CN1533441A - 核酸三链体和四链体形成 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了杂多聚体三链体和四链体及其制备方法；诸如阳离子的加速剂在产生它们上的应用；荧光嵌入剂和荧光探针结合的非嵌入剂在检测它们上的应用。
Description
发明背景
1.发明背景
本发明涉及核酸多链体，更具体而言，涉及把它们生成三链体和四链体的方法，以及在分析中利用它们检测特异核酸的方法。
2.相关技术描述
互补碱基序列的两条单链核酸分子能够相互特异性结合，既为研究又为诊断工具提供了强大的基础。对单链分子与双链靶结合的能力以及双链分子与双链靶结合的能力的探索一直比这种“常规杂交”的探索不完全。与双链靶结合的能力比常规杂交具有潜在的优势。这些优势可部分源自下列事实：双链靶不会变性，使得杂交条件“更温和”，为靶提供较少倾向于成为完全的无规卷曲。它们可部分源自下列事实：碱基配对机制将至少部分不同于常规杂交，使得对于更有利的动力学和在杂交反应混合物中所需探针量的降低具有可能性。
生成多链体的现有技术包括：
1)三链体的形成作为部分同源重组过程，这是一个由细菌蛋白RecA和其他生物中有相似功能的蛋白所介导的过程；
2)在原位杂交过程中3-链结构的生成(例如，Bresser等的美国专利5,707,801)；以及
3)依赖于Hoogstein型键合的3-链或4-链的复合体。
这些现有技术未充分开发形成多链体的潜力。RecA-介导的过程需要蛋白。原位杂交过程是基于下列原理：胞内双链靶会局部打开其双链结构，提供将依据常规杂交原理杂交的单链靶。据报道，依赖于Hoogstein型聚体的复合体受限于不是真正杂聚体的结构。而是它们要求给定的链应为多嘌呤或多嘧啶或与其很接近。参见，例如，Floris等，“阳离子对嘌呤-嘌呤-嘧啶三重螺旋在混合价盐溶液中形成的影响(Effect of cation on purine-purine-pyrimidine triple helix formation inmixed-valence salt solutions)”，260，Eur.J.Biochem.801-809(1988)。
如同与三链体核酸的情形一样，有关四链体核酸的常规知识一直是这种特有的结构仅存在于相对极端条件下，针对相对窄的核酸种类。具体而言，Sen等(Nature 334：364-366(1988))公开了富含鸟嘌呤的寡核苷酸在体外可自发自我装配成四链螺旋。Sen等(Biochemistry 31：65-70(1992))公开了这些四链复合体可进一步结合成由8、12或16寡聚体组成的超结构。
Marsh等(Biochemistry 33：10718-10724(1994)和Nucleic AcidsResearch 23：696-700(1995))公开了一些富含鸟嘌呤寡核苷酸也可以补偿、平行比对的方式组装，形成长的“G-丝”。这些高级结构由G-四联体所稳定，所述G-四联体由四个在平面上排列并通过Hoogsteen碱基配对结合在一起的鸟嘌呤残基组成。根据Sen等(Biochemistry 31：65-70(1992))，寡聚体内至少三个邻近的鸟嘌呤对这些高级结构的形成是至关重要的。
已有提示四链DNA在各种生物过程中发挥作用，如抑制HIV-1整合酶(Mazumder等，Biochemistry 35：13762-13771(1996)，在减数分裂过程中染色体结合的形成(Sen等，Nature 334：364-366(1988))，以及端粒维持(Williamson等，Cell 59：871-880(1989)；Baran等，NucleicAcids Research 25：297-303(1997))。
另已有提示控制富含鸟嘌呤四链体的生产可能是控制这种生物过程的关键。例如，授予Hardin等的美国专利6,017,709提示端粒酶活性可通过抑制鸟嘌呤四联体形成的药物而得以控制。
授予Pitner等的美国专利5,888,739公开了基于G-四联体的四链体可在分析中用于检测核酸。在与互补寡核苷酸杂交后，G-四联体结构解叠或线性化，由此增加供体和受体在不同部分的G-四联体结构之间的距离，导致它们相互作用增加以及从结构发出的信号(例如，荧光)可检测发生变化。
授予Agrawal等的美国专利5,912,332公开了合成寡核苷酸的纯化方法，其中所述合成寡核苷酸特异性与期望的全长寡核苷酸杂交，同时形成多聚体聚合体，如四链体DNA。多聚体聚合体含有待纯化的寡核苷酸，然后利用大小排阻层析技术分离。
尽管有上述进展，但是对四链体核酸的潜力既没有充分地得到理解也没有完全地加以开发。
有关用双链靶进行杂交型试验的问题在于检测它们的方法。荧光染料数十年来一直用于检测和定量核酸。以其最基本的形式，基于荧光强度的分析通常包括：将靶与含荧光团的探针接触，从结合探针中除去任何未结合的探针，以及检测清洗样品中的荧光。在这种基本分析基础上，匀相分析的改进在于其不需要清洗步骤或者提供非液相支持物。
例如，授予Livak等的美国专利5,538,848和授予Maggio的美国专利4,220,450公开了在溶液中利用寡核苷酸探针来基于匀相荧光分析核苷酸序列。然而，这些专利需要利用猝灭剂与支持剂组合，从而区分由杂交探针和未杂交探针所产生的信号。Livak等在其公开方法中还需要利用酶。猝灭剂和酶给方法增添了复杂性和花费。
授予Kidwell的美国专利5,332,659公开了利用含有至少两个荧光团部分的探针检测溶液中核苷酸序列的方法。荧光团的选择必须是当相互之间足够接近时可以电子上相互作用以改变它们波谱的波长依赖性。未杂交探针比与靶序列杂交的探针更具柔性，结果，探针未杂交比探针杂交时，各探针上的两个荧光团部分更可能相互靠近。因此，与游离探针相关的辐射波长的变化可作为样品中游离探针量的指标而加以监控。
授予Wu等的美国专利5,846,729也公开了基于匀相荧光的分析用于检测核酸。
除了前述检测荧光强度的进展以外，一些文献还极力称赞荧光偏振分析的优点。然而，基于偏振分析存在显著的缺陷。偏振的变化程度作为结合的函数是不可预测的，以及对数据的解释以使不一致数据符合理论预计，可能要求比分析方法中所期望的更多努力，尤其是当所述方法务必自动化时。还存在一些限制，来自其运动在荧光偏振分析中得以评估的分子的分子量。
本发明将会看到，在多种重要的实施方案中，为了检测三链体和四链体而利用荧光分子的特性。
所有在此引用的文献以其全文引作参考。
发明简述
产生多链体的方法
在一总的方面，本发明为一种产生核酸多链体的方法，所述方法包括下列步骤：
1)产生含有水、沃森-克里克双链体、足够数目的单链混合碱基序列分子的混合物以形成多链体，所述多链体包括沃森-克里克双链体以及提高多链体形成速率或量的加速剂，所述多链体为三链体或四链体，其中一种或多种所述单链分子加以选择，以致如果在多链体中，它们分别与多链体的其他所有链通过遵守碱基配对法则而相关，所述法则或者是沃森-克里克碱基配对法则或者是匀相结合碱基配对法则；以及
2)将所述混合物温育，以使多链体形成，所述多链体的各条链通过碱基配对法则与多链体的其他所有链相关；
条件是，在多链体内，步骤(1)中加入的沃森-克里克双链体为G-C含量在10％和90％之间的杂多聚体。
在方法的一个特定方面，所产生的多链体为三链体，在步骤(1)中，单链分子的足够数目为1，以及在步骤(2)中，形成三链体。在方法的特定实施方案中，在三链体中，单链分子通过沃森-克里克碱基配对法则与双链体的一条链相关，并且通过同源结合碱基配对法则与双链的第二条链相关。在另一特定的实施方案中，双链体基本上保持其双螺旋结构，以及单链分子位于双螺旋结构的沟中。所有这种三链体也是本发明的方面。
在方法的另一特定方面，所产生的多链体为四链体，在步骤(1)中，沃森-克里克双链体为第一沃森-克里克双链体，以及在步骤(1)中，单链分子的足够数目为2，这些单链分子在第二沃森-克里克双链体中，以及在步骤(2)中，四链体从所述第一和第二双链体中形成。优选地，步骤(1)利用两个已在第二沃森-克里克双链体中的单链分子。
检测三链体的方法
通过加入其中三链体得以检测的附加步骤(3)，产生三链体的方法可为适用于检测三链体的方法。
检测四链体的方法
通过加入其中四链体得以检测的附加步骤(3)，产生四链体的方法可为适用于检测四链体的方法。
三链体
在另一总的方面，本发明为三链体(三链体复合体)，其含有单链探针与双链核酸靶结合，其中所述探针含有杂多聚体核酸或杂聚体核酸类似物，以及所述三链体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
四链体
在另一方面，本发明为四链体的多链体结构，所述四链体包括：
含有第一核碱基序列的第一条链；
含有第二核碱基序列的第二条链，其中所述第二条链与所述第一条链通过沃森-克里克键结合；
含有第三核碱基序列的第三条链；以及
含有第四核碱基序列的第四条链，其中所述第四条链与所述第二条链和所述第三条链通过沃森-克里克键结合。
附图简述
本发明将结合下列附图描述，其中同样的参考号指定同样的元件，以及其中：
图1、2A和2B表示以温度、GC含量以及碱基对匹配程度为函数的荧光强度。
图3、4、5A、5B、5C和5D表示以波长、碱基对匹配程度以及阳离子为函数的荧光强度。
图6A、6B和6C表示以激光发射规程和阳离子为函数的荧光强度。
图7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、9C和10表示以碱基对匹配程度和阳离子为函数的四链体荧光强度。
图11表示在含有乙醇的溶液中以碱基对匹配程度为函数的荧光强度。
图12A、12B、12C和12D表示当阳离子DNA嵌入剂YOYO-1存在时以dsDNA:ssDNA复合体中完全碱基对匹配和不完全碱基对匹配的波长为函数的荧光强度。
发明详述
术语及定义
形成各自核苷酸部分的碱基的单字母代码为：A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶；G：鸟嘌呤；C：胞嘧啶；U：鸟嘧啶。这些字母也用于代表它们各自的核苷酸。
双链体的G-C含量为G-C碱基对的数除以G-C碱基对的数加上A-T(或A-U)的数的和再乘以100，以百分比表示(例如20％)。
加速剂在此理解成一种“增加所述三链体或四链体形成的速率或量”的试剂。速率可由少至两个测定所获得，各测定在不同时间点进行。量是指三链体或四链体所形成的数。
术语“加速剂”与术语“促进剂”交互使用。
术语核酸、三链体、四链体等意指包括能形成类似结构如沃森-克里克双链体的DNA、RNA及其类似物的分子，以及其中形成的三链体和四链体。
“核碱基”指碱基A、U、G、C、T及那些符合沃森-克里克碱基配对法则的类似物。
A、U、G、C和T的类似物是那些符合沃森-克里克碱基配对法则的类似物。
沃森-克里克双链体是2-链分子或分子区段，其中两条链是反平行的，它们的5’→3’方向相反。双链体的总体结构为双螺旋结构。所述链通过氢键和疏水性相互作用而结合在一起。碱基对互补性为：A与T通过两个氢键配对(或者，在RNA的情形下，A与U配对)，而G与C通过三个氢键配对。结果，碱基配对法则是：A与T配对，A与U配对以及G与C配对。
3-链核酸分子不必是三链体，以及3-链分子的区段也不必为三链体。也许与一个以上的其他链结合的链没有位于任何链内的区域中。简单的例子为Y型分子，其中链1和2形成茎，链1和3形成左上枝，而链2形成单链右上枝。
三链体的实例为3-链核酸分子或分子区段，其中一条链(任意命名为链1)按照沃森-克里克碱基配对法则(A-T，A-U和G-C)既与链2又与链3配对。链1和2形成沃森-克里克双链体或接近沃森-克里克双链体的结构。链3位于此双链体的大沟中。这种三链体的一实例由V.B.Zhurkin等，J.Mol.Biol.，(1994)第239卷，第181-200页(尤其参见该参考文献的图2)的详细描述，此论文在此引作参考。作为这种三链体稳定作用的部分，链3通过如下的碱基配对法则与其他两条链键合：
链3上的A既与链1上的A配对又与链2上的T配对；
链3上的G既与链1上的G配对又与链2上的C配对；
链3上的C既与链1上的C配对又与链2上的G配对；以及
链3上的T既与链1上的T配对又与链2上的A配对。
不管考虑Zhurkin模型的哪些变体(C或C+或C’，T或T’)，都满足这些碱基配对法则。
术语“碱基配对法则”是当一个核酸分子与另一核酸分子相互之间特异性结合时，限定这两个核酸分子之间特异性的规则。实例是沃森-克里克碱基配对法则(G-C，和A-T或A-U)和同源结合碱基配对法则(A-A，T-T，G-G，C-C，U-U)。
双链体的“解缩合”定义成双链体的总螺旋重复长度的增加。例如，双链体的B构象具有10个碱基对的总螺旋重复长度；106°的解缩合导致重复长度为13个碱基对。
PNA代表DNA和RNA的聚酰胺类似物(参见例如，授予Nielsen等的美国专利5,539,082)。
本发明的特定实施方案以及替代法
如发明概述章节中所述的发明具有目的特异实施方案和优选实施方案。这些实施方案通过本申请加以描述。然而，为方便起见，其中许多实施方案总结在此章节中。同样，如发明概述章节中所述的发明可以替代方式来形容，表示本发明的一些变化而保留涉及主要发明的实质重叠。本发明的这种替代法也包括在此章节中。
(A)制备多链体的方法
三链体或四链体的形成方法一般描述在发明概述章节，可任选将一种或多种下列特征掺入到所述方法中来进行：
在多链体中，步骤(1)中所加入的沃森-克里克双链体为G-C含量介于25％和75％之间的杂多聚体；
在多链体中，步骤(1)中所加入的沃森-克里克双链体为G-C含量介于10％和90％之间的杂多聚体，以及其中嘌呤-嘧啶二聚体和嘧啶-嘌呤二聚体的组合频率超过25％(二聚体的识别起始于序列的5’端并且每次行进一个碱基，直到抵达3’端；例如，序列5’-AAAGGGT具有一个嘌呤-嘧啶二聚体(GT)以及没有嘧啶-嘌呤二聚体-它们的组合频率等于1/6)；
利用细胞中没有(和病毒中没有)的核酸链和/或双链体进行步骤(1)和/或(2)：
在没有蛋白(如recA或类似功能的蛋白)的帮助下进行步骤(2)；
在步骤(1)；添加水从而以体积计其占到混合物终体积的至少50％(更优选至少80％的终体积，最优选在步骤(1)中水是加入到混合物中的唯一液体)；
在步骤(1)，不添加任何蛋白；
在水溶液的冷冻温度或高于此温度并且不高于85℃(更优选介于5-30℃，最优选介于15-25℃)进行步骤(2)；
在步骤(1)，添加阴离子或更优选阳离子作为加速剂(单价、二价或多价；例如金属阳离子或阳离子型肽)；其中所述阳离子是选自下列成员的至少一种：碱金属阳离子、碱土金属阳离子、过渡金属阳离子、Co(NH3)6 +3、三价亚精胺和四价精胺；
其中所述阳离子为浓度50mM-125mM的Na+；
其中所述阳离子为选自浓度10mM-45mM的Mn+2、浓度10mM-45mM的Mg+2以及浓度20mM的Ni+2；
在步骤(1)中添加嵌入剂作为加速剂(尤其是荧光嵌入剂；优选为双嵌入剂)；
在步骤(1)中所述嵌入剂为选自下列成员的嵌入荧光团：YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁单体、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭吖啶异型二聚体、单叠氮化乙锭、碘化丙锭、SYTO染料、SYBR绿1、SYBR染料、皮可绿(Pico Green)、SYTOX染料以及7-氨基放线菌素D；
在步骤(1)，所述加速剂为非嵌入荧光团(尤其为一种成员，选自生物素、若丹明、Alexa染料、BODIPY染料、生物素结合物、硫醇活性探针、荧光素和衍生物(包括“笼”型探针)、Oregon绿、若丹明绿、QSY染料))以及所述强度与三链体或四链体的形成反相关；
在步骤(1)，所述加速剂束缚于所述第一条链、所述第二条链、所述第三条链以及所述第四条链中的至少一种；
在步骤(1)，添加一种加速剂，其是与沃森-克里克双链体的小沟(或者两个沃森-克里克双链体中的至少一种)结合的嵌入剂；
在步骤(1)，添加在25℃为液体的加速剂(尤其是一种溶于水中的有机液体，如二甲基甲酰胺、乙醇和甘油)；
在步骤(1)，添加一种以上的加速剂；
在步骤(1)，添加有关沃森-克里克双链体的缩合剂或解缩合剂的加速剂；
在步骤(1)，添加A、T、U、C或G的类似物的加速剂；
在步骤(1)，添加选自凝集素和多糖的加速剂；
在步骤(1)和(2)，用pH为约5-约9的缓冲剂处理混合物；
在至少一个C-G-C或G-C-G碱基三联体中的一个胞嘧啶为正电荷的；
在各C-G-C和G-C-G碱基三联体中的一个胞嘧啶为正电荷的；
在步骤(2)，温育时间不超过大约两小时(更优选不超过1小时；以及在任一时间内，优选至少25％，更优选至少50％的可能的多链体已经形成)；
所述至少一种加速剂是小沟核酸结合分子，其以非嵌入方式结合并且以至少103M-1的缔合常数结合；
其中多链体为部分电路。(或者，本发明为包含多链体结构的电路。)
对本领域的普通技术人员来说，上述特定条件也适用于下列制备四链体的方法将是一目了然的。
以其他表达形式，形成四链体的方法包括：
(1)提供杂交介质，所述介质含有第一条链、第二条链、第三条链、第四条链、水、缓冲液以及至少一种加速剂；以及
(2)温育所述杂交介质一段时间，其足以使所述第二条链与所述第四条链杂交从而提供所述多链体结构，其中所述多链体结构包括：
含有第一核碱基序列的第一条链；
含有第二核碱基序列的第二条链，其中所述第二条链与所述第一条链通过沃森-克里克键结合；
含有第三核碱基序列的第三条链；
含有第四核碱基序列的第四条链，其中所述第四条链与所述第二条链和所述第三条链通过沃森-克里克键结合。
在形成四链体方法的特定实施方案中，下列特征单独或组合使用(下列描述利用制备四链体方法的术语，规定了四条单独的链，但它们也适用于将沃森-克里克双链体规定为起始材料中的一种或两种的方法)：
所述第一条链和所述第二条链中的至少一条进一步含有药剂，并且所述第二条链与所述第四条链的杂交将所述药剂放置在所述第三条链、所述第四条链上或者与所述第三条链和所述第四条链中的至少一条结合的另一分子上的靶的有效距离内；
所述药剂选自预定结合临床上相关基因的基因启动子序列的核酸，预定结合临床上相关基因的核酸以及预定结合病原体复制子位点的核酸；
所述第三条链和所述第四条链在所述第一条链和所述第二条链之前提供在所述杂交介质中，以及所述第一条链和所述第二条链在通过与所述杂交介质接触再水合之前以脱水形式提供；
所述第一条链和所述第二条链中的至少一条用非嵌入荧光团进行共价标记，以及所述强度与所述结合亲和力反相关；
至少一种加速剂为嵌入荧光团，以及含有所述多链体结构的检测介质中的荧光强度与所述第二条链对所述第四条链的结合亲和力正相关；
所述第二条链与所述第四条链杂交，其检测为荧光、化学发光、电化学发光或电子信号的变化；
所述信号的强度与所述第二条链和所述第四条链之间的结合亲和力相关；
所述第二条链和所述第四条链的杂交使得与所述第三条链和所述第四条链中的至少一条有关的活性失活。
(B)检测三链体的方法
检测三链体的方法一般描述在发明概述章节中，可任选通过将一种或多种下列特征掺入到所述方法中来进行：
以匀相分析实施所述方法，以便在步骤(3)过程中或之前，将不含部分三链体的单链分子置于器皿或容器中，与含有三链体的分开；
利用检测方法来区分完全碱基配对法则匹配、单碱基错配(或缺失)以及2-碱基错配(或缺失)，区分双链体和三链体中的单链分子(所述方法优选包括用含有已知错配的分子校正该方法)；
利用嵌入剂结合的程度(例如由荧光增加所指示)作为三链体形成的标示；
以此，所述嵌入荧光团所发荧光的波长在嵌合后位移到第二波长处，所述波长和所述第二波长之间的差异表明所述探针和所述靶之间的复合体是否是双链体或三链体以及所述靶是否是DNA或RNA；
探针用非嵌入荧光团共价标记，以及所述强度与所述结合亲和力反相关(尤其其中所述非嵌入荧光团选自生物素、若丹明和荧光素)；
利用荧光团标记的单链分子作为单链分子；
方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列(即在双链体中)或所述探针(即单链分子)上提供信号猝灭剂，和/或无需事先将所述靶序列变性和/或无需将所述靶序列进行PCR扩增；
所述方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针上提供信号猝灭剂；
探针具有部分带电荷或未带电荷的主链；
探针包含PNA序列和/或是由平行合成制备的ssPNA；
探针和所述靶序列是同样长度；
探针的长度为5-30个核苷酸；
荧光激发辐射是从氩离子激光器以波长约200nm到约1000nm发射出的；
测试样品的体积为约20μl，含有约10飞摩尔(fmol)的靶序列和约10飞摩尔的探针；
所述样品中靶序列的浓度不超过5×10-10M；
样品中探针的浓度不超过5×10-10M；
方法在生物芯片上进行；
将嵌入荧光团以不含所述探针和不含所述靶序列的形式加入到介质中；
嵌入荧光团选自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2和吖啶。
在其他表达方面，本发明为检测方法，其包括：
提供靶双链核酸或含有靶序列的核酸类似物，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基以及至少一个嘧啶碱基；
提供含有核酸序列或核酸类似物序列的探针；
提供加速剂；
向介质中加入所述探针、所述靶序列和所述加速剂以提供含有三链体复合体的测试样品，所述复合体含有结合到所述靶序列上的所述探针，其中所述复合体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C；
用激发辐射照射所述测试样品以使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和力相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度。
在另一其他表达的相关方面，所述方法包括：
提供靶核酸或含有靶序列的核酸类似物，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基以及至少一个嘧啶碱基；
提供含有核酸序列或核酸类似物序列的双链探针；
提供杂交加速剂；
向介质中加入所述探针、所述靶和所述杂交加速剂以提供含有沃森-克里克三链体的测试样品，所述三链体含有结合到所述靶序列上的所述探针；
用激发辐射照射所述测试样品以使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和力相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度；
其中所述方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针上提供信号猝灭剂。
(C)检测四链体的方法
检测四链体的方法一般描述在发明概述章节中，可任选通过将一种或多种下列特征掺入到所述方法中来进行：
以匀相分析实施所述方法，以便在步骤(3)过程中或之前，将不含部分四链体的核酸分子置于器皿或容器中，与含有四链体的核酸分子分开；
方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针(即第二沃森-克里克双链体)上提供信号猝灭剂，和/或无需事先将所述靶序列变性和/或无需将所述靶序列进行PCR扩增；
利用检测方法来区分完全碱基配对法则匹配、单碱基错配(或缺失)以及2-碱基错配(或缺失)，区分第一和第二沃森-克里克双链体(优选采用含有已知错配的分子校正所述方法)；
利用嵌入剂结合的程度作为四链体形成的标志(尤其通过利用荧光嵌入剂和利用荧光增加作为指示剂)；
将嵌入荧光团以不含所述探针和不含所述靶序列的形式加入到介质中；
嵌入荧光团选自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2和吖啶；
所述嵌入荧光团所发荧光的波长在嵌合后位移到第二波长处，所述波长和所述第二波长之间的差异表明所述探针和所述靶之间的复合体是否是双链体或三链体以及所述靶是否是DNA或RNA；
探针用非嵌入荧光团共价标记，以及所述强度与所述结合亲和力反相关(尤其其中所述非嵌入荧光团选自生物素、若丹明和荧光素)；
利用荧光团标记的单链分子作为部分第二沃森-克里克双链体；
方法进一步含有对结合亲和力进行定量；
探针具有部分带电荷或未带电的主链；
探针包含PNA序列和/或是由平行合成制备的ssPNA；
探针和所述靶序列是同样长度；
探针的长度为5-30个核苷酸(碱基对)；
荧光激发辐射是从氩离子激光器以波长约200nm到约1000nm发射出的；
测试样品的体积为约20μl，含有约10飞摩尔的靶序列和约10飞摩尔的探针；
所述样品中靶序列的浓度不超过5×10-10M；
样品中探针的浓度不超过5×10-10M；
所述第一条链和所述第二条链与所述第三条链和所述第四条链的比为约10∶1；
所述第一条链、所述第二条链、所述第三条链和所述第四条链的浓度分别不超过5×10-10M；
方法在生物芯片上进行。
在其他表达的相关方面，所述方法包括：
提供靶核酸或含有靶序列的核酸类似物，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基以及至少一个嘧啶碱基；
提供含有核酸序列或核酸类似物序列的双链探针；
提供杂交加速剂；
向介质中加入所述探针、所述靶和所述杂交加速剂以提供含有沃森-克里克四链体的测试样品，所述四链体含有结合到所述靶序列上的所述探针；
用激发辐射照射所述测试样品以使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和力相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度；
其中所述方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针上提供信号猝灭剂。
(D)三链体
三链体一般描述在发明概述章节中，可任选具有一种或多种下列特征：
各条链为G-C含量介于25％-75％之间的杂多聚体；
各条链为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体，以及其中嘌呤-嘧啶二聚体和嘧啶-嘌呤二聚体的组合频率超过25％；
其不在细胞中(以及不在病毒中)；
其在pH大于7.6(但小于pH9)时稳定；
其在pH大于7.6(以及优选小于pH9)的介质中；
单链核酸或核酸类似物的长度为5-30个碱基，以及双链核酸靶的长度为8-3.3×109个碱基对；
靶序列为杂多聚体，并以任何顺序含有25％-75％的嘌呤碱基以及75％-25％的嘧啶碱基(优选其中嘌呤-嘧啶二聚体的频率加上嘧啶-嘌呤二聚体的频率超过25％)；
探针(即单链分子)与双链核酸切割剂共价结合；
探针与化疗剂共价结合；
探针与标记共价结合(例如多分子信号复合体、氧还对、化学发光剂、电化学发光剂，或在优选实施方案中为荧光团，在复合体的荧光强度与探针和靶序列之间的结合亲和力相关的情形下尤其如此)；
单链核酸分子的碱基配对法则涉及双链体的一条链，为沃森-克里克碱基配对法则G-C和A-T或A-U，以及涉及双链体的另一条链为A-A和T-T或U-U；
双链体基本上维持其沃森-克里克双螺旋结构，以及单链分子位于双螺旋的沟中；
加速剂在部分双链体和部分单链核酸分子之间形成键；
加速剂共价连接到单链核酸分子上；
沃森-克里克双链体的两条链为DNA(特别是其中三链体的所有链为DNA)；
加速剂与沃森-克里克双链体中的碱基结合，所述碱基不是一种与单链核酸分子中的碱基结合的碱基；
加速剂与沃森-克里克双链体中的碱基结合，所述碱基为一种三链体中的碱基；
加速剂与沃森-克里克双链体的磷酸骨架结合；
加速剂与沃森-克里克双链体上的一种以上的位点、碱基上的各位点或所述双链体的磷酸骨架上的位置结合；
加速剂与沃森-克里克双链体上的一个位点、碱基或所述双链体磷酸骨架上的所述位点结合；
加速剂与沃森-克里克双链体中的碱基结合以及与单链核酸分子中的碱基结合；
加速剂与单链核酸分子中的碱基结合。
(E)四链体
四链体一般描述在发明概述章节中，可任选具有一种或多种下列特征：
所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体；
第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合；
第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合；
第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四条链之间根据同源碱基配对法则结合，以及第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三条链之间根据同源碱基配对法则结合；
第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合；
第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合；
第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合，以及第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合；
第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合；
第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合；
第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合，以及第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三条链之间根据沃森-克里克碱基配对法则结合；
第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合；
第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合；
第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四条链之间根据同源碱基配对法则结合，以及第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三条链之间根据同源碱基配对法则结合；
所述第一条链的各个互作碱基既与所述第三条链上的相邻碱基又与所述第四条链上的碱基特异性相互作用，所述第四条链上的碱基是与所述第三条链碱基结合的碱基；
所述第二条链的各个互作碱基既与所述第四条链上的相邻碱基又与所述第三条链上的碱基特异性相互作用，所述第三条链上的碱基是与所述第四条链碱基结合的碱基；
其是分离、纯化、人工或合成的四链体；
各条链为G-C含量介于25％-75％之间的杂多聚体；
各条链为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体，以及其中嘌呤-嘧啶二聚体和嘧啶-嘌呤二聚体的组合频率超过25％；
其不在细胞中(以及不在病毒中)；
所述链各自独立地包括杂聚体核酸或杂多聚体核酸类似物；
所述链各自独立地包括DNA或RNA；
所述链各自独立地包括含有未带电荷或部分带电荷的主链的杂多聚体核酸类似物；
所述第二条链或所述第四条链之一包括DNA，而所述第二条链或所述第四条链的另一条包括RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA；
所述第二条链和所述第四条链相互平行同源；
将所述第一条链和所述第二条链的大沟置于所述第三条链和第四条链的小沟中；
所述第二条链和所述第四条链相互平行互补；
将所述第一条链和所述第二条链的大沟置于所述第三条链和第四条链的小沟中；
各个核碱基与不超过其他两个核碱基结合；
没有链与另一条链相邻；
多链体结构基本上不含有Hoogsteen键合；
多链体结构基本上不含有G-G四联体；
第一条链和所述第二条链的长度为5-50个碱基对；
第三条链和所述第四条链为基因组DNA；
第三条链和所述第四条链包括基因组DNA中的单元型；
第三条链和第四条链为PCR扩增产品；
其中所述多链体结构不含有固相支持物；
多链体结构与固相支持物结合(其中固相支持物或是导电性的或不是导电性的)；
其中多链体结构进一步包括与所述第一条链、所述第二条链、所述第三条链和所述第四条链中的至少一条结合治疗剂、预防剂或诊断剂；
其中第一条链和所述第二条链的长度各为5-30个碱基，以及所述第三条链和所述第四条链的长度各为8-3.3×109个碱基对；
其中第四条序列以任何顺序含有25％-75％的嘌呤碱基和75％-25％的嘧啶碱基(优选其中嘌呤-嘧啶二聚体的频率加上嘧啶-嘌呤二聚体的频率超过25％)；
第一和第二沃森-克里克双链体(参见发明概述章节中的四链体的制备方法)分别具有介于30-70％的G-C含量；
第一沃森-克里克双链体中的两条链为DNA(特别是其中四链体的所有链为DNA)；
加速剂与第一沃森-克里克双链体中的碱基结合，所述碱基为一种与第二双链体中的碱基结合的碱基；
加速剂与第一或第二沃森-克里克双链体中的碱基结合，所述碱基不是部分四链体；
加速剂与第一或第二沃森-克里克双链体中的磷酸骨架结合；
加速剂与第一或第二沃森-克里克双链体上的一个以上的位点、碱基或磷酸骨架上的各个位点结合；
加速剂与沃森-克里克双链体上的一个位点、碱基或磷酸骨架上的所述位点结合；
加速剂与第一沃森-克里克双链体中的碱基结合以及与第二沃森-克里克双链体中的碱基结合；
加速剂与第一和/或第二沃森-克里克双链体的小沟结合；
加速剂在部分第一沃森-克里克双链体和部分第二沃森-克里克双链体之间形成键。
发明的其他方面
本发明提供三链体复合体，其包括与双链核酸靶结合的单链探针，其中所述探针含有杂多聚体核酸或杂多聚体核酸类似物，以及所述复合体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
与现有技术公开的某些Hoogsteen三链体不同，本发明的三链体在pH值高于7.6时仍是稳定的。此外，本发明三链体不需要如某些现有技术三链体中存在的同型嘧啶序列或同型嘌呤序列。例如，靶序列可以任何顺序含有25％-75％的嘌呤碱基和75％-25％的嘧啶碱基。
优选地，三链体的单链核酸或核酸类似物的长度为5-30个碱基以及双链核酸靶的长度为8-3.3×109个碱基对。
根据本发明的三链体形成适用于各种应用。例如，与双链核酸切割剂共价结合的探针可用于特异性切割双链核酸的靶序列。与化疗剂共价结合的探针可用于特异性处理双链核酸的靶序列。
在优选的实施方案中，本发明提供快速、灵敏、环保和安全的方法，用于分析双链靶和单链探针之间的结合，其中靶包括核酸序列或核酸类似物序列以及探针包括核酸序列或核酸类似物序列。
与某些现有技术分析不同，本发明不仅检测特异探针-靶结合的存在，而且提供有关探针和靶之间相互作用本质的定性和定量信息。因此，本发明使操作者能够区分在探针和双链靶的链中的碱基序列之间出现的完全匹配、一个碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、一个碱基对缺失、两个碱基对缺失和三个碱基对缺失。
本发明的实施方案包括根据其他探针与相同靶结合后所显示的同样类型的信号来校正第一探针-靶混合物的测定信号(例如荧光强度)，其中其他探针各自与第一探针有至少一个碱基的区分。
形成校正曲线，其中测定信号(例如荧光强度)的大小是靶和探针之间结合亲和力的函数。由于靶和多个不同探针之间的结合亲和力随着错配碱基数、错配的性质(A-G对A-C对T-G对T-C等)、三链体内错配位置等而变化，因此本发明的分析可用于测定靶的序列。
在实施方案中，所测定的信号可以是测试样品中所含荧光团的荧光强度。在这样的实施方案中，探针和靶之间的结合亲和力可以与强度正相关或负相关，这依赖于荧光团是否通过信号猝灭或信号放大对杂交发信号。在选择的条件下，由嵌入剂所产生的荧光强度可以与探针-靶结合亲和力正相关，而在利用非嵌入荧光团共价结合探针的优选实施方案中，强度可以与探针-靶结合亲和力反相关。随着探针和靶之间的匹配程度增加，优选包括0-2个错配和/或缺失的范围内，更优选包括0-3个错配和/或缺失的范围内，非嵌入荧光团的荧光强度降低。
本发明能够定量探针和靶之间的结合亲和力。这种信息对各种用途是有价值的，包括设计具有优化结合特征的反义药物。
与现有技术方法不同，本发明分析优选是匀相的。该分析的进行无需在检测测定信号大小之前从游离探针和靶中分离出探针-靶复合体。该分析也无需凝胶分离步骤，由此使得测试通量大幅提高。定量分析简便而准确。结果，结合分析节省大量时间和花费，并且可容易加以自动化。另外，其还使得结合变量快速确定，这些变量如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列长度以及可能的必要辅助因子。
分析可在例如不可渗透表面或生物芯片上的孔内的溶液中进行。
此外，本发明分析的进行优选无需在靶或探针上提供信号猝灭剂。
尽管本发明人事先已公开了荧光强度分析杂交的优点(参见例如美国专利申请号09/224,505，1998年12月31日提交)，但是根据本发明的分析特异性检测探针和双链靶的三链体，由此排除使靶变性的需要。当核酸(和核酸类似物)探针已知与某些有限种类的靶形成三链体时(参见例如Floris等，同上，Dervan等，同上，Egholm等，365 Nature566(1993)，以及Tomac等，118 J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，令人惊异的是本发明人已经能够特异性分析单链核酸(例如ssDNA和RNA)探针和双链核酸(例如dsDNA)靶之间形成的三链体，其中探针和靶之间的相互作用是基于沃森-克里克碱基配对(至少在A结合T(或U，在RNA的情形下)以及G结合C的意义上)，而非很有限的例如Dervan等的三链体杂交的Hoogsteen模型。在此使用的术语“沃森-克里克三链体”通过将单链探针和双链靶之间的碱基配对的性质限制于A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和/或C-G-C(包括C+-G-C，和/或任何其他碱基的离子化物种)旨在明确这些差异。这些三员组下文表示沃森-克里克碱基三联体，并且所得的结构表示沃森-克里克三链体。
用于本发明分析的适当的探针包括例如ssDNA、RNA、PNA和其他不带电荷或部分带电荷的主链的核酸类似物。优选任意长度为8-20个碱基的探针序列，因为这是原核生物和真核生物中所发现的最小的独特DNA序列的范围。特别优选探针为12-18个碱基，因为这是人基因组中独特序列的最小长度。在实施方案中，5-30个碱基的探针是最优选的。然而，多个较短探针可用来检测其中具有多个非独特靶序列的核苷酸序列，它们结合以独特地识别核苷酸序列。探针长度可加以选择来匹配靶的长度。
本发明人能够特异性分析各种在单链核酸(例如ssDNA、RNA、ssPNA和其他DNA或RNA的类似物)探针和双链核酸(例如dsDNA)靶之间以沃森-克里克碱基对依赖方式形成的三链体，他们已发现了这个意外的进展。本发明人还发现三链体形成和/或稳定由在测样品中含有嵌入剂而得以增强。
本发明人还发现沃森-克里克三链体形成和/或稳定由在测样品中含有阳离子而得以增强。合适的阳离子包括例如，单价阳离子，如Na+(优选浓度为50-125mM)，K+及其他碱金属离子；二价阳离子，如碱土金属离子(例如Mg+2和Ca+2)和二价过渡金属离子(例如Mn+2、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；以及正电荷至少为3的阳离子，如Co(NH3)6 +3，三价亚精胺和四价精胺。Mn+2优选以10-30mM的浓度提供。Mg+2优选以15-20mM的浓度提供。Ni+2优选以约20mM的浓度提供。在实施方案中，Mg+2和Mn+2组合各自分别以10mM、15mM或20mM(即各为10-20mM)的浓度提供。
阳离子向形成三链体的介质中所加入的量依赖于许多因素，包括阳离子的性质、探针浓度、靶浓度、其他阳离子的存在以及探针和靶的碱基含量。优选的阳离子浓度和混合物可以通过常规实验而发现。
本发明不要求采用放射性探针，其使用是危险、烦琐和耗时的，并且需要不断地再生。本发明的探针优选使用安全，并且常年稳定。因此，探针可以大量制备或预订和储存。
在实施方案中，探针标记有多分子信号复合体或氧化对，或者标记有引发化学发光或电化学发光特性的标记物。
优选地，探针或靶(优选探针)具有与其共价结合的荧光标记。该标记优选地是非嵌入荧光团。在这样的实施方案中，荧光团优选地在任意末端与探针结合。优选的荧光标记包括生物素、若丹明和荧光素，和其它当用激发能照射时发荧光的标记。
选择激发波长(通过常规实验和/或常识)，以对应于在用荧光团的激发最大值，优选地是200-1000nm。优先选择荧光团具有200-1000nm的辐射波长。在优选的实施方案中，氩离子激光器用来照射荧光团，光的波长范围是400-540nm，并在500-750nm的范围内检测荧光辐射。
本发明分析可以在各种温度下进行，如5-85℃。现有技术的某些分析需要提高的温度、增加成本和延迟测定。另一方面，本发明在室温或低于室温(例如低于25℃)下进行。
本发明的可靠性不依赖于所述靶中的鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。因为G-C碱基对形成了三个氢键，而A-T碱基对仅形成了两个氢键，具有更高的G或C含量的靶和探针序列更稳定，具有更高的解链温度。结果，提高杂交探针和靶区域的GC含量在完全匹配的杂合体所含的之上，碱基对错配可以抵销与错配探针相关的结合弱化。当采用嵌入荧光团时，含有每一种可能的探针和靶之间碱基对错配的三链体证实比完全匹配的三链体更不稳定，总是导致荧光强度低于完全互补的杂合体。
本发明分析是极其灵敏的，从而排除了对靶进行PCR扩增的需要。例如，可以分析具有约20微升体积的测试样品，其含有约10fmol的靶和约10fmol的探针。本发明的实施方案是灵敏的，足以测定浓度为5×10-9M、优选不超过5×10-10M的靶。本发明的实施方案是灵敏的，足以利用浓度为5×10-9M、优选不超过5×10-10M的探针。不用说，前面的值并非提示该方法不能检测更高的浓度。
其中形成三链体的介质可以是任何已知适用于保护核苷酸的常规介质。参见例如Sambrook等，“分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Lab Manual)”，第2卷(1989)。例如，液体介质可以包括核苷酸、水、缓冲液和标准的盐浓度。当二价阳离子专门用于促进三链体形成时，螯合剂如EDTA或EGTA不应该包括在反应混合物中。
互补碱基间的特异性结合发生在温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成的变化的各种条件下。这些条件和利用它们的方法的例子是本领域已知的。
与许多Hoogsteen类型的三链体不同，它们在pH值高于约7.6时是不稳定或不存在的，本发明的沃森-克里克三链体在大范围的pH水平下是稳定的，优选从约pH5到约pH9。
优选地，三链体是在约5℃到约25℃的温度下反应约1小时或更少的时间形成的。更长的反应时间是不需要的，但在大多数情况中，温育长达24小时不会对三链体有不利影响。本发明的沃森-克里克三链体的快速结合时间与基于Hoogsteen三链体的分析需要更长的结合时间形成对照。
尽管不需要，但是通过利用除阳离子以外的某些试剂可以促进三链体在溶液中的形成。这些试剂的优选例子包括单链结合蛋白，例如，Rec A蛋白质、T4基因32蛋白质、大肠杆菌单链结合蛋白质、大或小核酸沟结合蛋白质、紫罗碱和嵌入物质如溴化乙锭、放线菌素D、补骨脂内酯和当归根素。这样的促进剂可证明在极端操作条件，例如异常pH水平或极端高温下是有用的。
本发明的分析可以用于例如鉴定折叠的核苷酸序列中可接近的区域、确定杂交复合体中错配碱基对的数目，以及对基因组作图。
本发明人在此有时可以提示沃森-克里克三链体由探针和双链体靶杂交产生。荧光团束缚于探针，在与双链体靶接触后就产生猝灭的荧光辐射，所述双链体靶含有沃森-克里克互补碱基的链，这说明发生了某种结合事件，此时本发明人仍不确信沃森-克里克三链体中发生的事情是否可最好描述成在传统意义上与沃森-克里克双链体形成相关的杂交。当沃森-克里克三链体的形成在此有时可称作杂交事件时，这也仅为了方便起见，对于沃森-克里克三链体的形成如何最好地加以表征，并不意在限制本发明范围。
与上述背景技术章节中所讨论的四链体不同，根据传统的沃森-克里克结合法则，本发明的优选多链体结构含有至少四条结合在一起的核酸。
如本文所用，术语“沃森-克里克键合”意要定义在核酸(和/或核酸类似物)链的相反对之间通过匹配的相对碱基的特异结合。本文有时将沃森-克里克四链体的形成称为杂交事件，对于沃森-克里克四链体的形成如何可以最好地表征，那仅仅为了方便，并不意在限制本发明的范围。
本发明的多链体结构优选四链体。多链体的每条链独立地含有核酸或核酸类似物。适当的核酸包括例如DNA或RNA。优选的核酸类似物含有不带电荷或部分带电荷的主链(即带有电荷的主链，所述电荷与天然DNA主链一样不是阴性的)。
在某些实施方案中，四链体有四条链，其第二和第四条链中的一条含有DNA，而第二和第四条链中的另一条含有RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA。
在某些实施方案中，第二条链和第四条链是相互平行同源的。在这些实施方案中，将第一和第二条链的大沟放置在第三和第四条链的小沟中。
在其它实施方案中，第二和第四条链是相互平行互补的。在这些实施方案中，具有“嵌套互补性”，将第一和第二条链的大沟放置在第三和第四条链的小沟中。
在某些实施方案中，每个核碱基结合到不超过两个其他核碱基上。在其中一些实施方案中，第二条链的碱基特异性结合(通过沃森-克里克法则)到第一条链的匹配碱基，和结合到第四条链的匹配碱基，以及第四条链的碱基特异性结合(通过沃森-克里克法则)到第三条链的匹配碱基，和结合到第二条链的匹配碱基，其中第一和第三条链的碱基结合到不超过一个其它的各个碱基。所以，除了传统的沃森-克里克碱基对以外，这样的实施方案包括下面的沃森-克里克碱基三联体：A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和/或C-G-C(包括C+-G-C，和/或其它离子化的碱基物种)。
在某些实施方案中，相信第一和第三条链的相对碱基除了下列结合以外还相互结合：(a)在第一和第二条链的相对碱基之间的结合；(b)在第三和第四条链的相对碱基之间的结合；和(c)在第二和第四条链的相对碱基之间的结合。
在本发明的多链体结构的某些实施方案中，没有链是与另一条链邻接的。也就是说，存在至少四条独立的链。虽然折叠的构型等(例如发夹转角等)在本发明的范围内，但是单链的折叠部分不使链计数一次以上，接近四条单独链的最小值。
本发明的多链体结构优选地不依赖于Hoogsteen键合或G-G四联体来维持多链体结构，尽管可能存在不显著量的Hoogsteen键合和/或G-G四联体。即，本发明的多链体结构优选基本上无Hoogsteen键合，并且基本上无G-G四联体。
在某些实施方案中，多链体的第一和第二条链长度为5-50个碱基(更优选地长度是5-30个碱基)，以及第三和第四条链长度为8-3.3×109个碱基对。例如，第一和第二条链可以构成双链探针，而第三和第四条链可以构成双链靶，如基因组DNA，其可以含有单元型。
在实施方案中，第三条链和第四条链是PCR扩增产物。
本发明的多链体可以在体外或体内存在于溶液中，存在于固相支持物上。固相支持物可以是电传导(例如电极)或非传导的。
本发明的四链体形成适用于各种用途。例如，共价结合到双链核酸切割剂上的双链探针可以用于特异性切割双链核酸的靶序列。共价结合到化疗剂的双链探针可以用于特异性处理双链核酸的靶序列。所以，本发明包括多链体结构，其进一步包括与第一、第二、第三和第四条链中的至少一条结合的治疗剂、预防剂或诊断剂。
另外，本发明的多链体适用于纳米工程，如用来提供分子水平(即纳米级)上的电路。关于纳米工程与核酸的更多细节可以在授予Sen等的美国专利号5,948,897中找到，文献在此引入参考。
本发明的多链体结构可以通过一种方法来提供，该方法包括：提供含有第一条链、第二条链、第三条链、第四条链、水、缓冲液和促进剂的杂交介质，并且温育杂交介质，温育时间能有效使第二条链与第四条链杂交。
杂交介质可以包括任何已知适用于保护核苷酸的常规介质。参见例如Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第2卷(1989)。例如，介质可以包括核苷酸、水、缓冲液和标准的盐浓度。当二价阳离子专门用于促进四链体形成时，螯合剂如EDTA或EGTA不应该包括在反应混合物中。
互补碱基间的特异性结合发生在温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成的变化的各种条件下。这些条件和利用它们的方法的例子是本领域已知的。
与许多Hoogsteen类型的多链体不同，它们在pH值高于约7.6时是不稳定或不存在的，本发明的沃森-克里克多链体在大范围的pH水平下是稳定的，优选从约pH5到约pH9。
另外，本发明的多链体不需要如某些现有技术的四链体中存在的同型嘧啶序列或同型嘌呤序列。例如，靶序列可以任何顺序含有25％-75％的嘌呤碱基和75％-25％的嘧啶碱基。
优选地，多链体是在约5℃到约25℃的温度下反应约2小时或更少的时间形成的。即使在室温下，温育时间优选少于5分钟。更长的反应时间是不需要的，但在大多数情况中，温育长达24小时不会对四链体产生不利影响。本发明的沃森-克里克四链体的快速结合时间与Hoogsteen四链体的更长的结合时间形成对照。
在杂交介质中的促进剂优选地是嵌入剂或阳离子。嵌入剂可以是例如荧光团，如选自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2和吖啶的成员。
合适的阳离子包括例如，单价阳离子，如Na+(优选浓度为50mM-125mM)、K+和其它碱金属离子；二价阳离子，如碱土金属离子(例如Mg+2和Ca+2)和二价过渡金属离子(例如Mn2+、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；和具有至少三价正电荷的阳离子，如Co(NH3)6 +3，三价亚精胺和四价精胺。Mn+2优选以浓度10mM-45mM提供。Mg+2优选以浓度10mM-45mM提供。Ni+2优选以浓度约20mM提供。在实施方案中，Mg+2和Mn+2组合在一起以浓度各为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM或40mM(即各为10-40mM)提供。
阳离子向形成多链体的介质中的加入量依赖于许多因素，包括阳离子的性质、探针的浓度、靶的浓度、其他阳离子的存在和探针和靶的碱基含量。优选的阳离子浓度和混合物通常可通过实验找到。
虽然不需要，其它促进剂包括例如，单链结合蛋白质如Rec A蛋白质、T4基因32蛋白质、大肠杆菌单链结合蛋白质、大或小核酸沟结合蛋白质、紫罗碱和其它嵌入物质如放线菌素D、补骨脂内酯和当归根素。这样的促进剂可以证明在极端操作条件，例如在异常pH水平或极端高温下是有用的。
本发明还赋予一种方法，其中第二条链与第四条链的杂交使与第三条链和第四条链中的至少一条相关的活性失活。所以，第一条链和第二条链中的至少一条进一步包括药剂，其中第二条链与第四条链的杂交将药剂放置于第三条链、第四条链或与第三条链和第四条链中的至少一条相关的另一种分子上的靶的有效距离内。药剂优先选自预定与临床相关基因的启动子序列结合的核酸、预定与临床相关基因结合的核酸或预定与病原体的复制子的位点结合的核酸。
在优选的实施方案中，本发明提供了快速、灵敏、环保和安全的方法，用于测定单链或双链靶和双链探针之间的结合，其中所述靶包括核酸序列或核酸类似物序列，以及所述探针包括核酸序列或核酸类似物序列。
本发明的分析可以用于例如鉴定折叠的核苷酸序列中可接近的区域、确定杂交复合体中错配碱基对的数目，以及对基因组作图。
本发明不仅检测特异性探针-靶结合的存在，而且提供关于探针和靶之间相互作用性质的定性和定量信息。所以，本发明使专业人员能够区别完全匹配、一个碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、一个碱基对缺失、两个碱基对缺失和三个碱基对缺失，这些错配和缺失是在双链探针中的序列和在双链靶中的序列之间发生的。
本发明的实施方案包括根据与相同的靶结合的其它探针所显示的相同类型的信号来校正第一探针-靶混合物的测定信号(例如荧光、化学发光、电化学发光或电特性)，其中其它各个探针与第一探针至少有一个碱基的不同。
可以产生校正曲线，其中测量信号大小(例如荧光强度)是靶和探针之间结合亲和力的函数。当靶和多个不同探针之间的结合亲和力随着错配碱基的数目、错配的性质(A-G对A-C对T-G对T-C等)、四链体内错配的位置等而变化时，本发明的分析可以用于对靶进行测序。
在实施方案中，测量的信号可以是测试样品中所含荧光团的荧光辐射强度。在这样的实施方案中，根据荧光团是否通过信号猝灭或信号放大对杂交发出信号，在探针和靶之间的结合亲和力可以与辐射强度正相关或负相关。在选定的条件下，由嵌入剂所产生的荧光辐射强度可以与探针-靶结合亲和力正相关，然而优选实施方案采用与探针共价结合的非嵌入荧光团，其辐射强度可以与探针-靶结合亲和力负相关。优选在包括0-2个错配和/或缺失的范围内，更优选在包括0-3个错配和/或缺失的范围内，随着探针和靶之间错配程度的提高，非嵌入荧光团的荧光辐射强度下降。
本发明能够定量测定探针和靶之间的结合亲和力。这样的信息在各种用途中有价值，包括设计具有最佳结合特性的反义药物。
本发明的分析优选是匀相的。在检测测量信号的大小之前，无需从游离探针和游离靶中分离出探针-靶复合体就可以进行分析。分析不需要凝胶分离步骤，从而允许测试通量大幅增加。定量分析是简单而准确的。结果，结合分析节省了许多时间和费用，并可以容易地自动化。另外，它能使结合变量如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列的长度、探针序列的长度和可能的必要辅助因子(即促进剂)得以快速地确定。
分析可以在例如不可渗透的表面或在生物芯片上的孔或微型通道内的溶液中进行。在某些实施方案中，在第一和第二条链之前将第三和第四条链提供在杂交介质中，而第一和第二条链在通过与杂交介质接触再水合之前以去水合形式提供。
另外，本发明的分析优选地是无需在靶或探针上提供信号猝灭剂而进行的。
虽然本发明人已经在前面公开了荧光强度分析杂交的优点(参见例如，1998年12月31日递交的美国专利申请号09/224,505)，本发明分析的某些实施方案特异性检测了探针和双链靶的四链体，所以排除对靶进行变性的需要。令人惊奇的是，本发明人已经能够特异性测定在双链探针和双链靶之间形成的四链体，其中探针和靶之间的相互作用基于沃森-克里克碱基配对(至少在A结合T(或U，在RNA的情况中)和G结合C的意义上)，而不是很有限的如Pitner等，同上的四链体杂交的Hoogsteen模型。
用于本发明分析中的合适的探针包括例如dsDNA、dsRNA、DNA:RNA杂合体、dsPNA、PNA:DNA杂合体，和不带电荷或带部分电荷的主链的其它双链核酸类似物。具有8-20个碱基任意长度的探针序列是优选的，因为这是原核生物和真核生物中找到的最小的独特DNA序列的范围。探针为12-18个碱基是特别优选的，因为这是人基因组中独特序列的最小长度。在实施方案中，5-30个碱基的探针是最优选的。但是，可以利用多个更短的探针来检测其中具有多个非独特靶序列的核苷酸序列，将它们组合来独特地鉴定所述核苷酸序列。可选择探针的长度来匹配靶的长度。
本发明不需要使用放射性探针，它们在使用中是危险、麻烦和耗时的，并需要不断地再生。本发明的探针优选使用时是安全的，并且常年稳定。因此，探针可以大量制造或定购和储存。
在实施方案中，用多分子的信号复合体或氧化还原对，或用引发化学发光或电化学发光特性的标记来标记探针。
当荧光嵌入剂不存在于杂交介质中时，优选地，探针或靶(优选探针)具有与其共价结合的荧光标记。该标记优选是非嵌入荧光团或嵌入荧光团。在这样的实施方案中，荧光团优选在任意末端与探针结合。优选的荧光标记包括生物素、若丹明、吖啶和荧光素，以及其它当用激发能照射时发荧光的标记。
选择激发波长(通过常规实验和/或常识)，以对应子在用荧光团的激发最大值，并优选为200-1000nm。优选地，选择荧光团具有200-1000nm的辐射波长。在优选的实施方案中，利用氩离子激光器照射荧光团，光的波长范围是400-540nm，以及在500-750nm的范围内检测荧光辐射。
本发明分析可以在各种温度下进行，如5-85℃。现有技术的某些分析需要提高的温度、增加成本和延迟测定。另一方面，本发明可在室温或低于室温(例如低于25℃)下进行。
本发明的可靠性不依赖于所述靶中的鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。因为G-C碱基对形成了三个氢键，而A-T碱基对仅形成了两个氢键，具有更高的G或C含量的靶和探针序列更稳定，具有更高的解链温度。结果，提高杂交探针和靶区域的GC含量在完全匹配的杂合体所含的之上，碱基对错配可以抵销与错配探针相关的结合弱化。
本发明分析是极其灵敏的，从而排除了对靶进行PCR扩增的需要。例如，可以分析具有约20微升体积的测试样品，其含有约10fmol的靶和约10fmol的探针。本发明的实施方案是灵敏的，足以测定浓度为5×10-9M、优选不超过5×10-10M的靶。本发明的实施方案是灵敏的，足以利用浓度为5×10-9M、优选不超过5×10-10M的探针。不用说，前面的值并非暗示该方法不能检测更高的浓度。
探针(例如第一和第二条链)与靶(例如第三和第四条链)的比例是30∶1到1∶1，优选约10∶1。
实施例将显示，YOYO-1为一已知的位于小沟的双链体DNA嵌入剂，其可促进DNA寡核苷酸与双链体靶的三链体缔合或结合并对所述缔合或结合发出信号，其指示互补性程度，基于寡核苷酸上的碱基和双链体靶中的互补序列的碱基之间的沃森-克里克碱基对识别而加以确定。
所观察的三链体结合不可能是同型嘧啶三链体基元的形式，在文献中有明确鉴定，这是由于复合体对酸条件要求高。同样，如果把我们典型的野生型GC含量33％的15聚体寡核苷酸评价成双链体靶中“富含嘌呤的链”的结合伙伴，正如同型嘌呤三链体基元所要求的，则我们的寡核苷酸在富含嘌呤的靶双链体链上的寡核苷酸序列或假设的结合位点中将有9个碱基的错配。
YOYO-1嵌入剂根据NMR光谱学研究已由Johansen和Jacobsen(1998)报道为位于双链体DNA的小沟。其还报道，YOYO-1的作用是局部将双链体DNA的B构象解缩合106°，导致13个碱基对的总螺旋重复而非在B构象螺旋重复中通常所发现的10个碱基对。
作为荧光团，YOYO-1的辐射通过向含有双链体靶的介质中加入互补寡核苷酸而得以大大增强。与寡核苷酸和双链体的相互作用相关的辐射增强可归功于存在于双链体小沟中并在寡核苷酸与双链体接触后更强力发射光的YOYO-1，或归功于当其各个碱基相互接触时，在由双链体中的寡核苷酸和互补链所产生的沟中，找到第二个易于接受的位置定位自身的YOYO-1。也有可能两个事件同时发生。诸如X-射线结晶学和NMR光谱学的深入研究将确立YOYO-1与天然三链体可能的位置以及相互作用。
Johansen和Jacobsen(1998)的结论是双链体DNA解缩合106°是由YOYO-1生色团的双嵌入所引起的，同时聚丙烯胺接头链维持在双链体的小沟中。这可能是部分机制，由此靶解缩合106°，这将是以两个方向从YOYO-1相互作用的部位中表现出的松弛。位于双链体主链之间小沟中的YOYO-1的+4阳离子性质造成紧邻YOYO-1结合部位的磷酸根阴离子电荷之间排斥的松弛，导致骨架链在邻近YOYO-1处相互靠得更近，这也是有可能的。如果第二YOYO-1将其定位在靠近双链体小沟中存在的YOYO-1，通过位于由寡核苷酸和互补链在小沟中相互接触时所产生的沟，此YOYO-1也会用于降低寡核苷酸主链和主链的互补序列区之间的阴离子排斥。
我们还观察到缩合双链体DNA的试剂具有促进三链体形成的能力。除了单价、二价和多价阳离子缩合双链体DNA的众所周知的能力以外，我们的结果还提示阳离子形成桥，所述桥使得寡核苷酸中的碱基和双链体互补链中的碱基之间的结合成为可能。我们呈现它首先通过形成由阳离子促进的三链体，然后破坏桥连结构。介质中含有阳离子和三链体，对其持续发射激光的结果是所有三链体结构的快速消失。
我们利用由YOYO-1促进的三链体的经验在于，它们在室温下容易形成，并且形成后持续许多小时。随着时间的推延，错配的寡核苷酸继续同样低水平的荧光团辐射，显示同样水平的三链体形成。另一方面，阳离子似乎导致短暂的条件，有助于三链体或四链体的形成。阳离子包括诸如YOYO-1的嵌入剂，诸如MgCl2的金属中心阳离子或诸如亚精胺的阳离子肽，所有这些阳离子通过与阴离子电荷相互作用而作用于构象，导致双链体DNA靶的构象的修饰。这些结果随着阳离子物种、若干物种的浓度或存在不同浓度的物种而变化。
我们已显示了适当浓度的有机溶剂允许修饰靶双链体DNA，这使得三链体得以形成。
许多三链体和四链体形成的短暂性质与有机体的要求相一致，这些要求为涉及从双链体DNA获取序列信息的许多过程应是可逆的，其是受激的和终止的。然而，这样的信息是足够稳定的，以便诊断和其他分析可以它们作为基础。
所以，我们已经发现，无论通过什么途径，它是双链体DNA的缩合或解缩合，这使得寡核苷酸和互补序列之间的识别成为可能，足以实现寡核苷酸上的至少一个碱基与双链体靶的互补链中的碱基接触。当螺旋重复的大小被缩合或解缩合修饰时，很可能有众多的位置改变，所述位置通常由序列中的相邻碱基对所享有。在修饰的螺旋中重新排列堆积的碱基对极有可能从存在于未修饰的双螺旋的碱基堆积的电子轨道中允许有足够的变化，从而让第三条链与互补链开始结合。
由缩合或解缩合带来的双链体修饰可以相当匀相的方式发生，dsDNA中及其附近的所有阴离子电荷一般同时受到影响，或者修饰可以局部化。在后一种情形下，一系列变化大的修饰将出现在逐渐远离修饰位点的DNA碱基对和主链中。在任一情形下，可创造条件以使得寡核苷酸上的碱基与双链体互补链中的碱基之间结合事件生成三链体配对。一旦这样的结合已经启动，可以理解寡核苷酸上两个侧翼碱基序列如何摆动到与双链体互补链的侧翼序列中的碱基结合的位置上。
当我们的实验在由YOYO-1促进的三链体中显示出极大的稳定性时，其他许多试剂对双链体DNA的构象具有影响，这些影响导致天然三链体短暂形成。这些三重螺旋结构继续发展成对三链体维持较不利的构象，导致三链体结构丧失。
任何能够起到修饰靶dsDNA的构象作用的因素必须对其随着时间的影响加以监控，从而建立在选定的温度、pH等条件下适合的浓度和温育时间。本申请教导许多评价这种试剂的方法，所述方法可由本领域的专业技术人员采用或修改以实施本文所教导的技术方案。
参照下列实施例，本发明将更详细加以说明，但应理解本发明不视为受限于此。
实施例
参照下列实施例，本发明将更详细加以描述，但应理解本发明不视为受限于此。
实施例1
实施例1显示，当存在阳离子DNA嵌入剂YOYO-1(MolecularProbes，Eugene，OR，USA)时，本发明的分析可区分完全互补dsDNA:ssDNA复合体与含有1bp、2bp和3bp错配或缺失的dsDNA:ssDNA复合体。NMR光谱对YOYO-1和dsDNA之间相互作用机制的分析已显示，YOYO-1的嵌入导致dsDNA螺旋的局部解缩合106°，产生13个碱基对的总螺旋重复，与非缩合B构象dsDNA中通常10个碱基对螺旋重复相反[J.Biomolec.Struct.and Dynamics 16，205-222(1998)]。
互补有义和反义50聚体ssDNA靶序列衍生自人囊肿性纤维化基因的外显子10[Nature 380，207(1996)]，经DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成并通过HPLC纯化。将等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃加热10分钟，并且随着温度在1.5小时冷却至21℃逐渐退火。把dsDNA寡核苷酸以浓度1pmole/μl溶解在ddH2O中。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：1)为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：1)为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO：2为50聚体的突变dsDNA靶序列，与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同，除了在氨基酸位置507上有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上野生型有义链序列CAT变为C
GT。
SEQ ID NO：2的有义链的序列为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT C
GT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：2的反义链的序列为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA
CGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO：3为50聚体的突变dsDNA靶序列，与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同，除了在氨基酸位置506和507上有两个连续碱基对突变(下划线)以外，在这两个位置上野生型有义链序列CAT变为
ACT。
SEQ ID NO：3的有义链的序列为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT A
CT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：3的反义链的序列为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA
GTA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO：4为50聚体的突变dsDNA靶序列，与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同，除了在氨基酸位置506和507上有三个连续碱基对突变(下划线)以外，在这些位置上野生型有义链序列CAT变为
ACG。
SEQ ID NO：4的有义链的序列为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT
ACG CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：4的反义链的序列为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AG
C
GTA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
SED ID NO：5为47聚体的突变dsDNA靶序列，与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同，除了在氨基酸位置507和508上有三个连续碱基对缺失(用三个点表示)以外，在这些位置上野生型有义链序列CTT缺失。
SEQ ID NO：5的有义链的序列为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT ... TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：5的反义链的序列为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA ... A TGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
探针1号为15聚体ssDNA探针，设计成与50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)的有义链的15个核苷酸区段完全互补，在氨基酸位置505-510重叠[Nature 380，207(1996)]。探针的手性与靶中的有义链的手性相反或反平行。探针1号在DNA合成仪上合成，由HPLC纯化，并以浓度为1pmol/μl溶解在ddH2O中。
探针1号的序列为：
5’-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
杂交反应混合物(120μl)含有下列物质：6pmol的靶dsDNA、6pmol的ssDNA探针、0.5×TBE和500nM的DNA嵌入剂YOYO-1(MolecularProbes，Eugene，OR，USA)。将反应混合物在室温(21℃)下温育5分钟，放置于石英比色杯中，用波长488nm的氩离子激光束照射，并且在加热的室中，随着时间温度升高，对荧光辐射进行反复监测。通过直接置于各样品中的软件控制的温度探针，对样品同时进行温度测定。以各个分析样品的温度函数，对最大的荧光强度作图。
图1表明，当野生型50聚体非变性dsDNA靶序列(SEQ ID NO：1)与15聚体ssDNA探针1号在30-85℃下反应时，取得了最高的荧光强度。在温度低于50聚体野生型dsDNA的Tm 65℃时，dsDNA:ssDNA复合体形成，由DNA嵌入剂YOYO-1增强。随着温度升高到65℃以上，dsDNA:ssDNA复合体转化成ssDNA:ssDNA复合体。显然，YOYO-1能够嵌入并在两种类型的复合体中有效发荧光。
对比之下，不完全互补的探针和靶组合生成1bp错配(SEQ IDNO：2+探针1号)、连续2bp错配(SEQ ID NO：3+探针1号)、连续3bp错配(SEQ ID NO：4+探针1号)和3bp缺失(SEQ ID NO：5+探针1号)导致荧光强度分别比用完全匹配序列所观察到的在30℃下低57％、94％、97％和98％，而在65℃下低47％、79％、92％和91％(图1)。含有50聚体dsDNA靶加上500nM YOYO-1的对照样品显示出荧光水平为或低于用3bp错配的复合体在30℃下所观察到的荧光水平(数据未显示)。由ssDNA探针1号加上500nM YOYO-1样品所发射的荧光水平与单独由YOYO-1发射的相同(数据未显示)。随着温度增加高于65℃时，完全匹配和碱基对错配之间的区分程度降低，表明dsDNA:ssDNA结构逐渐分解。至85℃时，由1bp错配、2bp错配、3bp错配和3bp缺失所实现的荧光强度比完全匹配获得的要低40％、63％、92％和83％(图1)。在任何给定温度下，由各个复合体所发射的荧光的特征水平随时间加以监测，并且在5分钟和24小时之间稳定。
DNA解缩合剂YOYO-1的存在使得ssDNA探针用于辨别完全互补dsDNA:ssDNA复合体和那些含有1bp、2bp或3bp错配或缺失的复合体，无需事先对dsDNA靶进行变性。
实施例2
为了确保采用DNA解缩合剂、ssDNA探针和非变性dsDNA靶的荧光强度分析适用于明显具有不同GC百分含量(以及潜在的相异退火温度)的探针和靶DNA，将新的15聚体ssDNA探针和50聚体dsDNA靶序列如上合成、纯化和退火。ssDNA探针和dsDNA靶均以浓度1pmol/μl溶解在ddH2O中。
SEQ ID NO：6为从SEQ ID NO：1中修饰的50聚体dsDNA靶序列，其中GC百分含量从30％变为52％。
野生型靶DNA的有义链序列(SEQ ID NO：6)为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
野生型靶DNA的反义链序列(SEQ ID NO：6)为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：7为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：6相同，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CTC变成CT
T。
突变体SEQ ID NO：7的有义链序列为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CT
T TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变体SEQ ID NO：7的反义链序列为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CA
A AGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：8为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：6相同，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CAT变成C
GT。
突变体SEQ ID NO：8的有义链序列为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT C
GT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变体SEQ ID NO：8的反义链序列为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA
CGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：9为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：6相同，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CAT变成C
TT。
突变体SEQ ID NO：9的有义链序列为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT C
TT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变体SEQ ID NO：9的反义链序列为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA
AGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：10为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：6相同，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CTC变成C
CC。
突变体SEQ ID NO：10的有义链序列为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT C
CC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变体SEQ ID NO：10的反义链序列为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG
GGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：11为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：6相同，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CTC变成C
GC。
突变体SEQ ID NO：11的有义链序列为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT C
GC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变体SEQ ID NO：11的反义链序列为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG
CGA TGA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：12为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：6相同，除了有连续两个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CAT变成
ACT。
突变体SEQ ID NO：12的有义链序列为：
5’-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT
ACT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变体SEQ ID NO：12的反义链序列为：
5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA
GTA CAGTGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：13为从SEQ ID NO：1修饰的50聚体dsDNA靶序列，其中GC百分含量由30％变为72％。
野生型靶DNA的有义链序列(SEQ ID NO：13)为：
5’-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGCGAC CTC CGA CGA GCG TG-3’。
野生型靶DNA的反义链序列(SEQ ID NO：13)为：
5’-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：14为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：13相同，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CGT变成C
AT。
突变体SEQ ID NO：14的有义链序列为：
5，-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT C
AT CCC TGG TGCGAC CTC CGA CGA GCG TG-3’。
突变体SEQ ID NO：14的反义链序列为：
5’-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA
TGA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：15为50聚体突变dsDNA靶序列，与SEQ ID NO：13相同，除了有连续两个碱基对突变(下划线)以外，在此位置有义链序列CGT变成
ATT。
突变体SEQ ID NO：15的有义链序列为：
5’-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT
ATT CCC TGG TGC GACCTC CGA CGA GCG TG-3’。
突变体SEQ ID NO：15的反义链序列为：
5’-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA
ATA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
探针2号为15聚体ssDNA探针，设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：6)的有义链的15个核苷酸区段。所述探针的手性与靶中有义链的手性相反或反平行。
探针2号的序列为：
5’-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
探针3号为15聚体ssDNA探针，设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：13)的有义链的15个核苷酸区段。所述探针的手性与靶中有义链的手性相反或反平行。
探针3号的序列为：
5’-CAC CAG GGA CGA CCG-3’。
杂交分析条件与实施例1中所述的相同。
当ssDNA探针2号(GC含量为53％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12)反应时，dsDNA:ssDNA复合体在低温及非变性条件下形成(图2A)。当完全匹配的DNA复合体取得最高的荧光强度时，带有1bp错配的不完全互补复合体(SEQ ID NO：8+探针2号)和带有连续2bp错配的不完全互补复合体(SEQ ID NO：12+探针2号)在30℃下产生的荧光强度分别比用完全匹配序列所观察到的低63％和95％(图2A)。随着温度升高，dsDNA:ssDNA复合体逐渐分解，导致荧光强度降低以及完全匹配与碱基对错配之间的区别减少。至85℃时，在完全匹配序列和那些含有碱基对错配的序列之间所见的荧光差异很小(图2A)。
同样，在YOYO-1存在下，当ssDNA探针3号(GC含量为73％)与对应的50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：13)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)反应时，dsDNA:ssDNA复合体形成。1bp错配DNA复合体(SEQ ID NO：14+探针3号)和连续2bp错配DNA复合体(SEQ ID NO：15+探针3号)在30℃下的荧光强度分别比由完全匹配序列得到的低48％和64％(图2B)。随着温度从30℃升高到85℃，所有样品的荧光降低，这表明YOYO-1结合降低以及dsDNA:ssDNA复合体分解。
不管ssDNA探针和dsDNA靶的GC百分含量，YOYO-1能够促进dsDNA:ssDNA复合体在非变性条件下的形成，从而允许准确辨别完全互补序列以及那些含有1或2bp突变的序列。
实施例3
下文实施例将表明利用不同DNA缩合剂促进和稳定由非变性dsDNA靶和ssDNA-F探针形成的复合体进行分析的特异性。
探针4号为15聚体的反平行ssDNA探针，与探针1号相同，除了其在5’位置有一个连接的荧光素部分以外。探针4号通过DNA合成仪合成，经HPLC纯化，并以浓度1pmol/μl溶解于ddH2O中。
探针4号的序列为：
5’-Flu-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol5’-荧光素标记的ssDNA探针4号，10mM Tris-HCl、pH 7.5和10mM-125mM NaCl。反应混合物在室温(21℃)下温育1小时，无需对dsDNA靶进行预变性。将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。最大荧光强度出现在波长525nm处，这是荧光素的辐射波长。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。
在缺乏NaCl或存在10mM或25mM NaCl的条件下，dsDNA靶与反平行ssDNA-F探针之间没有检测到结合(数据未显示)。
在存在50mM NaCl下温育1小时后，由完全互补序列(SEQ IDNO：1+探针4号)组成的dsDNA:ssDNA-F复合体容易形成，导致荧光辐射强度与由对照探针4号(标记的ssDNA-F)所发射的比较降低49％(图3)。相比之下，含有1bp G-T错配的不完全互补dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：2+探针4号)生成的荧光辐射强度与探针4号对照样品所显示的比较降低11％。
在反应混合物中存在75mM、100mM和125mM NaCl还导致荧光辐射猝灭，这与在完全匹配的SEQ ID NO：1靶和反平行探针4号之间形成的显著量的复合体相一致，而当存在1bp G-T错配的SEQ IDNO：2靶和探针4号时，猝灭明显较少，产生与存在50mM NaCl时所观察的相似的荧光强度(数据未显示)。
采用已知为DNA缩合剂的单价阳离子，促进在非变性dsDNA靶和荧光标记的反平行ssDNA探针之间形成DNA复合体，从而使得完全互补的DNA序列与那些含有单一1bp错配的序列之间产生可靠的差异。以探针与靶为10∶1的比例室温下在温育1小时以内发生反应。用于该实施例的dsDNA靶和ssDNA探针具有33％的GC含量，并且不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸的DNA。尽管在15个核苷酸ssDNA探针内插入有6个嘧啶碱基，但是dsDNA:ssDNA复合体仍然以序列特异的方式容易地形成。
实施例4
为了确保在诸如阳离子的DNA缩合剂存在下采用5’-荧光素标记的ssDNA探针和非变性dsDNA靶的荧光强度分析，适用于明显具有不同GC百分含量(以及潜在的相异退火温度)的探针和靶DNA，将15聚体ssDNA-F探针和50聚体dsDNA靶序列(具有不同的GC百分含量)如上合成、纯化和退火。ssDNA-F探针和dsDNA靶均以浓度1pmol/μl溶解在ddH2O中。
探针5号为一15聚体反平行ssDNA探针，与探针2号相同，除了其在5’位置具有一个连接的荧光素部分以外。
探针5号的序列为：
5’-Flu-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
探针6号为一15聚体反平行ssDNA探针，与探针3号相同，除了其在5’位置具有一个连接的荧光素部分以外。
探针6号的序列为：
5’-Flu-CAC CAG GGA CGA CCG-3’。
实施例3中进行的分析在反应混合物中通过加入单价阳离子而得以促进。利用二价阳离子(而非单价阳离子)促进由具有各种不同GC百分含量的dsDNA靶和ssDNA-F探针形成复合体来进一步检查分析的特异性。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol5’-荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl、pH 7.5和5mM-30mMMnCl2或5mM-30mM MgCl2或5mM-30mM NiCl2。反应混合物在室温(21℃)下温育1小时，无需对dsDNA靶进行预变性。将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。最大荧光强度出现在波长525nm处，这是荧光素的辐射波长。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。
当ssDNA-F探针5号(GC含量为53％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：12)在存在10mM MnCl2下温育时，在室温及非变性条件下形成dsDNA:ssDNA-F复合体。当完全匹配的DNA复合体生成的荧光强度下降最大(温育1小时后降低43％)时，含有1bp T-G错配的较不稳定的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)温育1小时后产生的荧光强度比单独采用探针5号所观察的要低20％(图4)。造成1bpG-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：8+探针5号)、1bp T-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：9+探针5号)、1bp C-A错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：10+探针5号)以及连续2bpA-G和C-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：12+探针5号)都比完全匹配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：6+探针5号)不稳定，生成的荧光强度介于单独探针5号和完全匹配的DNA复合体所观察的之间(数据未显示)。除了1bp T-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体，其是最不稳定的(1小时后荧光强度仅降低5％)，其他所有错配的DNA复合体生成非常相似的荧光强度。只有含1bp G-A错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：11+探针5号)产生的荧光强度低于完全匹配的dsDNA:ssDNA-F复合体(数据未显示)。
当ssDNA-F探针6号(GC含量为73％)与对应的50-聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：13)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：14)反应1小时后，包含20mM MgCl2或20mM MnCl2或20mM NiCl2也促进形成了dsDNA:ssDNA-F复合体(数据未显示)。正如所预料，完全匹配的dsDNA:ssDNA-F复合体生成的荧光强度降低最大，而较不稳定的1bpA-C错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：14+探针6号)产生的荧光水平介于中间。
在存在10mM MnCl2条件下1小时以内容易形成完全匹配的dsDNA:ssDNA-F复合体(GC含量为33％)(SEQ ID NO：1+探针4号)，导致荧光强度比单独由探针4号发射的降低57％(数据未显示)。这些反应条件对于含有1bp G-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ IDNO：2+探针4号)是高度不利的，造成荧光比单独由探针4号所观察的增加(数据未显示)。
不管dsDNA靶和ssDNA探针的GC百分含量，在非变性条件下，加入诸如Mn+2、Mg+2或Ni+2的二价阳离子促进形成dsDNA:ssDNA复合体，从而允许准确区分完全互补的序列和那些含有1bp突变的序列。
实施例5
在一种单价或二价阳离子存在下，对实施例3和4中形成的dsDNA:ssDNA复合体进行分析。下文的实施例将证实，当二价阳离子组合用作复合体形成的促进剂时，本发明区分dsDNA:ssDNA复合体中的完全匹配和1bp错配的分析是可靠的。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol5’-荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl、pH 7.5和MnCl2和MgCl2各为5mM-20mM。反应混合物在室温(21℃)下温育1小时，无需对dsDNA靶进行预变性。将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。
当反平行ssDNA-F探针6号(GC含量为73％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：13)在存在20mM MgCl2和20mM MnCl2下温育1小时后，有效形成完全互补的dsDNA:ssDNA-F复合体，生成的荧光与单独由探针6号所发射的比较降低46％(图5A)。这些反应条件对于含有1bp A-C错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：14+探针6号)是高度不利的，导致荧光比单独由探针6号所观察的减少3％(图5A)。当相同样品在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2或15mM MgCl2和15mM MnCl2条件下温育1小时后获得类似的结果(数据未显示)。加入5mM MgCl2和5mM MnCl2不足以使得反平行ssDNA-F探针6号和所有测试dsDNA靶在温育1小时后相互之间形成复合体(数据未显示)。
当反平行ssDNA-F探针4号(GC含量为33％)与野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：1)或突变dsDNA靶(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2下温育时，观察到形成最低的DNA复合体(数据未显示)。然而，在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下温育1小时促进了完全匹配的dsDNA:ssDNA-F(SEQ ID NO：1+探针4号)复合体的形成，正如与由探针4号所获得的比较，观察到的荧光强度降低49％所表明(图5B)。造成1bp G-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：2+探针4号)或造成3bp缺失的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：3+探针4号)在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下很不稳定，产生的荧光与单独由探针4号所发射的比较，分别降低2％和增加5％(图5B)。用20mM MgCl2和20mM MnCl2处理1小时，导致完全匹配的dsDNA:ssDNA-F复合体以及含有1bp G-T错配或3bp缺失的dsDNA:ssDNA-F复合体的荧光强度与单独由探针4号所发射的比较，分别减少68％、48％和6％(数据未显示)。
如图5C所示，在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2下，GC含量为53％并含有完全互补序列的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ IDNO：6+探针5号)或GC含量为53％并含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)在温育1小时后所生成的荧光强度分别比单独由反平行探针5号所发射的要低68％和20％。
当反平行ssDNA-F探针5号(GC含量为53％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下温育1小时后，非常有效生成完全互补的dsDNA:ssDNA-F复合体，生成的荧光与单独由探针5号所获得的比较降低74％(图5D)。相比之下，含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2下非常不稳定，产生的荧光在温育1小时后与单独由探针5号所发射的比较降低15％(图5D)。同样，造成1bp G-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：8+探针5号)、1bp C-A错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：10+探针5号)、1bp G-A错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：11+探针5号)和连续2bp A-G和C-T错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ IDNO：12+探针5号)都比完全匹配的DNA复合体更不稳定(数据未显示)。当探针5号(GC含量为53％)与dsDNA靶SEQ ID NO：3(GC含量为33％)反应时，观察的荧光与单独由探针5号所获得的比较增加3％(图5D)，这表明没有DNA复合体形成。考虑到此探针和靶结合会导致5bp错配，此结果是可预料的。
实施例3、4和5共同表明，加入诸如单价阳离子或二价阳离子的缩合剂(独自或组合)促进了dsDNA靶和荧光标记的ssDNA探针之间的DNA复合体形成，显著具有不同的GC百分含量，从而允许准确和可靠地区分完全互补序列和那些含有各种各样的1bp突变的序列。
实施例6
由YOYO-1促进的dsDNA:ssDNA复合体室温下在温育5分钟内容易形成，并且以同样水平的强度产生荧光辐射数小时。含有碱基对错配的复合体同样发射持久的荧光信号，这表明随着时间的推延复合体形成的水平相同。为了检查在诸如阳离子的缩合剂存在下dsDNA:ssDNA复合体的形成速率、稳定性和解离速率，进行了时间过程试验。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol非变性靶dsDNA，4pmol 5’-荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl、pH 7.5和10mM MnCl2和10mM MgCl2。反应混合物在室温(21℃)下温育1分钟至2小时的各种不同期间。温育后，将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。在所示的时间，随后的多激光照射之后，对相同样品进一步进行荧光测定(图6)。对各个分析样品以时间为函数将荧光强度绘图。
由含有4pmol探针5号加上10mM MnCl2和10mM MgCl2的对照样品在缺乏靶dsDNA下所发射的荧光在仅温育5分钟内显著降低了3倍(数据未显示)，然后在接着的数小时内以更缓慢的速率稳定地下降(图6A)。这种效果我们称为“阳离子猝灭”。这种荧光抑制与ssDNA-F探针和特异阳离子的温育期间增加相关，通常发生在二价阳离子存在下，而不发生在单价阳离子存在下(数据未显示)。此观察使得在与试验的测试样品反应十分相同的条件下，温育试验中的对照样品明显重要。在温育的不同期间之后，对各ssDNA-F对照样品进行多激光发射，抑制了进一步猝灭荧光团，导致其后荧光水平的稳定(图6A)。此结果是完全未预料的。
当反平行ssDNA-F探针5号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ IDNO：6)在存在10mM MnCl2和10mM MgCl2下温育时，15分钟后dsDNA:ssDNA-F复合体形成明显，导致荧光降低，其比对照探针5号的渐进式阳离子猝灭高出6％(图6B)。在存在10mM MnCl2和10mMMgCl2下，与单独由阳离子猝灭的探针5号所取得的比较，SEQ ID NO：6与探针5号温育30和60分钟之后生成的荧光分别降低76％和61％，这极其表明复合体形成(图6B)。在存在10mM MnCl2和10mM MgCl2下温育90和120分钟之后，信号显示没有复合体形成(图6B)。90和120分钟处的荧光辐射水平完全可归功于阳离子猝灭效果(比较图6A和6B)。
相比之下，含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ IDNO：7+探针5号)以较慢的速率形成，并且一旦在10mM MnCl2和10mMMgCl2存在下形成非常不稳定。1bp T-G错配的复合体在温育30分钟后首先被观察到，并且在温育60分钟后似乎已得以消除(图6C)。再次，探针反平行于双链体中的互补链(图6C)。
在10mM MnCl2和10mM MgCl2存在下，温育30或60分钟之后形成的多激光照射完全互补的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：6+探针5号)导致荧光辐射与以对含有反平行ssDNA探针的DNA复合体特有的速率破坏这些复合体相一致(图6B)。在30分钟处对完全互补的复合体发射激光，随后在45分钟处进行测定时，发射强度水平为1869，这证明复合体降解的快速性(数据未显示)。荧光辐射在多激光发射后的水平返回到单独由未复合的探针5号对照所观察到的阳离子猝灭值(比较图6A和6B)。唯一例外是温育15分钟后形成的和其后反复照射的完全匹配的复合体(图6B)。在这种情况下，荧光辐射与复合体的破坏不相一致(图6B)，即使进一步阳离子猝灭探针5号，当15分钟温育后多照射时，也完全受到抑制(图6A)。含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)同样被多激光发射明显破坏(图6C)。
进行一个实验以确定多激光发射对复合体影响的原理。当新鲜阳离子加入到已两次被激光发射的反应混合物时，发现由ssDNA-F探针所发射的荧光中阳离子猝灭的抑制不可以逆转，并且进一步阳离子猝灭不发生在进一步温育之时，这有力地提示由于仍然未知的机制，ssDNA-F探针被多照射所失活(数据未显示)。同样，在对新鲜探针增加的荧光辐射规格化之后，将新鲜ssDNA-F探针加入到已两次被激光发射的反应混合物中时，进一步温育反应混合物，未观察到随后的渐进式阳离子猝灭，这有力提示激光发射的阳离子不知何故失效了(数据未显示)。
实施例7
实施例1-6表明以序列特异方式在dsDNA靶和ssDNA探针之间形成dsDNA:ssDNA复合体，或者由诸如YOYO-1的DNA解缩合剂或者由诸如单价或二价阳离子的DNA缩合剂促进。下文实施例将研究在各种各样的阳离子存在下dsDNA:dsDNA复合体的形成速率、稳定性和解离速率。这些实施例将显示阳离子物种、各个阳离子浓度以及不同浓度下不同阳离子的组合对dsDNA:dsDNA复合体的形成速率、稳定性和解离速率的影响。
互补有义和反义15聚体ssDNA探针序列在DNA合成仪上合成，并且经HPLC纯化。将等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃下加热10分钟，并随着温度在1.5小时冷却至21℃逐渐退火。把dsDNA寡核苷酸以浓度1pmole/μl溶解在ddH2O中。
探针7号为15bp dsDNA探针，在各个5’位置连接有荧光素部分，设计成与50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：6)的15bp区段完全同源。探针7号的反义链与探针5号相同。
探针7号的有义链序列为：
5’-Flu-CTG TCA TCT CTG GTG-3’。
探针7号的反义链序列为：
5’-Flu-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol非变性靶dsDNA，4pmo1 5’-荧光素标记的dsDNA探针，10mM Tris-HCl、pH 7.5，70mM至90mM KCl以及0mM至20mM NaCl。反应混合物在室温(21℃)下温育1分钟至2小时的各种期间。温育后，将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射一次，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以时间为函数将荧光强度绘图。
由含有4pmol探针7号加上90mM KCl的对照样品在缺乏靶dsDNA下所发射的荧光在120分钟温育的全过程中保持相对恒定，这表明在单价KCl存在下未发生阳离子猝灭dsDNA-F探针(图7A)。当dsDNA-F探针7号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7)在90mM KCl存在下温育时，室温及非变性条件下仅在温育15分钟内就形成了dsDNA:dsDNA-F复合体，并持续至少120分钟(图7A)。在90mM KCl存在下，温育30和45分钟之后，观察到完全匹配的和1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体之间有最大区分，生成的荧光强度与单独由探针7号所发射的相比，30分钟后分别低27％和3％，而45分钟后分别低34％和15％(图7A)。
在70mM KCl和20mM NaCl存在下，含有完全匹配序列的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：6+探针7号)或含有1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：6+探针7号)所产生的荧光强度比单独由探针7号获得的，在30分钟后分别低47％和19％，而在45分钟后分别低35％和14％(图7B)。在70mM KCl和20mM NaCl存在下，120分钟的温育过程中，观察到少量的阳离子猝灭dsDNA-F探针7号(图7B)。这种最低的阳离子猝灭由包含NaCl所引起，当NaCl单独存在时，其导致探针7号类似的渐进式荧光猝灭(数据未显示)。
80mM KCl和10mM NaCl的存在优先促进了野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和dsDNA-F探针7号之间形成完全匹配的dsDNA:dsDNA-F复合体，导致与由对照探针7号样品所发射的荧光比较，在30分钟、45分钟和60分钟温育后荧光辐射分别降低18％、48％和34％(图7C)。相比之下，在80mM KCl和10mM NaCl存在下，贯穿整个120分钟温育过程，1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQID NO：7+探针7号)的形成是非常低效率的，正如与由探针7号所显示的比较，采用这些错配的复合体观察到的荧光减少了1％至5％所表明(图7C)。
因此，以接近生理浓度包含诸如KCl和NaCl的单价阳离子促进了非变性dsDNA靶和荧光标记的dsDNA探针之间形成DNA复合体。复合体形成的依据是同源碱基对识别，以可测量的和显著大量的复合体形成发生在完全匹配的同源双链体链之间。室温下以探针和靶的比为10∶1，在15分钟至60分钟的相对短的温育期间内发生反应。该实施例中所用的dsDNA靶和dsDNA探针是同源的，GC含量为53％，并且在任何DNA链上不含有同型嘌呤和同型嘧啶延伸。本发明分析利用dsDNA探针，能够识别完全匹配的dsDNA序列和那些含有一对错配碱基的序列。
实施例8
实施例7中进行的分析受到反应混合物中加入的单价阳离子的促进。此实施例将证明dsDNA:dsDNA复合体在二价阳离子存在下的形成速率、稳定性和解离速率。反应条件与实施例7中所述的相同，除了KCl和NaCl用各为30mM至40mM的MnCl2和MgCl2替换以外。
对照dsDNA-F探针7号样品在30mM MnCl2和30mM MgCl2(图8A)或40mM MnCl2和40mM MgCl2(图8B)存在下，随着温育时间延长显示出荧光渐进式减少。在10mM MnCl2和10mM MgCl2存在下，该阳离子猝灭与采用ssDNA-F探针5号观察到的类似(图6A)。
当dsDNA-F探针7号在30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)温育时，dsDNA:dsDNA-F复合体形成是显而易见的，60分钟温育后荧光增加，所述荧光比对照探针7号的渐进式阳离子猝灭高出13％(图8A)。在30mM MnCl2和30mMMgCl2存在下，SEQ ID NO：6和探针7号温育75分钟后，与单独由阳离子猝灭的探针7号所获得的比较，生成的荧光降低81％，这极其显示复合体形成(图8A)。在30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下，温育60分钟和75分钟后也形成含有1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针7号)，与单独由阳离子猝灭的探针7号所获得的比较，生成的荧光分别降低16％和30％(图8A)。在30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下温育90和120分钟之后，信号表示没有复合体形成(图8A)。90分钟后，观察到的荧光水平完全可归功于阳离子猝灭效果(图8A)。
在40mM MnCl2和40mM MgCl2存在下，含有完全匹配序列的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：6+探针7号)或含有1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针7号)所产生的荧光强度与单独由阳离子猝灭的探针7号所发射的相比，在60分钟后分别低17％和高4％，在75分钟后分别低36％和22％，以及在90分钟后分别低57％和高0.2％(图8B)。在40mM MnCl2和40mM MgCl2存在下温育120分钟之后，信号表示没有复合体形成(图8B)。
加入诸如MnCl2和MgCl2的二价阳离子促进了非变性dsDNA靶和荧光标记的dsDNA探针之间形成DNA复合体，从而允许准确区分完全匹配的同源序列和那些含有1bp突变的序列。与形成dsDNA:ssDNA复合体所需的相比较，形成dsDNA:dsDNA复合体需要约加倍浓度的MnCl2和MgCl2。在二价阳离子存在下比在单价阳离子存在下，dsDNA:dsDNA复合体的形成速率要慢。一旦形成，二价阳离子诱导的dsDNA:dsDNA复合体似乎在较短时间段是稳定的。
实施例9
接着研究在单价和二价阳离子存在下dsDNA:dsDNA复合体的形成速率、稳定性和解离速率。杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.4pmol非变性靶dsDNA，4pmol 5’-荧光素标记的dsDNA探针，10mMTris-HCl、pH 7.5和60mM至80mM KCl，10mM至20mM NaCl，30mMMnCl2和30mM MgCl2。反应混合物在室温(21℃)下温育1分钟至150分钟的各种各样期间。温育后，将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射一次，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以时间为函数将荧光强度绘图。
各种浓度的KCl和NaCl与在30mM MnCl2和30mM MgCl2一起存在导致在对照dsDNA-F探针7号的荧光中阳离子猝灭(图9)，其与仅含有二价阳离子所观察的非常类似(图8)。包含单价阳离子似乎不影响二价阳离子猝灭dsDNA-F探针。
当dsDNA-F探针7号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7)在60mM KCl、20mM NaCl、30mMMnCl2和30mM MgCl2存在下温育时，室温和非变性条件下仅在温育15分钟内就形成了dsDNA:dsDNA-F复合体，并持续至少150分钟(图9A)。在温育30、45和150分钟后，观察到完全匹配的和1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体之间的最大区别，生成的荧光强度与单独由阳离子猝灭的探针7号所发射的相比，在30分钟后分别低43％和16％，在45分钟后分别低38％和16％，以及在150分钟后分别低65％和1％(图9A)。
在70mM KCl、20mM NaCl、30mM MnCl2和30mM MgCl2存在下，含有完全匹配序列的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：6+探针7号)或含有1bp错配的dsDNA:dsDA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针7号)产生的荧光强度与单独由阳离子猝灭的探针7号所获得的相比，在60分钟后分别低17％和1％，在75分钟后分别低48％和11％，在90分钟后分别低22％和3％，以及在120分钟后分别低34％和2％(图9B)。
在温育30分钟和120分钟之后，含有80mM KCl、10mM NaCl、30mM MnCl2和30mM MgCl2优先促进了在野生型dsDNA靶(SEQ IDNO：6)和dsDNA-F探针7号之间形成完全匹配的dsDNA:dsDNA-F复合体。与阳离子猝灭的探针7号样品比较，完全匹配的dsDNA:dsDNA-F复合体产生的荧光辐射在温育60分钟、75分钟、90分钟和120分钟之后分别降低了27％、43％、29％和52％(图9C)。相比之下，1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针7号)的形成在80mMKCl、10mM NaCl、30mM MgCl2和30mM MnCl2存在下温育45分钟至90分钟后非常低效，正如与由阳离子猝灭的探针7号所显示的比较，采用这些错配复合体观察到的荧光减少了2％至3％所表明(图9C)。最低1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体形成在温育120分钟后发生，导致与由阳离子猝灭的探针7号所发射的相比，荧光降低了14％。
单价和二价阳离子的同时存在比单独二价阳离子以更快的速率促进形成dsDNA:dsDNA复合体。一旦形成，由两种阳离子促进的复合体比单独由单价阳离子或二价阳离子促进的复合体要持续更长的时间。在单价和二价阳离子均存在下，完全匹配的和1bp错配的dsDNA:dsDNA-F复合体之间的最大区别得以观察更长的时间间隔。因此，依据同源碱基对识别，生理浓度的KCl、NaCl和MgCl2优先促进了完全匹配的同源双链体链之间形成复合体。
实施例10
实施例3-6表明以序列特异方式在dsDNA靶和ssDNA探针之间形成dsDNA:ssDNA复合体由诸如单价或二价阳离子的DNA缩合剂促进。下文实施例将研究在也能够缩合DNA的多价阳离子亚精胺(电荷为+3)的存在下dsDNA:ssDNA复合体的形成速率、稳定性和解离速率。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.2pmol非变性靶dsDNA，2pmol 5’-荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl、pH 7.5和1mM亚精胺。反应混合物在室温(21℃)下温育1分钟至2小时的各种期间。温育后，将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射一次，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以时间为函数将荧光强度绘图。
对照ssDNA-F探针5号在1mM亚精胺存在下随着温育时间增加显示出荧光渐进式减少(图10)。这种阳离子猝灭与当同样探针在10mMMnCl2和10mM MgCl2存在下温育时所观察到的一样不明显，尤其在温育的前5分钟内(图6A)。
在1mM亚精胺存在下仅温育15和30分钟后，显示在dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和ssDNA-F探针5号之间形成完全互补的dsDNA:ssDNA-F复合体，与单独由阳离子猝灭的探针5号所获得的比较，生成的荧光分别降低了11％和20％(图10)。在1mM亚精胺存在下温育45分钟后，信号表示形成了最低的复合体(图10)。
包括1mM亚精胺对形成含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)是高度不利的，正如与温育15分钟和30分钟后由阳离子猝灭的探针5号所观察到的比较，荧光分别增加了11％和7％所表明(图10)。包含不完全互补序列的最小复合体形成在1mM亚精胺存在下仅温育75分钟之后出现，而至120分钟时消失。
在非变性条件下，加入DNA缩合剂亚精胺促进了完全匹配序列之间快速形成dsDNA:ssDNA复合体，从而允许区分完全互补的序列和那些含有1bp突变的序列。
实施例11
除了阳离子以外还有许多不同介质能够缩合dsDNA。实施例11显示在另一种DNA缩合剂乙醇存在下dsDNA:ssDNA复合体的形成速率、稳定性及解离速率。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：0.2pmol非变性靶dsDNA，2pmol 5’-荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl、pH 7.5和10％乙醇。反应混合物在室温(21℃)下温育1分钟至90分钟的各种期间。温育后，将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射一次，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以时间为函数将荧光强度绘图。
与二价或多价阳离子不同，加入10％乙醇不会导致由对照ssDNA-F探针5号所发射的荧光猝灭，但实际上导致探针荧光随时间少许增加(图11)。
10％乙醇的存在优先促进了野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：6)和ssDNA-F探针5号在温育15分钟至60分钟后形成完全互补的dsDNA:ssDNA-F复合体(图11)。相比之下，1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)的形成在10％乙醇存在下，在此温育时间过程中非常低效。由完全匹配的和1bp错配的复合体所产生的荧光强度与由探针5号对照所发射的相比，在15分钟后分别低11％和2％，在30分钟后分别低12％和1％，在45分钟后分别低25％和2％，以及在60分钟后分别低13％和7％(图11)。在10％乙醇存在下温育75分钟后未观察到显著的dsDNA:ssDNA-F复合体形成。
加入低浓度的乙醇促进了在非变性dsDNA靶和荧光标记的ssDNA探针之间形成DNA复合体，从而允许区分完全互补的序列和那些含有1bp突变的序列。
实施例12
实施例12表明当存在阳离子DNA嵌入剂YOYO-1时，本发明分析可区分完全互补的dsDNA:ssDNA复合体和含有可能的各种类型的1bp错配的dsDNA:ssDNA复合体。
互补有义和反义15聚体ssDNA探针在DNA合成仪上合成，经HPLC纯化后，以浓度1pmole/μl溶解在ddH2O中。探针1号为15聚体ssDNA探针，设计成与50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)的有义链的15个核苷酸区段完全互补，氨基酸位置505至510重叠[Nature380，207(1996)]。探针的手性与靶中有义链的手性相反或反平行。突变探针(探针8号至探针16号)的序列与探针1号相同，除了有1个碱基突变(下划线)以外。
探针1号的序列为：5’-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
探针8号的序列为：5’-CAC CAA AGA
AGA TAT-3’。
探针9号的序列为：5’-CAC
GAA AGA TGA TAT-3’。
探针10号的序列为：5’-CAC CAA A
CA TGA TAT-3’。
探针11号的序列为：5’-CAC CA
T AGA TGA TAT-3’。
探针12号的序列为：5’-CAC CA
G AGA TGA TAT-3’。
探针13号的序列为：5’-CAC CA
C AGA TGA TAT-3’。
探针14号的序列为：5’-CAC CAA AGA
CGA TAT-3’。
探针15号的序列为：5’-CAC CAA A
AA TGA TAT-3’。
探针16号的序列为：5’-CAC
AAA AGA TGA TAT-3’。
探针17号为15聚体ssDNA探针，设计成与50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)的反义链的15个核苷酸区段完全互补，氨基酸位置505至510重叠[Nature 380，207(1996)]。探针的手性与靶中反义链的手性相反或反平行。突变探针(探针18号至探针26号)的序列与探针17号相同，除了有1个碱基突变(下划线)以外。
探针17号的序列为：5’-ATA TCA TCT TTG GTG-3’。
探针18号的序列为：5’-ATA TC
T TCT TTG GTG-3’。
探针19号的序列为：5’-ATA TCA TCT TT
C GTG-3’。
探针20号的序列为：5’-ATA TCA T
GT TTG GTG-3’。
探针21号的序列为：5’-ATA TCA TCT
ATG GTG-3’。
探针22号的序列为：5’-ATA TCA TCT
CTG GTG-3’。
探针23号的序列为：5’-ATA TCA TCT
GTG GTG-3’。
探针24号的序列为：5’-ATA TC
G TCT TTG GTG-3’。
探针25号的序列为：5’-ATA TCA T
TT TTG GTG-3’。
探针26号的序列为：5’-ATA TCA TCT TT
T GTG-3’。
杂交反应混合物(40μl)含有下面的成分：2pmol靶dsDNA，2pmolssDNA探针，0.5×TBE和500nM DNA嵌入剂YOYO-1。反应混合物在室温(21℃)下温育5分钟，无需对dsDNA靶进行预变性。将样品放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。
将50聚体野生型非变性的dsDNA靶(SEQ ID NO：1)与15聚体野生型反义ssDNA探针1号以及各种各样的15聚体1碱基突变的反义ssDNA探针(探针8号至探针16号)反应，这会生成每种可能的1bp错配。不出所料，最高的荧光辐射强度由dsDNA:ssDNA复合体生成，所述复合体的组成为完全互补序列(SEQ ID NO：1+探针1号)(图12A和12B)。导致1bp A-A错配(SEQ ID NO：1+探针8号)、1bp G-G错配(SEQ ID NO：1+探针9号)、1bp C-C错配(SEQ ID NO：l+探针10号)、1bp T-T错配(SEQ ID NO：1+探针11号)、1bp T-G错配(SEQ ID NO：1+探针12号)、1bp T-C错配(SEQ ID NO：1+探针13号)、1bp A-C错配(SEQ ID NO：1+探针14号)、1bp C-A错配(SEQ ID NO：1+探针15号)和1bp G-A错配(SEQ ID NO：1+探针16号)的dsDNA:ssDNA复合体产生的荧光辐射强度与由完全匹配的dsDNA:ssDNA复合体所发射的相比分别低63％、66％、50％、47％、49％、79％、57％、51％和71％(图12A和12B)。
三重链分析的评价也是通过将50聚体野生型非变性dsDNA靶(SEQ ID NO：1)与15聚体野生型有义ssDNA探针17号和各种各样的15聚体1碱基突变的有义ssDNA探针(探针18号至探针26号)反应，这会产生每种可能的1bp错配。含有有义链探针(图12C和12D)的完全互补的dsDNA:ssDNA三重链复合体(SEQ ID NO：1+探针17号)以与含有反义链探针(图12A和12B)的完全互补的三重链复合体(SEQ IDNO：1+探针1号)相似的效力形成。导致1bp T-T错配(SEQ ID NO：1+探针18号)、1bp C-C错配(SEQ ID NO：1+探针19号)、1bp G-G错配(SEQ ID NO：1+探针20号)、1bp A-A错配(SEQ ID NO：1+探针21号)、1bp C-A错配(SEQ ID NO：1+探针22号)、1bp G-A错配(SEQ ID NO：1+探针23号)、1bp G-T错配(SEQ ID NO：1+探针24号)、1bp T-G错配(SEQ ID NO：1+探针25号)和1bp T-C错配(SEQ ID NO：1+探针26号)的dsDNA:ssDNA复合体所产生的荧光辐射强度与由完全匹配的dsDNA:ssDNA复合体所发射的相比分别低63％、67％、76％、59％、54％、57％、59％、56％和82％(图12C和12D)。
在各种各样的1bp错配之间所观察的荧光辐射强度中的可变性依赖于突变三重链序列中GC百分含量的变化，而更多依赖于特定碱基对错配(图12)。图12的结果证实了当反义或有义ssDNA探针与非变性dsDNA靶在DNA解缩合剂YOYO-1存在下反应时，三重链分析以极高的准确性鉴定所有可能的1bp错配的可靠性。
当本发明参照其特定的实施例已详细加以描述后，在不背离本发明实质和范围的情况下，本领域的专业技术人员可作出各种各样的变化和修改将是一目了然的。
序列表
<110>英詹尼斯公司(INGENEUS CORPORATION)
<120>核酸三链体和四链体形成(NUCLEIC ACID TRIPLEX AND QUADRUPLEX FORMATION)
<130>SCTO33717-47
<140>09/885,731
<141>2001-06-20
<150>09/664,827
<151>2000-09-19
<150>09/613,263
<151>2000-07-10
<150>09/468,679
<151>1999-12-21
<160>15
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>1
tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>2
tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>3
tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>4
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>4
tggcaccatt aaagaaaata tacgctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>5
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>5
tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata 47
<210>6
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<213>人工序列
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<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
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gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
<210>7
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>7
gagcaccatg acagacactg tcatctttgg tgtgtcctac gatgactctg 50
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>8
gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
<210>9
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>9
gagcaccatg acagacactg tcttctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>10
gagcaccatg acagacactg tcatccctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
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gagcaccatg acagacactg tcatcgctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>12
gagcaccatg acagacactg tactctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50
<210>13
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>13
gagcaccctc ccaggcacgg tcgtccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50
<210>14
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>14
gagcaccctc ccaggcacgg tcatccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50
<210>15
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10的序列的变体
<400>15
gagcaccctc ccaggcacgg tattccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50
Claims (55)
1.一种产生核酸多链体的方法，所述方法包括下列步骤：
1)产生含有水、沃森—克里克双链体、足够数目的单链混合碱基序列分子的混合物以形成多链体，所述多链体包括沃森—克里克双链体以及含有提高多链体形成速率或量的加速剂，所述多链体为三链体或四链体，其中一种或多种所述单链分子加以选择，以便如果在多链体中，它们分别与多链体的其他所有链通过碱基配对法则而相关，所述法则或者是沃森—克里克碱基配对法则或者是同源结合碱基配对法则；以及
2)将所述混合物温育以使多链体形成，所述多链体的各条链通过碱基配对法则与多链体的其他所有链相关；
条件是，在多链体内，步骤(1)中加入的沃森—克里克双链体为G-C含量在10％-90％之间的杂多聚体。
2.权利要求1所述的方法，其中所产生的多链体为三链体，在步骤(1)，单链分子的足够数目为1，以及在步骤(2)，形成三链体。
3.权利要求1所述的方法，其中双链体基本上保持其双螺旋结构，以及单链分子位于双螺旋结构的沟中。
4.权利要求3所述的方法，其中单链分子与双链体的一条链根据沃森—克里克碱基配对法则相关，而与双链体的第二条链根据同源结合碱基配对法则相关。
5.权利要求4所述的方法，其中双链体基本上保持其双螺旋结构，以及单链分子位于双螺旋结构的沟中。
6.权利要求1所述的方法，其中在多链体中，步骤(1)中加入的沃森—克里克双链体为G-C含量介于10％和90％之间的杂多聚体，以及其中嘌呤—嘧啶二聚体和嘧啶—嘌呤二聚体的组合频率超过25％。
7.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)和(2)利用细胞中没有的核酸链和/或双链体进行。
8.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)的操作无需蛋白的帮助。
9.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，添加水从而以体积计其占到混合物终体积的至少50％。
10.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，添加水从而以体积计其占到混合物终体积的至少80％。
11.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，添加水从而以体积计其为加到混合物中的全部液体。
12.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)在水溶液的冷冻温度或高于此温度但不高于85℃下进行。
13.权利要求12所述的方法，其中步骤(2)在等于或介于5-30℃下进行。
14.权利要求13所述的方法，其中步骤(2)在等于或介于15-25℃下进行。
15.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，阳离子作为加速剂加入。
16.权利要求15所述的方法，其中所述阳离子为Na+，以浓度50mM-125mM提供。
17.权利要求15所述的方法，其中所述阳离子选自以浓度10mM-45mM提供的Mn+2、以浓度10mM-45mM提供的Mg+2和以浓度20mM提供的Ni+2。
18.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，嵌入剂作为加速剂加入。
19.权利要求18所述的方法，其中嵌入剂为荧光嵌入剂。
20.权利要求19所述的方法，其中荧光嵌入剂选自：YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁单体、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭吖啶异型二聚体、单叠氮化乙锭、碘化丙锭、SYTO染料、SYBR绿1、SYBR染料、皮可绿、SYTOX染料以及7-氨基放线菌素D。
21.权利要求1所述的方法，其中加速剂为非嵌入荧光团。
22.权利要求21所述的方法，其中非嵌入荧光团选自：生物素、若丹明、Alexa染料、BODIPY染料、生物素结合物、硫醇活性探针、荧光素和衍生物，所述衍生物包括但不限于笼型探针、Oregon绿、若丹明绿、QSY染料。
23.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，加速剂为嵌入剂，其结合于沃森—克里克双链体的小沟和/或大沟。
24.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，25℃时的加速剂为液体。
25.权利要求24所述的方法，其中在步骤(1)，加速剂为一种溶于水的有机液体。
26.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，添加的加速剂为依照沃森—克里克双链体的缩合剂。
27.权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)，添加的加速剂为依照沃森—克里克双链体的解缩合剂。
28.一种检测三链体的方法，所述方法包括权利要求2所述的方法，并进一步包括其中检测三链体的附加步骤(3)。
29.权利要求1所述的方法，其中所产生的多链体为四链体，在步骤(1)，沃森—克里克双链体为第一沃森—克里克双链，以及在步骤(1)，单链分子的足够数目为2，这些单链分子位于第二沃森—克里克双链体中，以及在步骤(2)，四链体从所述第一和第二双链体中形成。优选地，步骤(1)利用两个已位于第二沃森—克里克双链体中的单链分子。
30.一种检测四链体的方法，所述方法包括权利要求29所述的方法，并进一步包括其中检测四链体的附加步骤(3)。
31.一种包括单链探针结合于双链核酸靶上的三链体，其中所述探针包括杂多聚体核酸或杂聚体核酸类似物，以及所述三链体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
32.权利要求31所述的三链体，其中双链核酸靶基本上保持其双螺旋结构，以及杂多聚体核酸或其类似物位于双螺旋结构的沟中。
33.权利要求31所述的三链体，其中杂多聚体核酸及其类似物的G-C含量分别介于10％-90％之间。
34.权利要求33所述的三链体，其中双链核酸靶基本上保持其双螺旋结构，以及杂多聚体核酸或其类似物位于双螺旋结构的沟中。
35.一种四链体，其包括：
含有第一核碱基序列的第一条链；
含有第二核碱基序列的第二条链，其中所述第二条链与所述第一条链通过沃森—克里克键结合；
含有第三核碱基序列的第三条链；以及
含有第四核碱基序列的第四条链，其中所述第四条链与所述第三条链通过沃森—克里克键结合。
36.权利要求35所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
37.权利要求35所述的四链体，其中(1)第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合，或(2)第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合，或(3)第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四条链之间根据同源碱基配对法则结合，此外第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三条链之间根据同源碱基配对法则结合。
38.权利要求37所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
39.权利要求35所述的四链体，其中(1)第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合，或(2)第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合，或(3)第二和第四条链以平行3’到5’的方向排列，并且所述第二和第四条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合，此外第一和第三条链以平行5’到3’的方向排列，并且所述第一和第三条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合。
40.权利要求39所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
41.权利要求35所述的四链体，其中(1)第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合，或(2)第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合，或(3)第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合，此外第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三条链之间根据沃森—克里克碱基配对法则结合。
42.权利要求41所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
43.权利要求35所述的四链体，其中(1)第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合，或(2)第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且这2条链之间根据同源碱基配对法则结合，或(3)第一和第四条链分别以反平行5’到3’和3’到5’的方向排列，并且所述第一和第四条链之间根据同源碱基配对法则结合，此外第二和第三条链分别以反平行3’到5’和5’到3’的方向排列，并且所述第二和第三条链之间根据同源碱基配对法则结合。
44.权利要求43所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
45.权利要求35所述的四链体，其中所述第一条链的各个互作碱基既与所述第三条链上的相邻碱基又与所述第四条链上的碱基特异性相互作用，所述第四条链上的碱基与所述第三条链碱基结合。
46.权利要求45所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
47.权利要求35所述的四链体，其中所述第二条链的各个互作碱基既与所述第四条链上的相邻碱基又与所述第三条链上的碱基特异性相互作用，所述第三条链上的碱基与所述第四条链碱基结合。
48.权利要求47所述的四链体，其中所述四条链分别为G-C含量介于10％-90％之间的杂多聚体。
49.权利要求2所述的方法，其进一步包括其中检测三链体的步骤(3)。
50.权利要求29所述的方法，其进一步包括其中检测四链体的附加步骤(3)。
51.权利要求49所述的方法，其中所述方法区分完全碱基配对法则匹配、单碱基错配或缺失以及2-碱基错配或缺失，并且区分三链体中的双链体和单链分子。
52.权利要求50所述的方法，其中所述方法区分完全碱基配对法则匹配、单碱基错配或缺失以及2-碱基错配或缺失，并且区分第一和第二沃森—克里克双链体。
53.一种检测三链体的方法，所述方法包括：
提供靶双链核酸或含有靶序列的核酸类似物，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基和至少一个嘧啶碱基；
提供含有核酸序列或核酸类似物序列的探针；
提供加速剂；
向介质中加入所述探针、所述靶序列和所述加速剂以提供含有三链体复合体的测试样品，所述复合体含有结合到所述靶序列上的所述探针，其中所述复合体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C；
用激发辐射照射所述测试样品以使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和力相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度；
其中所述方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针上提供信号猝灭剂。
54.一种检测三链体的方法，所述方法包括：
提供靶核酸或含有靶序列的核酸类似物，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基和至少一个嘧啶碱基；
提供含有核酸序列或核酸类似物序列的双链探针；
提供杂交加速剂；
向介质中加入所述探针、所述靶和所述杂交加速剂以提供含有沃森—克里克三链体的测试样品，所述三链体含有结合到所述靶序列上的所述探针；
用激发辐射照射所述测试样品以使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和力相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度；
其中所述方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针上提供信号猝灭剂。
55.一种检测四链体的方法，所述方法包括：
提供靶核酸或含有靶序列的核酸类似物，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基和至少一个嘧啶碱基；
提供含有核酸序列或核酸类似物序列的双链探针；
提供杂交加速剂；
向介质中加入所述探针、所述靶和所述杂交加速剂以提供含有沃森—克里克四链体的测试样品，所述四链体含有结合到所述靶序列上的所述探针；
用激发辐射照射所述测试样品以使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和力相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度；
其中所述方法为匀相分析，其进行无需在所述靶序列或所述探针上提供信号猝灭剂。
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