CN1289239A - 荧光成象内窥镜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个荧光内窥镜成象系统(40)。系统使用了第一和第二光源(60,61)提供检测的组织(16)的荧光和反射图象。安装在内窥镜(54)末梢端的一种成象装置(72)用来涉及两种图象。

Description

荧光成象内窥镜

相关申请

本申请要求1998年1月26日提交的美国临时申请序列号No.60/072,455的权利，其全部内容参考收入本篇。本发明的背景

下列内容涉及定位中空器官中癌变或癌变前期组织的激光诱导荧光成象内窥镜的发展。在初始临床研究中，对于结肠息肉，使用370纳米的紫外线光(UV)激发可视荧光(400-700纳米)，其光谱信号能区别正常和不正常组织。以前的内窥镜图象是通过使用安装在两端口标准(白光)结肠内窥镜的一个活组织检查端的光学模件获得的。光学模件使用石英光学纤维和相连的光学元件将紫外线光传递到组织，连接的石英光纤束将产生的荧光图象传递到内窥镜的最接近侧，其中有一滤波器除去大量反射紫外线背景光，然后荧光图象通过高增益CID检波器组捕获。

内窥镜收集结肠粘膜的自体荧光图象可用作检测结肠直肠癌(CRC)的前体的检查工具。荧光可用来区别正常粘膜和腺瘤。具体地讲，用几种不同激发波长使用单点接触探头测量光谱。

通过光学纤维探头获得几种激发波长的荧光光谱。一项体外研究实施了宽范围激发波长的研究，得到结论370纳米是区别正常粘膜和腺瘤的最优波长。使用腺瘤息肉作为异常结构模型的体外和体内研究已显示使用这种波长异常结构在460纳米具有较小的峰值强度，并且与正常结肠粘膜相比在680纳米可具有增强的荧光强度。并且，这些光谱不同点的形态上的要素已使用荧光显微镜法进行了研究。息肉中降低的荧光强度是由于其增加的构建，增加的脉管系统，及在薄层中胶原质的减少。红光增强是由于隐蔽细胞的增强的荧光而产生的，这可能是由较高含量的卟啉引起的。

本发明的简述

本发明涉及成象内窥镜，具体地涉及使用双通道电子内窥镜的荧光成象结肠内窥镜，其使用电荷耦合装置(CCD)芯片或安装在其末梢顶端的其他固态成象装置来收集白光图象。本发明的特别意义是这种芯片也可收集荧光图象，用比使用光学模块和增强的CID相机获得的信号大得多的信号将图象显示在内窥镜视频监视器上。这种结构可用来收集结肠异常结构的荧光图象。两种小的FAP息肉的视频图象已使用标准白光图象和未处理的荧光图象获得。

CCD检波器，其缺少增益增强作用，可检测较弱的荧光信号，其在强度方面比漫反射白光图象小6个数量级。此外，令人惊异的是反射的370纳米的激发光没有完全充满CCD，使荧光信号不明显。这是由于在低于400纳米波长时，CCD光谱反应很快地降至零。这样，CCD就可有效地用作为其自身的长通滤波器。其他成象装置可与滤波器一起使用，来减少与在可视区域中检测到的强度相比至少一半的在紫外线区域中所检测到的强度。

在这个具体实施中，CCD有270×328象素的分辨率及2.5毫米直径的物镜。图象以33毫秒的RGB格式收集。这个具体实施的优点包括：体外荧光图象在临床工作距离(内窥镜顶端和组织表面间的距离)为20毫米的情况下表现出信号-噪声比(SNR)约为34，这比使用UV模件/CID检波器获得的比率要好，其在相同的距离下SNR约为18。使用CCD消除了对光学模件的需要，大大地简化了系统设计。此外，它还避免了与UV模件在活组织检查通道中旋转趋向有关的问题。通过对白光和荧光图象使用相同的检波器和光学元件，可获得这两个图象的完美的重合。CCD的白光图象和光学模件的荧光图象之间的视差是一个很重要的问题。与UV模件的10,000个纤维相比，在这个具体实施例中的CCD包含88,560个象素，产生较高的总图象分辨率。在Pentax结肠内窥镜上的物镜比UV模件具有更好的成象性能。与UV模件的线传播函数的特征宽度400毫米相比，这个具体实施的透镜为200毫米。光谱内窥镜的总稳定性没有随着单UV照明纤维而显著增加。

实施的诊断方法可依据正常粘膜和异常结构之间的总荧光强度的不同。这样，在某些应用中其较好地收集了400-700纳米之间全波段的荧光散射。然而，精确的测量方法可使用点接触装置，这样诊断信息可通过在特异波长如460,600和680纳米下取样荧光来获得。对于许多应用荧光激发较好的范围是在350纳米和420纳米之间。用电子CCD内窥镜进行的内窥镜图象研究可包括使用彩色CCD内窥镜，其具有提供这样信息的能力。

本发明的图示简述

图1是内窥镜系统的示意视图。

图2是固态成象装置如在内窥镜末梢端的CCD的示意视图。

图3是依据本发明的内窥镜系统示意图。

图4演示了照明区域和荧光区域的相对大小。

图5是内窥镜系统的示意图。

图6是平均荧光强度及测量的和预测的信噪比(SNR)的演示图。

图7A和7B分别是正常结肠粘膜和腺瘤的14种框的平均和单一框之间的不同荧光强度的演示图。

图8是随着检测界限值的变化而变化的系统灵敏度示意。

图9和图10演示了有腺瘤的组织荧光强度分布图，包括移动平均值和百分比值。

图11是演示了腺瘤，正常组织的荧光强度图，以及随施加在探头部位的压力的变化而变化的强度比率。

图12是内窥镜系统，演示了内窥镜和接触探头之间的收集几何形状的不同。

图13是依据本发明的内窥镜系统的一个较好的具体实施。

图14A是依据本发明的荧光成象系统的一个较好的具体实施。

图14B图示演示了辐射功率与光源在光谱紫外线区域发出的输入功率的关系曲线。

图14C演示了获得荧光和参考图象的过程的时间图。

图15是依据本发明的荧光成象系统的一个较好的具体实施。

本发明的详细描述

方程描述了在内窥镜中由给定的象素收集的信号光子数Ns，和组织表面上的间隔距离d和径向距离p的关系，以及相应的SNR如下： $\mathrm{SNR}=\frac{N_s}{\sqrt{N_s+{\left(\frac{{\mathrm{\σ}}_e}{G}\right)}^2}}$

几何形状和某些符号在图1中作了描述。还要指出的是，散射波长λ_em，象素排列大小gxg，纤维光学传递效率T_i，滤波器散射波长的带宽Δλ，在这种波长区域内传递能量的组分T_f，包括长通滤波器，透镜和目镜的系统光学元件的收集效率T_o，入射光能量P_o(λ_ex)Δt,h是普朗克氏常数(Planck’s constent)，c是光速，f_p是纤维芯的填密组分，ε_t是组织的量子效率，N_f是分辨元件的总数。信噪比(SNR)是随电子噪声σ_c和增益G的变化而变化的。

结肠直肠癌是国家健康忧虑的一个重要问题。在美国结肠和直肠癌的死亡率和发病率仅次于肺癌。这说明当前的检查方法对于控制结肠癌的传播是不够的，并且在很长的时间内在检查方法方面仅有很小的进展。对于所有诊断出的患者5年的存活率为35-49％。结肠直肠癌对化疗和放疗反应相对较差，因此，较大安全性外科切除术是预防其生长的唯一可靠的方法。这些肿瘤的传播是通过直接扩增到邻近的结构内，并通过淋巴和血管转移。转移传播的最常见部位按秩序是区域淋巴节点，肝，肺和骨。

随着在隐蔽细胞中异常结构的变化，在结肠粘膜的上皮层中开始这种疾病的病理生理学状态。这种组织可通过结肠内窥镜检测，如果在早期阶段恶性化-前损害可被检查到，那么它们就可以移出作活体检查。大部分的结肠和直肠癌确信是由称作腺瘤息肉的可视前体损害产生的。这些良性集块由细胞核和细胞质的大小和形状发育不规则的上皮细胞的单克隆扩增产生的，一种已知为异常结构的情况。这些损害可使用结肠内窥镜发现它们增加的结构而检测出。医学上承认的腺瘤癌症序列说明结肠直肠癌症是由经历恶性转化的腺瘤组织产生的，相信是通过其中遗传变更积累的多-步骤的过程而产生的。在CRC的发展中存在前体阶段提供了一个能早期检测并将这些损害移出以预防将来发展成癌症的机会的窗口。

普遍的结肠内窥镜检查法为了定位用作活组织检查的腺瘤，是依赖于对结肠粘膜中大型结构变化的观察。然而，这种方法对于平坦的腺瘤组织是相对不敏感的。如诊断患有溃疡性大肠炎(UC)的患者，有很大的风险从组织的非-息肉区域发展成癌症。并且最近的研究已认定一些形式的腺瘤癌症是从小的表面的腺瘤产生的。由于这种风险，所以常用的结肠内窥镜检查必须对整个结肠进行多次活组织检查来实施。然而，在这些患者中的取样错误及漏诊的可能性给这种形式的检查带来很大的不满意度。而且，组织活组织检查的检验是耗时又昂贵的。并且，相当大的内-及外-观测者的偏差发生在异常结构的鉴定中。一个被诊断为异常结构阳性的患者常常必须回到诊所作进一步的检查并可能进行结肠外科切除术。这样，用组织学的解释，内窥镜检查法当前的状态是一门有缺陷的科学，需要具有更高灵敏度和特异性及较小内、外观测者偏差的改进的方法。

荧光内窥镜成象法提供了能克服当前检查法的使用白光内窥镜的局限的特性。这种方法对生化组成及组织表面下的微结构敏感。并且，与内窥镜结合，荧光特性能扫描较宽的区域，并能分辨亚次毫米范围的组织表面。如果在荧光上呈现足够的信息，计算机可用来快速地确定疾病区域的存在及位置。自体荧光法已演示了区别正常的和肿瘤的人类组织的能力。最初的研究显示单点荧光光谱能用来体外从几种类型组织中的检测肿瘤。随后，实施了体内研究检测膀胱，脑，结肠，子宫颈，食道，肺，口腔粘膜和皮肤。此外，随着使用外源试剂如血卟啉衍生物(HpD)，荧光法已用来区别正常的组织和患病组织。

从直肠到盲肠的全长通常为1.5米。从组织学上讲，粘膜是与内腔接触的层，厚度约为400μm。上皮层是最表面的层，包括有吸收力的柱状细胞和间歇产生粘液素的杯状细胞，其起到重吸收水和润滑的作用。这些细胞经历了连续的循环，并在隐蔽细胞底部由快速分离的干细胞替换，这是能观察到异常结构的最初迹象。周围薄层包含血液和淋巴毛细管，其支持着分泌，吸收和其他粘膜的高活性功能。其包括疏松结缔组织，特别是胶原质，以及大量的保护肠壁不受微生物侵害的炎性细胞。

肌粘膜由几层收缩以从腺体隐蔽细胞排除分泌物的平滑肌纤维组成，预防粘住，并通过维持上皮细胞和鲁米诺内容物的接触增强吸收作用。粘膜下层包括大量的血管，淋巴，和神经，并被密集的保持粘膜附着在肌肉层的胶原质结缔组织包围着。肌肉层包括内部环形和外部纵向肌肉层，它们涉及结肠的无意识蠕动收缩以传递排泄物的流动。外部的浆膜层包括含大量血管和神经的结缔组织。

腺瘤息肉是含不成熟的，具有不规则大小及形状的细胞核的分化差的上皮细胞的粘膜的凸出突起。这些损害是良性的，但它们具有转化成结肠直肠癌的潜在可能。不同的形态类型包括管状的，绒毛状的，和管绒毛状的腺瘤。尽管所有形式都是凸出的，但每种类型可以含有肉茎，称为有肉茎的，或者可以是半球形的，称为无柄的。息肉的恶性化可能最大是绒毛状的，最小可能的是管状的。并且，癌症发展的可能性随着息肉的大小增加而增加。约有1％机会在直径小于1厘米的息肉中发现入侵肿瘤，在直径为1-2厘米之间的息肉中发现入侵肿瘤的机会为10％，大于2厘米的息肉中发现入侵肿瘤的机会为45％。与这些息肉有关的亚-细胞改变常常与在溃疡性大肠炎中发现的异常结构在组织学上是一致的。

分子生物学研究的结果说明涉及腺瘤恶性化转化成癌症的步骤包括与几种肿瘤抑制性基因的序列遗失偶联的致癌基因的突变活化。并且，还发现在恶性肿瘤产生之前几种基因一定经历了突变。在肿瘤发生的过程期间，已确定了几种特异遗传变化。在50％结肠直肠癌的ras致癌基因中已发现活化突变。而且，在部分染色体5,17和18中确定出等位基因缺失，其可能包括肿瘤抑制性基因的遗失。

在称为家族性腺瘤息肉的情况中，在患者的结肠中诊断出有超过100个肿瘤息肉。这些人在成年时期具有易在他们的结肠中产生大量息肉的体质特征。大部分的患者有500到2500个息肉，平均有约100个息肉。FAP是一种罕见的疾病，在西方世界仅占CRC发病率的约1％。异常结构的病灶通常会变成恶性的，FAP患者必须在他们年轻的时候切除结肠。在这种情况下的一些人结肠癌发作的可能性在10岁时为10％，在20岁时为50％，在30岁时为100％。从组织学上讲，大部分的息肉是管状腺瘤，具有高可能性进行恶性化转化，并且与FAP息肉有关的异常结构与在散发息肉中发现的异常结构是一致的。常染色体显性遗传缺失是这种疾病发展的原因。

与家族性易患病体质有关的第二种形式的CRC是遗传性非息肉结肠直肠癌(HNPCC)。HNPCC是指两代中至少有三个亲属患有CRC，并且至少一个亲属在小于50岁时被诊断为CRC的患者。这种是比FAP要常见的多的形式，在西方世界中占CRC的发病率的高达13％。HNPCC患者没有大量的腺瘤息肉，并且它很难与散发病例区别。在这种疾病和染色体2上的匿名微卫星标记之间发现遗传连锁。

在溃疡性大肠炎中，粘膜经历了细胞学上的改变，导致在没有形成息肉的情况下形成异常结构。这些改变认为与慢性炎症的重复事件和结肠上皮细胞的修复有关，并且平坦的、界定边界较差的溃疡性肿瘤是常见的。患有UC超过八年的患者推荐进行伴随随机活组织检查的定期结肠内窥镜检查。这种检查过程不是很有效，因为仅有少于0.1％的总粘膜表面区域被取样。然而，指出这一点是很重要的，仅有1％的CRC的新发病率是由UC产生的。

UC是一种不知原因的结肠直肠粘膜的炎性病变。患有UC的患者有增大的风险发展成异常结构或癌症。对这种增大风险的发现产生了在最初出现症状后的7-10年开始结肠内窥镜检查措施。结肠检查措施包括结肠粘膜的直接宏观可视检查和接近粘膜活组织进行微观异常结构检查。尽管在1983年标准化了异常结构的病理分类，但有关异常结构的解释仍存在不同和矛盾。

异常结构通常是病灶性的。尽管在结肠内窥镜检查期间实施12-20个粘膜活组织检查，但仅有少于1％的结肠表面被取样，这样漏查异常结构小病灶的可能性是很高的。这样，癌症就可以在没有任何预先发生的或当前发生的异常结构的患者中发展。尽管在疾病第一个十年后对所有患者实施预防性结肠切除术会是对UC癌症问题的最权威性的解决方案，但只有最轻微或轻度症状的患者会可以理解地不愿实施这种基本方法。用组织学的解释，结肠内窥镜检查法仍是一门有缺陷的科学，需要具有更高灵敏性和特异性的改进的方法。

并且，研究已显示平坦的异常结构可能是不通过腺瘤癌序列产生的散发结肠癌的病源。在平坦非息肉粘膜中表面增殖的腺瘤的形态特征已由内窥镜观察到，为小斑样有模糊红色或污色的损害。在一项全面的研究中，33个这样的损害描述为轻微增高的、具有红色表面及中心凹陷的。癌症病灶或严重的不规则在直径不大于4毫米的损害中发现为25％，在测量的5到8毫米之间的损害中为40％，直径在9到10毫米之间的损害中为80％。

对于早期CRC的检查，有几种在实践中的方法，但每种方法都受到其有效性的限制。检查的目的是检测出无症状个体中局部的表面集块。

乙状结肠内窥镜检查包括临床医生使用硬的或软的成象装置检查患者的直肠或乙状结肠。这种形式的检查的根据是，发现60％的CRC出现在结肠末梢25厘米内。这种长度用硬的乙状结肠内窥镜可以达到，软的内窥镜可达到60厘米处。然而，最近的统计显示，这种装置达到的范围外发现了增加数量的肿瘤。这种方法的优点是，它可在患者没有实施麻醉或进行术前准备的情况下实施。检查这种疾病的最广泛的方法是结肠内窥镜法，其中患者先作术前准备并服用镇静剂。结肠内窥镜插入到经过全部长度的结肠，由医生在白光下观察粘膜表面检查息肉和其他不正常的集块。这种方法适用于确定增高的损害，但异常结构的平坦区域会检测不出。

通过吸收给定激发波长λ_ex的激光，生物分子的电子进入增高能量状态的过程出现组织的荧光。激发状态是不稳定的，电子会回到基础状态。通过分子碰撞大部分这种能量以热能损失，但小部分激发电子经历内在转化并自然地以较长散射波长的λ_em放射光。通过荧光释放能量的分子组成称为组织的量子效率，表示为ε_t。荧光强度取决于激发状态的初始组群的产物和组织量子效率。

光谱的谱线形状是由对组织的组成特异的生化分子的荧光散射和吸收作用确定的。独态的电子量被分成振动态和旋转态，在大分子中包括小的间隔，并由于分子的相互作用可以交迭。电子可以衰减成基础状态任何振动-旋转量，这样，生物分子的荧光光谱通常是宽阔的。在光谱中结构的缺少限制了能从荧光中获得的信息的量。产生荧光的组织成分已知为荧光基团，和内生发色基团包括脂肪族氨基酸，NADH,FAD，和卟啉。局部环境能对荧光散射有很大的影响，其可使波长淬熄或改变。有关使用自体荧光组织成像的其他详细内容可在美国专利No.4,193,142,5,421,337,5,452,723,5,280,788和5,345,941中可找到，这些专利的全部内容参考收入本篇。

评估在结肠中使用荧光所实施的第一步是确定体外在亚毫米范围内使用单点测量法，存在区别正常结肠粘膜和腺瘤息肉的最优波长。如，用分光荧光计记录4个正常结肠和11个腺瘤息肉的荧光散射。在10纳米步骤中，使用的激发波长范围在250到500纳米之间，将结果列在称为激发-散射矩阵(EEM)的排列中。得到正常结肠的平均EEM和腺瘤息肉的平均EEM的比率，发现在330,370和430纳米的激发作用产生含最大量诊断信息的荧光光谱。

根据这些体外的研究结果，使用370纳米的光实施临床试验评估荧光区别正常，腺瘤，和增生结肠组织的能力。在这项研究中，脉冲氮气-泵送染色激光器经过有一个激发光纤和六个收集光纤的光纤探头传递370纳米的激发光。这个探头经过结肠内窥镜的活组织检查通道插入，在内窥镜检查期间置于与结肠粘膜接触的位置。探头由排列围绕一个激发光纤的六个个体200μm的收集光纤组成。使用这种装置，检测约1立方毫米的组织区域的荧光散射。通过与OMA连接的光谱摄制仪检测荧光光谱。光谱在460纳米处显示出不同，其中正常的结肠产生的荧光强度比腺瘤大约6倍。这项不同几乎是在体外研究中发现的不同的两倍。在650纳米以上，腺瘤的平均值比正常结肠的平均值稍大。

从对20个患者的检测中得到，在460和680纳米的荧光强度位于分散区域，并且当与组织学相比时，直线向减小错误分类的方向移动。结论线正确地分类了31个腺瘤中的31个，4个增生息肉中的3个，和32个正常结肠组织样品中的31个。对于诊断腺瘤，这项技术的灵敏性，特异性和正预测值分别是100％,97％，和94％。因为仅有少量的增生息肉检测到，所以不清楚使用荧光是否能将腺瘤可靠地与增生息肉区别。在荧光中观察到的不同可能产生于息肉和正常粘膜间的不同，而不是产生于异常结构的变化。

接下来的步骤是使用从这项研究中得到的数据来提供评估荧光表现的预期方法。将数据随机地分成两个相同的组，根据在460纳米的荧光强度和680纳米和600纳米强度间的比率，第一组数据用来设计算法来区别组织类型。从每个点得到的组织的活组织检查从组织学上分类为腺瘤，增生的或正常的。从预期评定标准得到，对于诊断腺瘤，算法的灵敏性，特异性和正预测值分别为90％,95％和90％。

已作的进一步的尝试是使用337纳米激发光，在体内使用荧光区别正常粘膜，腺瘤息肉和增生息肉。使用单一光学纤维，从86个正常结肠部位，35个增生息肉，和49个腺瘤息肉部位测得荧光光谱。在390纳米和460纳米，荧光散射表现出峰值，这是由于在粘膜下层中的胶原质。并且，对于正常粘膜，增生息肉，和腺瘤，这个峰值强度上分别是减小的。发现正常粘膜的峰值强度比腺瘤的峰值强度两倍稍小。采用MVLR分析法，区别腺瘤和增生息肉的荧光的灵敏性，特异性，正预测值和负预测值分别为86％,77％,86％和77％。这项研究的结论是，荧光的不同是由于息肉的形态，而不是在息肉中荧光基团的存在。

在结肠中使用其他激发波长来研究荧光。通过OMA，使用单一光学纤维，在体外使用连续波He-Cd激光器传递325纳米的激发光测量从35个正常粘膜和35个腺瘤息肉获得的荧光光谱。正常粘膜的峰值强度出现在375纳米，而腺瘤的峰值强度出现在450纳米。多变量线性回归(MVLR)分析为每组数据点建立了一组分值以确定诊断标准。获取其他34个正常部位，16个腺瘤部位，和16个增生部位的荧光光谱，并使用建立的判定标准进行预期分析。这项研究区别正常和腺瘤组织的灵敏性，特异性和正预测值分别为100％,100％，和94％。此外，16个增生息肉中的15个被分类为正常的，这是正确的诊断，因为增生息肉是由上皮层的增厚而形成的。

还使用了410纳米的激发光研究结肠的荧光。使用分光荧光计，对从45位患者结肠内窥镜检查期间移出的83份活组织检查样品的450-800纳米的散射进行收集。从460-530纳米的散射带的强度从正常到癌症到腺瘤粘膜而下降。在460纳米的峰值强度，正常粘膜比腺瘤高约2.5倍。使用九个变量对光谱实施逐步判别式分析。与组织学相比的结果显示区别正常粘膜和腺瘤的过程的灵敏性和特异性分别为88.2％和95.2％。三个带的重合产生的荧光散射在约470,485和404纳米处集中。

这样，在最近5到10年中实施了评估使用组织自体荧光区别腺瘤和正常粘膜的更广泛的研究。体外研究中已得到结论，对于激发作用，330,370和430纳米是最优的。初步的体内研究结果显示，对于这种分辨作用，单点荧光检测的灵敏性，特异性和正预测值分别高达90％,95％，和90％。并且，数据显示内在的荧光基团可包括胶原质，NADH，和卟啉。血色素是吸收发色基团。为了使这项技术适用于临床安装，宽范围荧光检测和操作必须实时实施，并适合传统的白光内窥镜。这些要求需要发展光谱成象工具。

未染色冷冻片段的荧光缩影照片用来研究解释发出荧光的正常结肠粘膜和腺瘤息肉中的形态结构。从氩-离子激光器获得的351和364纳米光线用作荧光激发，散射通过一系列带有420,475,515,570和610纳米的截止波长的阻挡滤波器收集。通过单一观察者从1+到4+半量评定荧光强度。在正常粘膜中，从薄层中胶原质获得的、从420到700纳米光谱带的荧光评定为3+，相同散射带宽的粘膜下层评定为4+。在上皮层中，从吸收细胞观察到微弱的荧光，从杯状细胞中没有观察到。H&E染色片段鉴别正常粘膜的组织组成。连续未染色片段的荧光图象显示出荧光结构。在显示荧光结构的连续未染色片段的荧光图象中观察到不同。

在腺瘤粘膜的荧光显微照片中观察到一些不同。首先，在薄层中存在较少的胶原质纤维，致使从上皮层获得较小的荧光强度。还有，与在正常隐蔽细胞中观察到的+/-相比，在隐蔽细胞的细胞质中观察到的荧光量记录为2+。最后，在腺瘤中存在较大数量的荧光颗粒。H&E染色片段的图象包括从腺瘤息肉获得的隐蔽细胞。从连续未染色片段获得的荧光显示出可观察到的荧光量，在薄层中的嗜曙红细胞的量比正常粘膜中的量要显著地大。腺瘤息肉的粘膜下层评定为4+，其与正常粘膜相同。

已发展了一种描述从其显微照相源临床观察到的荧光的方法。这个过程将每种微观结构的内在荧光和其密度结合作为组织深度及入射和返回途径的光学混浊性的函数。然后从临床荧光光谱中获得的每种荧光基团的浓度可以被求出。在这种方法中，对于从正常粘膜中比从腺瘤中观察到较大的荧光强度的原因包括：(1)粘膜下层的荧光比位于上层的粘膜的荧光明亮约10倍。(2)粘膜消弱了进入的激发光和返回荧光；如果粘膜足够厚，那么位于下层的粘膜下层就不能有贡献，但如果粘膜层薄，如在正常粘膜中，消弱就较小，产生了较明亮的组织荧光。(3)此外，腺瘤的荧光强度比正常结肠粘膜的荧光强度要小，可能由于异常结构隐蔽细胞趋向替换薄层中的胶原质，其是支配性的荧光基团。(4)腺瘤表现出对370纳米激发光和返回荧光较大的消弱作用，是由于增加的富-血色素微脉管系统。

多光谱成象系统已发展出来，其可同时收集四个不同散射波长的荧光。在这种装置中。纤维光学内窥镜的出口穿过4个空间独立的干扰滤波器。通过多-监视器系统的可调节部分，四个图象排列在增强的CCD阵列的象限中，CCD或如在图2中所示的其他图象装置40，可有30,000个象素或更多。选取四个波长以优化正常的和疾病组织间荧光光谱的对比。用337纳米激发从人类尸体大动脉获得的荧光，传送从400,420,450和480纳米获得的散射产生无量纲对比函数。函数显示出动脉粥样硬化斑的值比正常动脉的值大4倍，使用假色重叠图演示结果。这种工具也能在荧光光谱区别鼠肿瘤和周边肌肉。有关这种系统的其他详细资料在Wang,T.D.等人的“从人类结肠腺瘤获得的荧光实时体内内窥镜成象”，SPIE 1998学报，3259，其全部内容参考收入本篇。

这种设计的分辨率受到图象束的纤维的限制。使用4个荧光散射波长提供了正常组织和疾病组织间的较大的对比，并提供了疾病检测过程发展中的机动性。然而，通过分离相似物中荧光散射，通过要素4减弱信号，从而降低SNR。并且4个光谱图象必须以不同角度排列在检波器上，其形成对图象重合的竞争。并且，使用多个图象的图象处理算法增加了计算时间，其不清楚荧光在4带包含无关信息。最后，在最接近内窥镜末端检测荧光图象，其具有临床使用重合白光以及操作工具的困难。

仅收集2个散射带的多光谱成象系统的简单模式已发展出来。这种设计用束分离设备将荧光散射分离到两个增强的CCD相机上。在442纳米处氦镉激光器通过光纤气管镜的照明束传递激发光。在2个带内滤过荧光散射光，一个在480和520纳米之间，另一个波长大于630纳米。排列两个光谱图象，一点一点的比强度来区别正常组织和疾病组织，并形成彩色图象。这种方法消除了照射光距离和角度的影响，以及组织反射特性的影响。彩色相机独立地装配以观察白光图象。在53位患者和41位志愿者中临床测试了这个系统，在328个部位将结果与传统的白光气管镜比较。一个的灵敏性为73％，其比在原位检测异常结构和癌症中的白光中发现的48％要大的多。两种方法发现有相同的特异性94％。

在临床系统中，用双通道电子结肠内窥镜(Pentax EC-3800TL)收集白光和荧光图象。这种模式包括两个活组织检查通道，直径分别为3.8毫米和2.8毫米。内窥镜的外径是12.8毫米，工作长度为1.7米。多-元件物镜的视域具有扩张半角为60度，焦距深度范围为5到100毫米。白光照射由300瓦短弧氙灯产生。对白光和荧光图象使用相同的检波器，可获得完美的重合。这种特点对于产生诊断重叠图是很理想的。

一个照射探头包括200μm核心直径光学纤维NA=0.40，与3毫米直径BK7玻璃显微镜头(F#=-1)连接。照射探头插入到一个工具通道中，顶端置于与结肠内窥镜的末梢端齐平的位置上。波型混频器夹在激发纤维的最接近端以最大化光的扩张角。通过leur锁将探头附着在结肠内窥镜的最接近端以防移动。将300毫瓦的功率传递到组织。CCD检波器(TI TC210)的光谱反应截止在约400纳米，在激发波长λ_ex=351和364nm³时是可以忽略的，这样就消除了需要长通滤波器以阻断从激发光来的镜面反射。两个工具通道使得光学纤维照射探头和活组织检查镊子可同时使用。图1演示了带有图象束20的内窥镜10的示意图，带有图象束20的内窥镜的活组织检查示意，和照射端口14。装置的末梢端定位在离组织距离d的位置上。涉及这个系统的一个问题是由照射系统产生的阴影。下面描述的本发明的一个重要特性是补偿组织16表面阴影的方法。

当使用白光照射时，由使用者将足蹋开关激活以阻断激发光，反之亦然，使用一对计算机控制快门(Uniblitz VS14)。对于获得每种荧光图象的整合时间为33毫秒。如图3中所示，临床荧光成象系统40包括试频处理器48，计算机44，监视器46，mavigraph 50,VCR 52，激光42，和结肠内窥镜54。

电子结肠内窥镜54使用CCD检波器在末梢端检测光子。本发明的一个重要方面是，在低于400纳米时，德克萨斯工具TC-210 CCD检波器的光谱反应下降的足够快，从UV激发作用中没有观察到漫反射。事实上，实质上没有比漫反射和荧光在强度上大几次方数量级的镜面反射被观察到。使这个系统成为可能的另一个方面是，在没有使用增强器的情况下，检波器有充分的灵敏性检测从结肠粘膜获得的荧光。因为检波器位于末梢端，光学传递效率仅由位于检波器和组织之间的多-元件物镜确定。本发明的这个具体实施的另一个显著特点是相同的芯片可检测白光和荧光图象，这样在假-色重叠图上可出现完美的重合。并且，对能防碍临床医生实施这种方法的能力的结肠内窥镜不需要修正。

这个系统的一个限制是芯片的带宽选择性和光谱分辨能力。TC210是单色检波器，收集全部可视光谱的荧光。在CCD前很难使用带通滤波器，因为光是在高达60度的角度收集的。然而，RGB检波器存在，其含有对红，绿和蓝光敏感的象素，能在3个框内产生荧光图象。然而通带由成象电路的集成电路制造商确定。应当注意的是也可使用门控机理，其需使用脉冲激光作为激发光源。其他激发光源包括CW激光和宽或窄带光源。

由开关76操作的电子成象系统的框图在图5中演示。氩-离子激光器60通过快门62传递UV光进入与位于结肠内窥镜的一个工具通道的显微镜头连接的头石英光学纤维中，而白光64通过开关66被传递到端口70的照射纤维中。一对快门62,55通过数字输入/输出(I/O)卡74由计算机控制。荧光和白光图象都由在末梢端的CCD 72检测。框捕集器78将荧光和白光图象顺序地数字化。主微机执行图象处理运算并显示假-色重叠图。Mavigraph用来将有重叠图的白光图象转换成能由VCR记录的格式。

图6中标绘图显示了用电子成象系统收集的从14个框的平均值获得的荧光强度。象素行从正常结肠粘膜显示。在中心SNR约为30，在外围其下降到约10。这样，对于区别正常结肠粘膜和腺瘤的工具噪声限制检测，全视域满足了4的最小SNR要求。

从荧光图象强度中的平均值获得的框-到-框的不同可在图7A和7B中看到，其显示了沿象素行在单一框的值与14个框的平均值相比两者之间的不同。在图7A中标绘图是图6中所示的正常样品的图，在图7B中的标绘图是中心含有腺瘤的粘膜样品的图。与正常和腺瘤组织间的荧光强度的不同相比，平均值的变化较小。这样，从象素-到-象素的不同产生的假正值的存在率就较小。

人为图象拖影出现在电子成象系统获得的荧光图象中。这种人为图象的产生是因为当CCD行被电子读取时，UV激发光没有被阻断，其在正常的白光照射下通过旋转轮使用空间独立的滤波器实施。这种人为图象可在图象数据的处理软件中除去。

实施研究以确定能安全地传递到结肠粘膜上的UV光的量。顺序地收集白光和荧光图象。收集从30个患者的14个结肠腺瘤和6个增生息肉中获得的荧光图象。最后，用单点EEM光谱收集类似物中的荧光图象。从这些研究中，对荧光图象收集的实时执行的效力，处理，和随着结肠中移动的显示进行评定。此外，评定存在于结肠粘膜中的人为源如粘液，大便，及术前准备。还有，解剖结肠使得它按所需以大入射角收集图象，确定使用这些限制的移动平均数算法的效力。最后，将荧光图象的强度与从单点光学纤维探头获得的相比。

使用的激发光源是Coherent Innova 328。这种激光定额1瓦UV，需要60安培208伏电力及3加仑/分钟的水。激发光连接到光学纤维装置中，装置包括需将激发光传递到结肠内窥镜末梢端的12.5米和16.5米长的纤维。

首先，激发光纤必须插入到结肠内窥镜中。接着，使用一种方法在白光和激光照射之间快速开关。最后，必须实施一种白光图象快速并精确地重合荧光结果的方法。

结肠内窥镜方法包括对患者使用混合4盎司水的3盎司舰牌磷杂苏打的术前准备。用370纳米激发光，在结肠粘膜上使用光纤接触探头不能从术前准备混合物检测出荧光。

使用电子内窥镜，在常规结肠内窥镜检查期间，体内顺序收集白光反射和荧光图象。白光图象可包括红色的动脉脉管模型，和蓝色的静脉轮廓。镜面反射的斑纹在较低的半个图象中可以看到。正常粘膜的荧光表现均匀，随着荧光强度的降低散布着动脉的模型。这种结果是由于血色素对荧光散射的吸收作用。静脉没有出现在荧光图象中，实质上没有从激发光来的镜面反射。在荧光上的照射区域比在白光上的要稍小，如在图4中所示。

一个实例演示了腺瘤息肉的图象收集，处理，评定的过程。从位于正常中的散发息肉中获得的白光内窥镜图象显示了带有约5毫米直径可视结构特征的息肉位于接近中心的较低的半个图象中。在原荧光图象中腺瘤表现为围绕较明亮的中心区域的降低强度的区域。

这种图象与其自身的移动平均数图象相比，乘以100得到百分比图象。在60％,75％和90％处得到的处理过的荧光图象上的界限值用来确定界定有不同含异常结构可能性的粘膜的区域的轮廓线。然后将轮廓线用假色填充突出要作活组织检查的组织区域。假色红，绿和蓝分别指定为在白光图象中具有大、中和低可能性的区域。发现组织上是腺瘤状的息肉。

显示疾病的重叠区域包括一个位于腺瘤部位的区域，和其他两个区域是由粘膜折叠产生的阴影。阴影表现为荧光图象上降低强度的区域。这些结果可通过直接将内窥镜常态置于粘膜表面而最小化。并且，从阴影产生的重叠区域随着内窥镜与组织表面间的角度变化而发生大小和形状上的改变，而那些产生于腺瘤的重叠区域大小保持不变。

从实施常规结肠内窥镜检查的、总数为30位的患者处收集白光和荧光图象，包括从14个腺瘤和5个增生息肉获得的图象。对每个腺瘤和一个邻近正常部位进行活组织检查。用移动平均数算法处理荧光图象，检测的灵敏度确定为范围从55％到90％的界限值的函数。灵敏度的结果在图8中标绘出。

结肠粘膜的自体荧光图象可在体内通过内窥镜收集，并能用来鉴别和定位腺瘤息肉形式中的异常结构。荧光图象的SNR通常超过30。通过高灵敏性的荧光算法正确地鉴别腺瘤。如在图8中所示，当以常态入射光收集图象时，体内检测的灵敏度与体外研究中获得的灵敏度是可比的。在界限值为75％时，与体外试验的灵敏度92％相比，结肠腺瘤的检测灵敏度是86％。为了确定特异性，必须确定真负值和假正值。然而，真负值(假正值)是在荧光上发现是正常(疾病)的正常粘膜的区域。这些结果没有得到是因为附加的活组织检查会产生附加的穿孔的风险。而且，从增生息肉获得的荧光，不是异常结构，没有从移动平均数算法中得到疾病区域。

比较图象大小，体内图象包括10×10平方厘米的粘膜区域，而在体外研究中的结肠粘膜的样品仅有2×2平方厘米。在这样大的视域中，结肠包括许多粘膜折叠，并且这些组织层阻断了激发光到达位于其后的正常粘膜。这样产生了阴影。这些折叠在体外研究中不存在。处理过的荧光图象上的诊断错误主要由于这些阴影。使用的荧光方法依据是正常粘膜和异常结构粘膜之间的强度差异。然而，在没有异常结构存在的情况下，阴影表现为降低强度的区域。这种人为事故可由荧光激发几何形态解释。荧光激发光由位于活组织检查端口中的一根光纤方便地提供。这种工具通道的中心距CCD检波器的中心8.3毫米。另一方面，白光图象由中心位于距检波器仅3.8毫米的两根光纤照射。这样，在白光图象上的阴影没有在荧光图象上的明显。

荧光技术使用单一荧光散射带检测腺瘤。当在体外将结肠内窥镜以常态入射置于损害上时，这种方法实施良好，没有粘膜折叠存在。然而，荧光原型临床应用期间，内窥镜的视线常常被腺瘤的边限制。因为结肠是管状结构，一些腺瘤在解剖学上位于实际上不可能使内窥镜以常态入射朝向损害的部位。结果，损害的一边可能没有被正常结肠粘膜围绕着。另一种情况是正常粘膜距产生荧光强度比腺瘤产生的荧光强度足够大的位置太远。

从原图象测定荧光强度。在腺瘤内的三个部位(在表3中列为左，中，右)获得标准化的强度值和强度比率。图9中标绘图包括腺瘤的荧光强度轮廓，分别表示原荧光和百分比值。腺瘤直径约为8毫米。在荧光上，损害位于标在横坐标上的11毫米和19毫米之间，其在图9中邻近x-轴的位置用垂直线标出。大部分腺瘤在损害中心表现出单一荧光强度最小值；正常象素和疾病象素间的平均比率分别为中心1.8±0.5，左边中点为2.0±0.6，和右边中点为2.0±0.7。在这些部位的平均强度比率为2.0±0.6。这种方法的结果显示，体内荧光研究中的正常结肠粘膜和腺瘤间的不同与体外研究中的非常相似。

同样地，从原图象中测量增生息肉的荧光强度。在息肉内的三个部位(在表3中列为左，中，右)获得标准化的强度值和强度比率。图10中标绘图包括增生息肉的荧光强度轮廓，分别表示原荧光和百分比值。增生息肉直径约为5毫米。在荧光上，损害位于标在横坐标上的17毫米和22毫米之间，其在图10中邻近x-轴的位置用垂直线标出。增生息肉在整个与正常结肠粘膜连续的损害中表现出近似均匀的荧光强度。正常象素和疾病象素间的平均比率分别为中心1.1±0.1，左边中点为1.2±0.1，和右边中点为1.1±0.2。在这些部位的平均强度比率为1.1±0.2。因为这个平均比率值没有比正常粘膜的平均比率值有显著不同，所以使用这种强度值方法会鉴别出没有疾病区域是不令人吃惊的。

在体内图象中，脉管模型清楚地显示在白光和荧光图象中。在体外图象中脉管不明显，可能是因为有生命力的结肠的血液供应不再是完整的。血液中的血色素是众所周知的光的吸收剂，产生弱荧光强度的线性模型。这样，从血液脉管的原荧光图象测得强度。如在表3中所示，从血液脉管测得的强度比率是1.3±0.1。这个值比从腺瘤测得的平均值显著地小，这样，在重叠图上血液脉管会不以人为源存在。而且，根据它们的形状可使用图象处理方法除去血液脉管。在表3中，对腺瘤，增生息肉，和血液脉管的强度比率进行归纳比较。

内窥镜图象和单点光谱都能提供有关组织生物化学的有价值的信息。每种方法有它自身的优点和不利之处。内窥镜收集图象，并提供亚次毫米分辨率的空间信息。正常粘膜和腺瘤之间的荧光强度可以从相同图象区域在毫米片段内相互比较。还有，可远距离收集荧光图象，这样在整个图象区域组织上的压力是均匀的。然而，用荧光获得光谱信息更困难。因为涉及较大区域，除了使用较大的激发功率，荧光能量在每个象素上会变得太弱而不能维持充分的SNR。

在另一个方面，单点光学纤维接触探头从直径仅约为1毫米的区域收集荧光。使用增强光学多-通道分析仪(OMA)，使用好的光谱分辨率和高的SNR可测定宽带宽光谱。然而，探头必须放置在粘膜上的几个部位以取样测试正常和腺瘤之间的不同。通常，取样的正常粘膜距腺瘤几厘米远，绝对强度的比较会由于距离受到生物变异性的影响。

在体内测定期间，探头在息肉上的接触程度可以是变化的，因为结肠的肌肉组织不停地收缩和扩张。结果，产生运动使得探头定位困难。腺瘤是园的并且光滑，结肠壁的运动使得完全接触息肉表面非常困难。而且，光学纤维的末梢端不是平的，而有一个17度的倾角。这样，倾斜边的方向也会影响接触程度。

结肠内窥镜方法的结果显示，将探头放置在息肉上收集全部EEM所需的0.5秒时间是很困难的。在围绕腺瘤的正常粘膜上观察到表示激发光源的不同颜色的光逃逸。这种观察结果说明将激发能量传递到息肉上和对荧光散射的收集是不完全的。探头接触被粘膜的生理运动阻碍，被平坦的探头放置在光滑的、半球形表面的事实阻碍。对于在正常粘膜上收集光谱，接触不是问题，因为这个表面是平坦的。

而且，正常粘膜强度和腺瘤强度之间的比率也能受到施加在每个部位上的不同压力的影响。一项体外试验在包含一个腺瘤的结肠粘膜的切除样品上实施。在光谱范围为400到700纳米之间测定荧光强度与穿过结肠内窥镜活组织检查通道的探头所施加压力的关系。用天平测定压力。如图11中所示，荧光强度随着压力的增加而增加，如果在正常部位和腺瘤部位施加的压力相同，那么强度比率不变。然而，其在临床获取光谱期间通常不是这样。正常粘膜相对平坦，用几克的压力测定就能在实质上完全的探头接触下实施。在另一个方面，在息肉上的压力不可能使用的与在正常部位上的一样，因为探头会滑掉。在正常部位上的压力估计约为5克，而在腺瘤上的压力估计接近零。这样施加在正常粘膜上和腺瘤上压力的不同可能致使强度比率从2增加到3，如在图11中所示。

并且，在结肠内窥镜方法的记录图象上，在收集光谱期间，正常粘膜在探头放置的部位上显示出锯齿状。这种观察结果证实了在数据收集期间有几克的压力施加在正常粘膜上的估计。在另一个方面，当任何显著的压力施加在息肉上时，观察到探头从息肉上滑掉，这是由表面的潮湿造成的。这样，施加在腺瘤上的压力是明显较小的。

体外实施另一种方法比较在图象和单点上测定的正常粘膜和腺瘤之间的荧光强度比率。获得含有两个腺瘤的结肠粘膜的切除样品的白光和荧光图象。在图象和单点上测定直接邻近腺瘤的7个正常部位的强度。结果包括标准化的强度，这样每个系统的平均值是100。这个步骤可使在每个点上进行直接比较，显示强度彼此在约10％的范围内。并且，在图象上标准化的强度值范围为从68到155，在单点上范围为从63到136。这样，在正常粘膜上测得的强度取决于用两种方法取样的部位，并且是可以变化的，系数超过2。

在表4中，在图象和单点上确定了两个腺瘤的标准化强度和强度比率。这些数值是在腺瘤的中心和左边和右边中点确定的。对于左边腺瘤，在图象上平均强度比率为1.43，在单点上为1.54。对于右边腺瘤，在图象上的平均强度比率为1.52，在单点上为1.72。这些结果显示体外的图象和单点之间的强度比率只有很小的不同。

给定成象系统和单点的不同的激发光和收集几何形态，由Monte-Carlo模拟法计算荧光强度比率以确定荧光强度比率。在图12中，演示了内窥镜100和单点探头102的收集几何形态的示意。内窥镜包括2.5毫米直径的物镜104，它悬空位于离组织表面距离20的位置。这种几何形态对应收集角为40度。探头包括与组织16接触的石英护罩。经护罩106光学纤维位于距组织表面2毫米的位置，收集光NA=0.22，其对应的收集角为12.7度。结肠粘膜对于激发和散射波长的光学参数在表2中列出。

在模拟法中使用的激发光是扩张角为0度的无限-细光束。从均匀粗度激发光束获得的组织上一点的荧光强度，可以由从无限-细激发光束的重叠收集到的荧光来确定，无限-细激发光束是从要测定的点的远距离上被增量替换的。然而，这个结果等同于在视域范围整合荧光强度。组织的LSF在几毫米内下降很快，这样，模拟法在表5中指定的收集角范围内整合2毫米区域。模拟的结果按照在组织表面收集的光和激发光之间强度比率显示。在表5中，对于内窥镜和探头，正常粘膜和腺瘤之间的强度比率分别是3.0和2.9。内窥镜和探头强度比率相似，一个与体外研究一致的结果。内窥镜的强度比率比探头的强度比率稍高，这与内窥镜的收集角较小是一致的。从高荧光粘膜下层来的光更可能达到有较小收集角的检波器。

发展一种模型来定量在视域范围以常态入射角由内窥镜成象系统收集的光子数。对于白光反射和荧光图象这个结果都是有效的，并能适用在纤维光学成象束和电子成象系统。照射和散射轮廓的空间分布在其中心，朝着图象的外围下降。当与检波器噪音统计结合时，图象的SNR也可以确定。这项分析显示距离和光学收集几何形态产生了其中在外围的SNR常低于中心的SNR的轮廓图。对于发展确定组织损害的算法，这个参数是必需的。还有，发现收集的光强度随着内窥镜末梢端和组织之间的距离的平方而下降。并且，由附属成象束收集的光受到光学纤维的孔径数限制。这种分析工具可用来设计荧光成象系统的光学参数，并鉴别激发荧光所需的光源种类。

内窥镜成象模型发展的方法用来确定构建两个荧光成象系统需要的激发光源，光学元件和检波器。首先的设计包括用增强的CID相机检测最接近端的荧光图象的纤维光学结肠内窥镜。使用一个400纳米的长通滤波器阻断反射的激发光，位于结肠内窥镜外端的石英光学纤维进行图象激发。其次的设计是对首先的设计进行修正以适应临床应用的要求。这个系统使用带有双工具通道的电子结肠内窥镜，检测在末梢端的荧光图象。使用低于400纳米的CCD检波器的截止光谱灵敏度，以避免反射的激发光。带有高NA石英光学纤维的照射探头与显微镜头连接并插入到一个工具通道中进行图象激发。在两个系统中，激发光源是氩离子激光器，其以约300毫瓦，λex=351和364纳米传递，带有框捕集器的微机用来获得，处理，及显示诊断图象。

人类结肠腺瘤的自体荧光图象体外用高SNR的纤维光学系统收集。对于结肠壁的宽范围监测，有100平方毫米大的粘膜区域必须被照射。并且，远距离收集内窥镜图象，收集的强度随着距离d的平方而下降。预先，从照射区域约为1平方毫米的接触探头收集荧光光谱。这项研究的结果显示使用在这种设计中的激发光源，光学元件，检波器能收集具有充分SNR以区别正常结肠粘膜和腺瘤的自体荧光图象。在纤维光学系统中，达到了超过30的SNR，其超过了最小SNR需求7。

然后从体外切除结肠粘膜样品收集荧光图象，以评估这项技术对异常结构宽范围监测的潜在应用。对从患有包括息肉和非息肉腺瘤的家族腺瘤息肉的三个患者中获得的结肠切除术样品进行研究。由于距离和工具的光收集效率的不同，通过标准化将每个原图象进行修正成空间平均图象。然后使用强度界限来鉴别粘膜的疾病区域。检测异常结构的灵敏性和特异性取决于所选取的界限值。对于平均常态强度设定界限值为75％时，得到灵敏性为90％和特异性92％。正常粘膜的平均荧光强度发现比腺瘤的大，系数为2.2±0.6。这些结果说明了这项技术指导活组织检查部位选取的潜在应用。

从体外研究得到的结果提供了进行体内研究的动力。使用电子系统收集从体内结肠腺瘤得到的自体荧光图象。在这个系统中，SNR也超过了30，超过了最小SNR需求4。从实施常规结肠内窥镜检查的30位患者的14个腺瘤和6个增生息肉收集荧光图象。荧光图象收集在33毫秒的框内，并通过用移动平均数图象划分原荧光图象来处理。处理过的图象显示出可能含有腺瘤形式异常结构的粘膜区域，如组织学上所验证的。对于平均常态强度设定界限值为75％时，得到检测腺瘤的灵敏性为86％，增生异常的特异性为100％。平均来讲，正常粘膜荧光强度和腺瘤荧光强度之间的比率为2.0±0.6，正常粘膜荧光强度和增生息肉之间的比率为1.1±0.2。当结肠内窥镜以常态入射时，在荧光上的疾病区域与在白光上的腺瘤完好对应。在用较大角度时，阴影会有较大影响。这些结果显示异常结构可以在体内在荧光上鉴别。

在单点光学纤维接触探头研究中，在460纳米的正常结肠粘膜和腺瘤之间的荧光平均强度比率约为3，而在内窥镜成象检查中这个比率测定为2.0±0.6。荧光图象和单点的体外测定的直接比较显示，在图象中测得的强度比率与从单点测得的强度比率相比，它们之间只有小的差别。有两种可能性能解释两种方法之间强度比率的差别。首先，用单点方法测得的比率3是在体内实施的。体外可能会得到较低的比率，因为血液流动的损失，已知血液流动吸收光。

另外，比率的不同可能由于接触和压力的人为因素，结肠内窥镜方法的录像带显示，将探头放置在息肉上收集全部EEM所需的0.5秒时间是非常困难的。表示激发光源的不同颜色的光可观察到，这说明将激发能量传递到息肉上和对荧光散射的收集是不完全的。探头接触被粘膜的生理运动阻碍，被平坦的探头放置在光滑的、半球形表面的事实阻碍。对于在正常粘膜上收集光谱，接触不是问题，因为这个表面是平坦的。并且，增加的压力发现提高了收集的荧光强度。施加在正常粘膜上的压力比施加在息肉上的压力要高。当施加任何显著的压力时，就会看到探头从息肉上滑掉。体内接触和压力的不同导致了正常粘膜和腺瘤之间的较高比率。在另一个方面，远距离收集荧光图象，对于正常粘膜和腺瘤压力和接触参数是一致的。

最后，临床研究的结果确定改进荧光内窥镜图象的灵敏性和临床应用的未来方向。阴影人为因素可通过使用两个白光端口照射组织来降低。这种修正可通过用石英替换玻璃纤维获得，这样可使白光和激发光都被传递。并且，阴影人为因素，入射角，及检测率都能通过收集包括两个或多个荧光图象的多-光谱图象来改进。最后，同时收集EEM光谱可用来确定产生较高强度对比比率的新的激发波长。

异常结构组织表现出红色荧光增加，其可检测的以改进疾病检测的灵敏度。这样另一个具体实施包括收集多散射波长。收集多荧光散射波长的一种方法是，使用带有对可视光谱的红，绿，和蓝(RGB)区域敏感的CCD检波器的电子内窥镜(如，Olympus，模式CF I OOTL)。从每个RGB框获得的荧光图象可被捕获，处理，提供出使用在诊断方法中更详细的信息。而且，使用不同波长的图象的光谱谱线形状信息降低了所有几何形态的失真。TI TC224在640纳米时量子效率为30％，在480纳米时为15％(TI手册，1994)。由370纳米图象数据和EEM数据推断，预计红光中SNR为10∶1，蓝光中为50∶1。

在电子结肠内窥镜的末梢端实施检测有许多实际优势。首先，对于白光和荧光图象可使用相同的检波器。单一检波器不仅产生两个图象的完美重合，还避免交换相机的需要，交换相机是很麻烦的。其次，较少的光学元件产生了比纤维光学成象束显著高的荧光光子的传递效率。再次，CCD象素的填密的几何形态使得检测有最小的表面积损失，不象纤维光学成象束是六边形的填密排列。

虽然使用末梢端位置的CCD检测荧光图象有优点，但用最接近检测的纤维光学成象束也有优点。末梢CCD的光谱带受末梢检波器的RGB反应限制，而由纤维光学成象束收集的荧光可被滤波成无限制量的光谱图象。还有，在最接近处检测的荧光图象可以容许使用门控式增强器检测。这种装置能使用脉冲激光。

EEM研究提供了有关新的成象措施的有价值指导。结果显示接近410纳米的激发是有用的。与用我们当前的激发波长获得的正常组织和腺瘤组织之间的对比相比，由蓝色荧光提供的对比大大地增强了(10∶1对2∶1)。此外，腺瘤的红色荧光相当明显。使用λ_ex=365纳米到这种新的激发波长而发展出的形态模式的结论的推断显示，蓝色荧光包括有关隐蔽细胞拥挤和粘膜厚度的信息，红色荧光包括荧光隐蔽细胞异常结构的信息。因此，在红色和蓝色散射波长处收集图象应提供高对比的诊断图象和显著新的组织上的信息。此外，比率图象能用来标准化除去阴影影响。成象研究的下一个阶段会使用410纳米的激发光。氪-离子激光器(Coherent Innova模式302)会在407和413纳米两组处提供500毫瓦功率。这种量的功率对在红光和蓝光带获得大的荧光信号是足够的。这种激光器会与现有的365纳米的氩-离子激光器一起安装在BWH激光实验室中。

此外，可以使用多激发波长。一种方法会使用氪离子激光器的407和413纳米组激发光来激发红色荧光，并保留氩离子激光器的365和351纳米组激光来激发蓝色荧光。两个硬件构造包括(1)在观测设备和相机之间有可换向的滤波器轮的纤维内窥镜，(2)双芯片内窥镜。这样的系统已被发展出，如由美国医院有限公司发展的内窥镜的立体视景。可用光谱截止机理修改芯片上的一个窗口。红光敏感成象通道的时间选择可与激发光同步。

可研究407-413纳米的满反射图象以获得有关组织血色素含量的信息。这个图象可通过在白光源前安装一个在旋转轮上有适当带宽的滤波器来获得。这种方法是在红光和蓝光框内将这种反射图象和荧光图象比较。为了发展所需的算法，并决定如何优化收集的光谱信息，可用410纳米激发光的广泛的接触探头实施研究。

使用365纳米激发光的宽带强度算法得到的阴影人为因素可以通过使用改进的激发光几何形态大大地降低。当前，激发光是通过距CCD检波器8.3毫米的位于活组织检查通道中的单石英纤维传递的。使用距CCD芯片远距离的单照射光束会增强阴影。相反，在由这种结肠内窥镜产生的传统白光图象中，通过使用对称位于CCD芯片相反边上的两个间隔近的白光照射光束来最小化阴影。通过用石英纤维替换照射纤维，UV光线可通过两个白光照射端传递，两个白光照射端仅离CCD检波器3.8毫米。实施这项措施需要修改视频处理器，以能轮换将白光和激光激发连接到照射纤维。

其他光谱内窥镜改进可包括：(Ⅰ)通过反馈控制调节组织表面的激发光强度。这可提供连续的照射，与观察距离无关，对患者安全也是很重要的；(Ⅱ)通过在使用在内窥镜白光源中的检波器轮的“空白”时间段调节荧光激发出现的时间，最小化在白光内窥镜成象显示上荧光激发的拖影影响。激发光的反馈控制可通过测定荧光图象上的平均强度来实施。这种平均值强度将会用来调节快门或滤波器轮的开启时间。通过使用同样的滤波器轮阻断用来在白光模式上产生RGB照射的激发光，拖硬影响可以完全被除去。

如上所述，大型氩离子激光器用作近-LTV激发光源进行成象研究。尽管对于这项研究是足够了，但这种光源昂贵并体积庞大，只能在不连续的波长下操作。这样的激光系统由于其特殊电力和水冷要求不能方便地移动，阻止了在多个部位的使用。选择性激发光源可以考虑，其包括脉冲激光和带有检波器的白光源，两种都是小巧的并可运输。

对于适合近-UV激发的应用，使用脉冲ND：YAG激光器，因为它可在355纳米提供三次谐波辐射对光谱成象有充足的平均功率。在体内和体外研究中，用300毫瓦的激光功率获得好的SNR，其对应每fi-ame 10毫焦耳能量。因此，在30赫兹操作的在355纳米300毫瓦平均功率的5-10纳秒脉冲持续时间的三倍频率的ND：YAG激光器是足够的。使用CCD相机门控在约10纳秒，这种短激发脉冲能同时获得白光和荧光图象。在这种短时间门内白光背景是可以忽略的，避免需要遮住白光照射。这种激光器没有特殊功率或水的要求，使用这种激光器的荧光内窥镜系统会方便运输。

水银灯也可用作激发光源。这样的光源小巧并轻便，可以提供很多波长的明亮的窄带宽的照射。使用这种轻便光源简化了系统设计并降低了成本，能制备较便宜单元设备使用在多个部位。关键的问题是，在所需的波长范围内是否有足够的光能连接到照射纤维中。购得的150瓦氙灯的白光光源能传递80毫瓦那么多的白光到末梢端。使用50纳米激发带宽的光源，约20毫瓦的光能用来诱导组织荧光。

在所选取的波长处，水银灯有比氙灯高5到10倍的输出功率。这说明使用有相当小灯丝的500瓦水银灯，至少300毫瓦有用的激发光应传递到照射纤维的末梢端，对于从结肠组织收集高质量的荧光图象应是足够的。此外，为了进一步增强SNR，照射的总面积可以减少，或者成象元件可以装在一起。为这种应用可选取具有适合的亮度，稳定性和最小电干扰的灯及电力供应。

目前，图象处理方案根据的是对比原图象和空间-平均图象，使用界限值标准分类组织区域为正常的或疾病的。无论息肉大小，观察角度和距离，平均窗口和检测界限值是预弯曲的(pre-flexed)。这些预定的值限制了能精确测定的息肉的范围。改进的图象处理和界限方法会使用空间平均的不同的窗口大小及不同的界限值。从原数字化图象中得到的有关图象中最大损害的直径的信息会用来确定这些参数。这种随着图象区域中损害的变化而变化的窗口大小的改变会最大化强度比率，并优化荧光方法的表现。

也可研究从多变量图象中得到信息的图象分析方法。多变量图象是用不同变量测得的相同物体的一组叠合的图象，如反射的波长，或荧光或Rainan带强度。对于分析多变量图象有许多方法是可用的，并且它们能修改而适用于图象分析。通常，接下来有三个步骤，图象处理，目标分割，及对比测定。图象首先根据所选取的操作进行处理，如移动窗口平均数，强度差异或比率。处理过的图象然后根据频率和强度信息被分割。这个步骤可通过界限，快速/慢速下降，或区域生长来实施。这些方法可以依据概率方案与伴随鉴别和损害显示结合。

当收集多个光谱图象的技术发展了，这样的图象的数据库建立了，更先进的图象分析方法，如主要组成分析和回归分析可以使用。主要组成分析没有假定一个已知(由原因推出结果)的分布，而是使用了一组校准数据以得到有关表现出恶性化前变化的结构的信息。回归技术依据的是建立两组变量间数学关系的原理，如一些自变量和一个或多个因变量之间。例如，对数回归将图象中的光谱强度和异常结构损害的组织病理学相互关联。

荧光成象内窥镜的发展已证明了使用荧光实施宽范围监测结肠内窥镜方法的潜能。荧光图象可以进行实时分析，并能提供给内窥镜检查者一个使用预先证实的算法确定的异常结构可能性的即时解释。此外，指导活组织检查的能力可与本发明一起使用。在患有FAP的患者中，荧光成象可用来将粘膜活组织检查指向内窥镜正常-显示(非息肉)，但根据它们的光谱特点具有增加的可能性是异常结构的区域。对活组织检查的组织病理学评估会与光谱数据相关联以验证“平坦”异常结构的检测。

下面的方法可用来确定荧光成象系统指导活组织检查的能力。结肠壁的全部表面，在结肠内窥镜检查中的及使用在结肠切除术中的切除样品，进行系统成象，并分离诊断为异常结构选作直接活组织检查的区域。诊断为良性的随机区域也可取样，通过组织分析证实光谱诊断。并且，并发症的影响如炎症也可进行研究。一旦成象算法已被验证，它可适用来检测患有UC的患者的异常结构。如在接触探头研究的情况中，UC的诊断算法一定能评估患有不同程度的背景炎症的患者。对用接触探头EEMs研究的相同患者组进行荧光成象研究。宽范围荧光监测的一项重要的潜在优点是，在结肠内窥镜传统监测期间获得的一个或多个不同的随机活组织检查可能由荧光成象的结果指导。那些活组织检查可从随机活组织检查的剩余物中分离，来评估是否荧光成象能增加对随机样品异常结构的检测率。

快速EEM和光谱成象系统的发展代表了在仪器使用方面的两个非常重要的进步。两个系统是互补的。成象系统实时观察宽范围的粘膜，EEM系统提供一个给定结肠粘膜部位的完全的光谱特征。适当的时候两种工具可同时使用。EEM探头可置于两个通道的结肠内窥镜的第二通道中。这样，每个系统可用来检验另一个。收入本篇的还有所附的出版物，题目为“从人类结肠腺瘤获得的实时体内内窥镜荧光成象”。

下面的表格比较了白光图象，用内窥镜CCD观察到的荧光图象，和使用带有增强CID相机的光学模件得到的荧光图象预计的信号大小。下面列出的参数是从制造商的说明书或从试验测定中得到的。

表1成象装置模件    定义    Pentax(白光) Pentax(荧光    UVλ_ex(纳米)   激发波长  -            356          356λ_em(纳米)   散射波长  -            460          460Δλ(纳米)    散射带宽  400-700      400-700      400-700P_o(毫瓦)      功率      1            300          300Δt(秒)       整合时间  0.011        0.011        0.033D(毫米)       距离      20           20           20直径(毫米)    区域照射  70           70           28θ_m(度)      最大角    60           60           35N_f(象素/纤维)数        88560        88560        10000r_L透镜(毫米) 半径      1.25         1.25         0.3ε_t          组织效率  1            5.00E-05     5.00E-05f_o           填密组分  1            1            0.6T_f           ％传递纤维1            1            0.8T_i           ％传递图象1            1            0.9T_o           ％传递光学1            1            0.9元件ηs           光电阴极  0.2          0.2          0.1效率g             组系数    1            1            1N_s           信号光子  1.7×105     2500         338O_e           电子噪声  55           55           50G             增益      1            1            10,000SNR           信号/噪声 407          34           18

表2正常λ(纳米)       λ_ex=370   λ_em=460  λ_ex=370   λ_em=460μ_a         0.9         0.45        2.1         1.1μ_s         15.0        9.5         8.5         5.9g            0.9         0.9         0.9         0.9粘膜厚度(微米)    450         450         1000        1000量子效率(粘膜)    0.1         0.1         0.8         0.8量子效率(粘膜下层)0.1         0.1         0.8         0.8

表3腺瘤    增生    血管标准化强度正常    100.00+27.5    100.00+18.1    100.00+16.1左边    54.0±16.3     87.9±16.3中心    59.9±16.7     95.9±16.7     75.3±5.1右边    54.4±17.7     98.1±17.7强度比率(正常/损害)平均    2.0±0.6    1.1±0.2    1.3±0.1左边    2.0±0.6    1.2±0.1中心    1.8±0.5    1.1±0.1右边    2.0±0.7    1.1±0.2

表4图象              单点标准化    强度    标准化    强度强度     比率    强度      比率左边腺瘤左边       65      1.54     58       1.72中心       74      1.35     74       1.35右边       71      1.41     65       1.54平均       70      1.43     66       1.54右边腺瘤左边       61      1.64     57       1.75中心       81      1.23     67       1.49右边       59      1.69     52       1.92平均      67       1.52     59       1.72

表5内窥镜           探头正常    腺瘤    正常    腺瘤d(毫米)    20      20      2       2θ_m(度)    4       4       12.7    12.7n₀        1.0     1.0     1.4     1.4n₁        1.4     1.4     1.4     1.4370        2.8E-02 2.8E-02 4.2E-03 6.2E-04460        8.8E-05 2.9E-05 2.8E-03 9.7E-04比率             3.0             2.9

图13以可与下面描述的改进系统比照的形式表现了已在临床实践中论证的系统的示意略图。演示的具体实施使用紫外线激光源200，由快门202转换，用透镜204聚焦到插入到内窥镜208的活组织检查通道中的熔凝硅纤维探头206中来传递到组织部位210上，以使光能照射组织的212区域。这样，来自孔214的UV照射与来自内窥镜自身照射端口216的照射不同。在使用在临床中的双通道潘太克斯(Pentax)内窥镜中，这种方法使一个活组织检查通道218空置。

内窥镜相机220通过其自身的来自宽带氙弧光灯224和收集光纤元件226的光纤照射器222获得它的白光照射。附有在计算机230控制232下的非标准快门228以使在获取荧光图象时将白光照射关闭。荧光图象信号234通过内窥镜视频处理器236处理，产生标准视频信号238，其通过在计算机230中的框捕集器数字化。将处理过的带有有关所观察组织的信息的图象信号240输入监视器242。整个诊断方法通过足蹋开关244启动，足蹋开关通过电缆246与计算机相连。

图14A显示了荧光成象系统的一种设计，其消除了先前系统将图象中的阴影鉴别为异常结构区域的倾向。改进的设计使用100瓦水银(Hg)弧光灯光源302，二向色镜子304和306，波长检波器308和310及旋转快门312和314以提供精确的时间控制，两个独立波长带的组织-照射脉冲。第一个波长带集中在近-紫外线光(365纳米)水银谐振线上，用来获得UV自体荧光图象。第二个波长待在可视光谱的红光末端上，用来获得同时发生的或接近-同时发生的，反射图象，为了鉴别阴影和UV照射区域的范围。

用内窥镜相机系统获得的反射(非荧光)图象测定了组织表面316在其观察区域的亮度。就组织表面是Lambertian(非光谱)反射器来说(通常情况)，这种图象显示了组织距单一照射光源(或多光源的加权距离)的距离。如果这些照射光源不是在从相机到组织源的直接视线中，粘膜就会有阴影。这样只要UV照射和可视照射以相同的扩张角从相同的孔320中发出，反射图象就能用来测量在组织表面上的UV照射318和在荧光图象中存在的阴影。应当注意的是这种条件可通过穿过内窥镜324的活组织检查通道的两色照射纤维322来实现，或通过穿过内窥镜照射束326的两色照射来实现。当两个诊断图象得到时，快门328切断内窥镜的正常白光照射。在计算机控制329下的快门328的关闭与通过线331控制的快门330的开启同时进行。这种功能能使两色光到达纤维322，然后到达组织316。

使用可视参考图象和荧光图象的算法如下所述。从在内窥镜324末梢端的CCD相机来的视频信号332通过视频处理器334转换成标准的NTSC彩色视频信号336，并输入计算机338中的框捕集器中。两个图象首先通过视频处理器进行适合视频信号的非线性系数修正，以确保由计算机中的框捕集器获得的数字化图象是组织表面亮度的线性测位制。这是通过框捕集器输入查表实时实施的。然后将两个图象对它们的峰值校准，这通常是视域中的组织非异常结构区域。这标准化了两个照射区域。然后根据象素乘以象素(pixel-by-pixel)，将荧光图象值除以可视参考图象值。如果比率下降比预确定的界限值低(通常二分之一到三分之一)，那么在图象中的那个象素表示荧光降低的指示异常结构的区域。然后这个象素可在传递到监视器342的输出视频信号340中被设定成假色状态，以指示给临床医生有异常结构的可能性。对两个图象预先界限值的需求确保获得的比率是显著的，并消除在阴影或视域边缘的低照射区域中的假色输出。每次压下通过电缆346与计算机连接的足蹋开关344，整个操作发生。

在改进设计中，UV-激发光脉冲和可视-参考光脉冲都被插入内窥镜的活组织检查通道中的相同的光纤传递到组织。使用图14A中所示的光收集设备的设计，确保了两个照射光源具有相同角分布的条件。单一水银弧光灯302用作两个波长的光源。二向色镜子304反射光谱中UV部分，并传递可视部分。在每条途径中的检波器进一步净化两个光束的带宽。UV滤波器308必须高程度地抵制可视光，因为460纳米组织荧光的效率仅约为0.1％。在红光途径中的检波器310不是至关重要的，但选取的中心波长应避免血色素吸收带，以提供最好的参考图象。应当注意的是光束分离光学元件和光束结合光学元件的设计使得在UV和可视支路中具有均匀的反射光。这确保了由于灯的运动产生的输出光束的任何角偏差彼此跟踪。它还使输出光束的方向在光束分离和重结合光学元件的转换及小旋转下总体上不变。

在改进光源设计中，通过水银灯302的电流在适当瞬间增加，以增加灯的UV曝露量输出功率。这样使得在进行异常结构检查时在单一图象中较大区域的组织被扫描到。在图14B中的数据显示从100瓦水银灯获得的UV输出功率与它的输入功率呈线性函数，至少超过额定功率3倍以上。因为不论电流是多少灯的弧光放电保持不变的电压降，所以灯的输出功率与电流本质上是成比例的。然而，必须总保持灯的至少50％功率，以保持水银处于气相。在改进荧光系统中的灯功率供应348使用了直流电电流以维持无功效电流，及计算机控制350的可快速接通多个恒定电流电源以按成象系统所需改变灯的输出功率的脉冲式电流。如果无功效功率保持低于额定功率，以及电流脉冲保持到足够小的占空系数，那么脉冲UV输出能维持连续。

依据图14C中的时间图，在UV途径312中和光源的红光途径314中的旋转快门设计用来提供脉冲照射光。这张图显示了带有单色相机的这种荧光成象系统是如何使用的，其使用了氙弧光灯352来照射，旋转蓝光-绿光-红光滤波器轮354来从3单色图象合成彩色图象。在这类系统中，脉冲蓝光首先照射组织约6毫秒，在下一个6毫秒产生的组织反射图象数字化。在读取期间照射必须停止，因为当象素是向读取电子仪移动的直线时，使用的单色相机连续收集象素中的相片流。在读取期间照射在图象中产生污迹人为物。在正常蓝光曝露期间UV照射是接通的，而在红光曝露期间红光照射是接通的。通常不使用绿光曝露时间段，但它能用来获得其他参考图象或其他UV荧光图象。快门对使用LM1881视频同步信号分离器电路从标准合成视频输出信号产生偶数/齐数框同步脉冲356的视频获取系统定时。锁相环路(PLL)358和360通过变化它们的直流驱动电动机362和364的电压，同步这个信号的遮光器轮的相。这个信号也可用来同步电流脉冲器348。在图14A的示意中，遮光器轮在光束的校准部分显示。实际上，这些遮光器轮位于光学元件序列(没有演示)的两个支路中的内焦点上，为光脉冲提供快速升和降倍数。

应当注意的是也可使用带有标准，彩色CCD相机内窥镜的双-波长照射方法。在这种情况中，UV光照射和红光照射同时操作。然后通过在CCD相机中的蓝光反应象素检测UC-诱导荧光(主要在460纳米)，通过红光反应象素检测参考反射图象。应当注意的是可视蓝光必须仍然从诊断照射中除去以不降低荧光图象的对比度。在异常结构组织中看到少许由于UV激发产生的红色组织荧光比直接红光照射的量要小的多。少许增加也有降低荧光/参考比率作用，其适当地增加了(少许)异常结构测定可能性的。

图15显示了荧光成象系统的一个较好的具体实施例，其中双波长照射能力以及白光照射能力构建在视频内窥镜系统本身400中。这要求内窥镜404的照射束402在UV波长下能传递，使用当前购得的系统通常不是这样的。这样的设计实现了UV激发光和可视-参考照射从相同的一个孔或多个孔发出的设计要求。这样的系统对操作者使用也是方便的，因为照射纤维不用必须穿过活组织检查通道408，那些通道可任意用于它们的标准用途。组织表面410会被照射较大区域412，只有很少的阴影，因为双照射端口406是标准的。视频信号414会由内窥镜系统416处理，格式化成标准信号416，并由计算机420处理。带有假色重叠422的输出视频信号会送到监视器424为临床医生实时观察。诊断照射由通过电缆428与计算机420连接的脚踏开关426启动，光脉冲由与光源中的快门连接的信号线430和432控制。

虽然本发明已作了有关其较好具体实施的具体地演示和描述，当此领域中的技术人员会理解认为，在形式和细节上可作许多没有背离如所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的变更。

Claims (20)

1．一种荧光成象方法包括：

提供一种具有光学导管的内窥镜，与第一光源和第二光源光耦合，在内窥镜末梢端有图象感应器；

用图象传感器收集反射图象并产生参考物；

用图象传感器收集荧光图象；以及

用参考物处理荧光图象提供处理过的荧光图象。

2．依据权利要求1的方法，进一步包括提供具有滤波器的图象传感器，以除去从组织返回来的紫外光。

3．依据权利要求1的方法，其中图象传感器在紫外线光区域中具有灵敏性，其小于在可视区域中传感器的灵敏性的一半。

4．依据权利要求1的方法，其中参考物修正荧光图象中阴影的强度。

5．依据权利要求1的方法，其中荧光图象是非增强的。

6．依据权利要求1的方法，其中第一光源是宽带光源。

7．依据权利要求1的方法，其中第二光源产生波长范围在350纳米到420纳米。

8．依据权利要求1的方法，进一步包括补偿成象组织表面上的阴影。

9．依据权利要求1的方法，其中第一光源和第二光源与相同的光学导管光耦合。

10．依据权利要求1的方法，进一步包括提供与每个光源与光纤耦合的快门。

11．依据权利要求1的方法，进一步包括成象组织表面上的异常结构。

12．一种荧光成象系统包括：

内窥镜；

与延伸过内窥镜的光学导管耦合的光源；

在内窥镜末梢端的检测组织荧光图象和反射图象的成象传感器。

13．依据权利要求12的成象系统，其中光源包括第一宽带光源和第二窄带光源。

14．依据权利要求13的成象系统，其中窄带光源发出波长范围从350纳米到420纳米的光。

15．依据权利要求12的成象系统，进一步包括与光源光耦合的光纤装置。

16．依据权利要求12的成象系统，进一步包括处理反射图象和荧光图象并产生补偿荧光图象的处理器。

17．依据权利要求12的成象系统，进一步包括沿光源和延伸到内窥镜的光纤之间的光路上设置的快门。

18．依据权利要求12的成象系统，其中与在可视光谱区域中的灵敏度相比，图象传感器在紫外线光谱区域具有降低的灵敏度。

19．依据权利要求12的成象系统，其中图象传感器包括在低于400纳米时将图象传感器灵敏度降低的滤波器。

20．依据权利要求18的成象系统，其中在紫外线光谱区域中的传感器灵敏度小于在可视区域的灵敏度的一半。

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