)。不过，在第26天和第40天观察到各组之间有显着差异(p＜0.05；单因子ANOVA)。链脲菌素诱导糖尿病的大鼠具有比对照/介质组更长的潜伏期。此外，这种延长对于用高剂量IL-6治疗的组来说并不重要，事实上，链脲菌素/介质组和链脲菌素/IL-6组之间有显着差异(第26天：链脲菌素/介质组和链脲菌素/IL-6(3、10、30微克/千克)组：p＜0.005，第40天：链脲菌素/介质组和链脲菌素/IL-6(30微克/千克)组：p＜0.005，Dunnett’s检验)。

感觉神经传导速度(SNCV)

如图38所示，整个研究过程中，各组之间SNCV有显着差异[f(5，10)＝2.18，p＝0.025；重复测量的ANOVA]。在链脲菌素诱导糖尿病的动物中发现速度明显减慢(对照/介质组与链脲菌素/介质组以及链脲菌素/IL-6组：p＜0.05；Dunnett’s检验)。另外，用10和30微克/千克IL-6治疗使糖尿病动物的速度损失显得不重要(第26天，链脲菌素/IL-6(10和30微克/千克)与链脲菌素/介质：p＜0.05，Dunnett’s检验)。

形态计量分析

纤维直径

如图39所示，各组之间的纤维直径有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)。链脲菌素诱导糖尿病的动物与对照/介质大鼠相比，纤维直径明显减小(p＜0.005；Dunnett’s检验)。用(全部剂量)IL-6治疗的动物具有比链脲菌素/介质大鼠大得多的纤维直径(p＜0.05；Dunnett’s检验)。

轴突直径

各组之间的轴突直径有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)(图40)。发现链脲菌素诱导糖尿病的动物的轴突直径明显减小(p＜0.01；Dunnett’s检验)。以1、3、10和30微克/千克IL-6治疗的大鼠与链脲菌素/介质动物之间有显着差异(p＜0.05；Dunnett’s检验)。

髓鞘质厚度

发现各组之间的髓鞘质厚度有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)(图41)。链脲菌素诱导糖尿病的动物髓鞘质厚度明显减小(p＜0.001；Dunnett’s检验)。每日皮下给予IL-6进行治疗能防止髓鞘质厚度减小(链脲菌素/介质与链脲菌素/IL-6(1和30微克/千克)：p＜0.005；Dunnett’s检验)。

变性纤维百分比

如图42和43所示，各组之间变性纤维百分比有显着差异(p＜0.001；单因子ANOVA)。链脲菌素/介质组的这一百分比明显比对照/介质组高(p＜0.001；Dunnett’s检验)。在用3、10和30微克/千克IL-6治疗的动物中，该百分比显着减少(p＜0.001；Dunnett’s检验)。

结论

在本研究中，用链脲菌素使动物诱导糖尿病，数天后它们发展为糖尿病，以这些动物作为诱导的神经病变模型。

糖尿病动物在30天内持续地用不同剂量IL-6(1、3、10和30微克/千克)治疗。这种治疗在诱导后第10天开始皮下给予每日(研究A)、每星期3次(研究B)、每星期1次(研究C)，直至用链脲菌素诱导后第40天处死动物。可将这种治疗看成为治愈性治疗，因为在长期高血糖导玫第一个分子破坏之前已经给予了IL-6。

本方案显示，用IL-6治疗30天，无论采用何种给药时间表都能诱导神经保护，免于发生糖尿病性神经病变。甩尾和EMG测试(感觉和运动速度)的行为分析显示，皮下途径给予IL-6具有神经保护作用。

神经保护作用集中在感觉纤维和运动纤维(当动物用IL-6化合物治疗时，CMAP速度没有发生改变)。该化合物能防止髓鞘减少和变性。

与每日腹腔内治疗相比(参见先前在Neurofit进行的研究，2001年8月)，经皮下途径每日给予IL-6似乎与腹腔内给予全部测试剂量IL-6一样有效(见实施例2)。此外，低剂量的特点是每星期给予1次或3次IL-6，不会减弱该化合物的神经保护作用。似乎每星期治疗3次的神经保护作用效果最佳(特别是10和30微克/千克)，对链脲菌素动物的一般行为无任何副作用。

参考文献：

1.Altschul S F et al，J Mol Biol，215，403-410，1990.

2.Altschul S F et al，Nucleic Acids Res.，25：389-3402，1997.

3.Britland ST，Young RT，Sharma AK，and Clarke BF.Diabetes，39，898-908.(1990).

4.Breighton，B and Hayden，MR：S Afr Med J.1981 Feb 21；59(8)：250.

5.Chebath，J.，Fischer，D.，Kumar，A.，Oh，J.W.，Kollet，O.，Lapidot，T.，Fischer，M.，Rose-John，S.，Nagler，A.，Slavin，S.and Revel，M.Eur.Cytokine Netw.1997 8，359-365.

6.Devereux J et al，Nucleic Acids Res，12，387-395，1984.

7.Emerich DF，Cain CK，Greco C，Saydoff JA，Hu ZY，Liu H，Lindner MD Cell Transplant.1997 May-Jun；6(3)：249-66.

8.Emerich，D.F.，Lindner，M.D.，Winn，S.R.，Chen，E.-Y.，Frydel，B.R.，and Kordower，J.H.(1996).J.Neurosci.，16，5168-5181.

9.Emerich DF，Winn SR，Hantraye PM，Peschanski M，Chen EY，Chu Y，McDermott P.Baetge EE，Kordower JH Nature.1997 Mar 27；386(6623)：395-9.

10.Emerich DF，Hammang JP，Baetge EE，Winn SR Exp Neurol.1994 Nov；130(1)：141-50.

11.Fischer M，Goldschmitt J，Peschel C，Brakenhoff JP，Kallen KJ，Wollmer A，GrotzingerJ，Rose-John S.Nat Biotechnol.1997 Feb；15(2)：142-5.

12.Fisher et al.，J.Neuroimmunology 119(2001)1-9.

13.Frei et al.，J.Neuroimmunol.，31：147(1991).

14.Halimi H，Eisenstein M，Oh J，Revel M and Chebath J.Eur.Cytokine Netw.1995，6：135-143.

15.Hirano et al，1986 Nature(London)234-73(1986).

16.Hirano T，Matsuda T and Nakajima K：Stem cells 1994，12：262-277.

17.Hirota H，Kiyama H，Kishimoto T，Taga T J Exp Med.1996 Jun 1；183(6)：2627-34.

18.Ishikawa et al.，1999，Cell Mol Neurobiol.19，587-96.

19.Lin B，Nasir J，Kalchman MA，McDonald H，Zeisler J，Goldberg YP，Hayden MRGenomics.1995 Feb 10；25(3)：707-15.

20.May et al，Proc Nat)Acad Sci USA 83：8957(1986).

21.Mendel，I.，Katz，A.，Kozak，N.，Ben-Nun，A.and Revel，M.Eur.J.Immunol.1998 28，1727-1737.

22.Murakami M，Hibi M，Nakagawa N，Nakagawa T，Yasukawa K，Yamanishi K，Taga T，Kishimoto T Science.1993 Jun 18；260(5115)：1808-10.

23.Novick，D.，Shulman，L.M.，Chen，L.and Revel，M.Cytokine 1992 4，6-11.

24.Novick D，Shulman LM，Chen L and Revel M.Cytokine 1992，4：6-11.

25.Novick D.Engelmann H.Wallach D.Leitner O.Revel M.Rubinstein M.Joumal ofChromatography 1990.510：331-7.

26.Paonessa G，Graziani R，Deserio A，Savino R，Ciapponi L，Lahmm A，Salvati AL.

27.Toniatti C and Ciliberto G.EMBO J.1995：14：1942-1951.

28.Pearson W R，Methods in Enzymology，183，63-99，1990.

29.Pearson W R and Lipman D J，Proc Nat Acad Sci USA，85，2444-2448，1988.

30.Rakieten，N.，Rakieten，M.L.，and Nadkami，M.V.，Studies on the diabetogenic action ofstreptozotocin，Cancer Chmother.Rep.，1963，29，91.

31.Rudas B.Streptozotocin.Azmeimittel-Forschung，22，830-861.(1972).

32.Smith and Waterman J Mol Biol，147，195-197，1981，Advances in Applied Mathematics，2，482-489，1981.

33.Taga，T.，Hibin M.，Hirata，Y.，Yamasaki，K.，Yasukawa，K.，Matsuda，T.，Hirano，T.andKishimoto，T.Cell 1989 58，573-581.

34.Toulmond，S.，Vige，X.，Fage，D.，and Benavides，J.Neurosci Lett 1992，144，49-52.

35.Ward LD，Howlett GJ，Discolo G，Yasukawa K，Hammacher A，Moritz RL and Simpson RJ.High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two moleculeseach of interleukin-6，interleukin-6 receptor and gp130.J.Biol.Chem.1994，269：23286-23289.

36.Yamada，M.，and Hatanaka，H.：Brain Res 1994，643，173-80.

37.Zilberstein et al，EMBO J 5：2529(1986).

Claims

1.通过gp130传导信号的物质在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖尿病性神经病变是多发性神经病变。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖尿病性神经病变是单一性神经病变。

4.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述物质是：

a)IL-6；

b)a)的与gp80结合，并启动通过gp130传导信号的片段；

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述IL-6是重组IL-6。

6.如权利要求1至3中任何一项所述的应用，其特征在于：所述物质是：

a)IL-6R/IL-6嵌合物；

b)a)的启动通过gp130传导信号的片段；

7.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述物质在一或多个位点糖基化。

8.如权利要求1至7中任何一项所述的应用，其特征在于：所述物质是非糖基化的。

9.如权利要求4至8中任何一项所述的应用，其特征在于：所述融合蛋白包含一个免疫球蛋白(Ig)融合。

10.如权利要求4至9中任何一项所述的应用，其特征在于：所述功能性衍生物至少包含连接于以氨基酸残基上一个或多个侧链形式存在的一个或多个官能团的一部分。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述部分是聚乙二醇部分。

12.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述通过gp130传导信号的物质的用量在约0.1至1000微克/千克范围内或约1至500微克/千克范围内或少于100微克/千克。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于：所述通过gp130传导信号的物质的用量约1微克/千克或约3微克/千克或约10微克/千克或约30微克/千克。

14.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述通过gp130传导信号的物质每日给予。

15.如权利要求1至13中任何一项所述的应用，其特征在于：所述通过gp130传导信号的物质每星期给予3次。

16.如权利要求1至13中任何一项所述的应用，其特征在于：所述通过gp130传导信号的物质每星期给予1次。

17.一种能诱导和/或增强细胞中内源性产生IL-6的载体在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

18.一种经基因改造产生权利要求1至9中任何一项所限定的物质的细胞在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

19.一种含有权利要求1至9中任何一项所限定的物质的编码序列的表达载体在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变的药物中的应用。

20.一种糖尿病性神经病变的治疗和/或预防方法，其特征在于：所述方法包括把有效量的权利要求1至9任何一项中所限定的物质，任选地与药学上可接受的运载体一起给予有需要的患者。