CN1276013A - 抗真菌多肽和用于控制植物致病真菌的方法 - Google Patents

Abstract

证实了从苜蓿属植物中分离的抗真菌多肽能控制真菌对植物的损害。将编码所述多肽的DNA克隆到用于转化植物－定居微生物或植物的载体上,从而提供了一种抑制真菌在植物上生长的方法。可将所述多肽制成组合物,用于控制不希望的真菌。

Description

抗真菌多肽和用于控制植物致病真菌的方法

                      发明背景

发明领域

本发明涉及可从苜蓿属植物中获得的抗真菌多肽，以及用该抗真菌多肽控制致病真菌的方法。可将所述抗真菌多肽直接用在植物上，以能产生所述多肽的微生物形式用在植物上，或对所述植物进行遗传学修饰，使其能产生所述多肽。本发明还涉及DNA序列，用该DNA转化过的微生物和植物，以及用于控制植物致病真菌的组合物。

相关技术的说明

防止农业上重要的作物免受虫害和病害是本领域所关心的重点。真菌感染是潮湿气候下的一个特殊问题，并可能是作物贮存期间的主要问题。植物业已形成了一定程度的、对病原性真菌的天然抗性；不过，现代种植方法，收获和贮存系统通常提供了有利于植物病原体的环境。

除了以上问题之外，不同真菌的数量也会导致问题。下列真菌属的真菌会导致真菌病害：链格孢属；壳二孢属；葡萄孢属；尾孢菌属；刺盘孢属；色二孢属；白粉菌属；镰孢属；顶囊壳属；长蠕孢属；壳球孢属；丛赤壳属；霜霉属；茎点霉属；瘤梗孢属；疫霉属；单轴霉属；柄孢壳属；柄锈菌属；腐霉属；核腔菌属；Pyricularia；丝核菌属；小核菌属；核盘菌属；壳针孢属；梭壳孢属；钩丝壳属；黑星菌属；和轮枝孢属。因此，杀真菌化合物并非总是有效的，因为其活性可能局限于少数几个种。

抑制植物病原体活性的一种方法是鉴定并提取对这些病原体具有很高活性的化合物，事实上，业已提取到若干种对多种植物病原性真菌具有抗真菌活性的多肽和蛋白(Bowles，1990；Brears等，1994)。所述抗真菌多肽和蛋白包括壳多糖酶，富半胱氨酸壳多糖结合蛋白，β-1，3-葡聚糖酶，透肽菌素(包括zeamatins)，硫素，核糖体-灭活蛋白，和非特异性脂转移蛋白，所述蛋白被认为在植物的抗真菌感染的防御机制中起着重要作用。例如，在欧洲专利申请0 392 225中证实了将天然蛋白制品用于控制植物病原体的用途。

最近，业已发现另一类植物蛋白能在抵御植物病原体感染方面起着防卫素的作用(PCT国际公开WO93/05153)。Rs-AFP1和Rs-AFP2是从萝卜种子中分离的两种小的富半胱氨酸蛋白，已发现将所述纯的蛋白加入体外抗真菌试验培养基中时能抑制病原性真菌的生长。业已发现含有编码Rs-AFP2蛋白的基因的转基因烟草植株比未转化的植株具有更强的抗真菌感染的能力。

业已从很多其它植物中提取到类似于萝卜种子Rs-AFP2的蛋白(PCT国际公开WO93/05153；Broekaert等1995)。这一类型的所有蛋白在其氨基酸序列方面具有相似性，但其在抗各种真菌的抗真菌活性方面不同，特别是在有不同的一价-和二价盐存在的情况下更是如此。在有1mMCaCl₂和50mM KCl的条件下某些抗真菌蛋白的抗真菌活性会显著降低(Terras等，1992)。将抗真菌蛋白用于遗传工程植物抗病性的用途会因为抗真菌活性对盐的浓度的敏感性而受到极大的影响，因为，诸如K⁺，Na⁺，Ca²⁺和Mg²⁺的金属离子是正常的生理功能所必需的，因此，这些离子大量存在于植物细胞中。

业已在宿主-病原体相互作用之后提取了豌豆cDNA(Chiang等，1991)，该cDNA pI230是在受到病原体腐皮镰孢病原体感染以后所产生的一类cDNA的一部分，这种DNA能在相容性Sacc.f.Sp.pisi和不相容性f.sp.phaseoli相互作用中产生。不过，该基因的蛋白产物没有报导，其功能也是未知的。

最近，重组DNA技术业已导致了转基因植物的出现，这种植物能表达对某些病害具有抗微生物活性的蛋白。例如，在有关文献中报导了转化多种不同双子叶植物并获得转基因植物的方法(参见Gasser和Fraley(1989)；Fisk和Dandekar(1993)；Christou(1994)，以及本文所引用的参考文献)。

类似地，用于生产单子叶植物的转基因植物的方法也有大量报导。业已在下列植物中取得了转化和植株再生的成功：石刁白(Asparagusofficinalis；Bytebier等(1987))；大麦(Hordeum vulgare；Wan和Lemaux(1994))；玉米(Zea mays；Rhides等(1988))；Gordon-Kamm等(1990)；Fromm等(1990)；Koziel等(1993)；燕麦(Avena sativa，Somers等(1992))；鸭茅(Dactyles glomerata；Horn等(1988))；稻(Oryza sativa，包括印度和日本变种；Toriyama等(1988))；Zhang等(1988)；Luo和Wu(1988)；Zhang和Wu(1988)；Christou等(1991)；黑麦(Secale cereale；De la Pena等(1987))；高粱(Sorghum bicolor；Cassas等(1993))；甘蔗(Saccharum spp.；Bower和Birch(1992))；苇状羊茅(Festuca arundinacea；Wang等(1992))；草坪草(Agrostis palustris，Zhong等(1993))；小麦(Triticum aestivum；Vasil等(1992))；Troy Weeks等(1993)；Becker等(1994))。

在很多出版物中都披露了植物和细菌葡聚糖酶、壳多糖酶的用途，而在转基因植物中产生的溶菌酶对诸如真菌的各种微生物具有较强的抗性。所述出版物包括EP0 292 435，EP0 290 123，WO88/00976，US4,940,840，WO90/07001，EP0 392 225，EP0 307 225，EP0 307 104，EP0 440 304，EP0 418 695，EP0 448 511，和WO91/06312。在WO91/18984中披露了通过渗透蛋白-样蛋白的表达所获得的保护作用。

因此，一直存在着鉴定抗生化合物的必要性，特别是能有效抗植物病原体真菌的化合物，这些化合物无论是作为组合物直接用在受感染的植物上或在转基因植物中以足于产生抗所述病原体的量表达时，都能有效抗植物病原体真菌。

2.0发明概述

2.1新型抗真菌多肽

本发明涉及新的抗真菌多肽的发现，该多肽具有抗植物病原性真菌和其它真菌的宽的抗真菌活性谱。编码该多肽的DNA与存在于植物中的其它抗真菌多肽相比没有明显的序列同源性，业已证实该基因在转基因植物中所表达的编码多肽的量足以产生抗真菌感染的保护作用。这种新型肽代表了可从苜蓿植物中获得的一种新的类型的蛋白抗真菌剂。

一方面，本发明提供了一种含有序列2所示氨基酸序列(AlfAFP1)和序列14所示氨基酸序列(AlfAFP2)的分离的抗真菌多肽，及其生物学功能等同物。AlfAFP1和AlfAFP2或其生物学功能性等同物可以从植物中提取，或通过本领域已知的任何合适方法生产或合成，包括直接化学合成，在诸如微生物、植物、和动物系统，组织培养物、细胞培养物、或体外翻译系统的异源生物系统中合成。

本发明还提供了编码所披露的抗真菌多肽的分离的DNA序列，和遗传构建体，以及用于将所述DNA序列插入宿主细胞以便生产由该DNA所编码的多肽的方法。这种新型核酸片段包括两个alfAFP基因，这些基因具有在图1、图2和图3中示出的，以及如序列6、序列10和序列13所示的核苷酸序列。AlfAFP1的编码区如图1所示，而AlfAFP1和AlfAFP2的编码区如图3所示。

本发明还提供了用编码本发明抗真菌多肽的DNA核苷酸序列转化过的微生物和植物。

为了实现上述目的，根据本发明的各个方面提供了：

一种含有序列2所示的氨基酸序列的分离的多肽。

一种编码上述多肽的分离的DNA分子。该分离的DNA分子可以是含有序列6或序列10所示的核苷酸序列的cDNA分子。另外，该cDNA分子可以包括序列6或序列10所示核苷酸序列的一个连续的片段和能在标准严格条件下与其杂交的片段。

一种控制真菌对植物的损害的方法，包括向所述植物的部位提供一种分离的多肽，该多肽含有序列2所示的氨基酸序列或主要由该氨基酸序列组成。在该方法中，可以通过植物-定居微生物为所述植物部位提供所述多肽，所述微生物能够产生所述抗真菌多肽，通过喷施含有所述分离的多肽的组合物向所述植物部位提供所述多肽，或通过在该植物的细胞中表达编码所述多肽的DNA来提供这种多肽。

另外，该植物的基因组可以包括一个或几个编码一种抗真菌肽、多肽或蛋白的额外DNA分子，其中，所述额外的DNA分子能表达并产生一种抗真菌有效量的所述肽、多肽或蛋白。该额外DNA分子还可以包括下列部分：

编码B.t.内毒素的DNA，其中，该DNA能表达并产生一种抗昆虫有效量的B.t.内毒素。所述植物可以是选自下列一组中的一员：苹果、苜蓿、大麦、花茎甘蓝、甘蓝、油菜(canola)、胡萝卜、柑桔、玉米、棉花、大蒜、燕麦、洋葱、观赏植物、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、稻、黑麦、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、番茄、草坪草、树木、藤本植物、蔬菜、和小麦。本发明还包括由所述植物生产的马铃薯繁殖用块根片。

据推测，编码AlfAFP1和AlfAFP2，包括天然存在的突变蛋白及其变体的基因存在于各种植物物种的基因组中。可以通过常规分子生物学方法从植物物种的染色体DNA中获得这些基因。例如，可以使用本领域已知方法在诸如细菌噬菌体载体λEMBL3和λgt10、粘粒或质粒的载体中构建染色体DNA文库(Sambrook等，1989)。通过用染色体DNA或染色体DNA文库进行PCR^TM或通过基因组DNA文库的探针杂交可以提取编码具有与AlfAFP1的抗真菌活性相同或相似的多肽的基因。为了避免引物-双链的形成，引物应当不具有自身-互补序列，在其3’末端也不具有互补序列。这些引物可以含有限制位点。将所述引物退火到所述DNA上，并进行足够轮次的PCR^TM，以产生通过凝胶电泳和染色就很容易观察的产物。所述引物通常至少具有16个核苷酸的长度，典型地至少20个核苷酸长，优选至少24个核苷酸长，更优选至少28个核苷酸长。所述引物能够特异性地引导具有与AlfAFP1相同或相似的抗真菌活性的抗真菌多肽或蛋白的基因。可以纯化所述扩增的片段并将其插入合适的载体中，并通过本领域已知的常规方法进行繁殖。

2.2  将AlfAFP1和AlfAFP2 DNA片段用作杂交探针和引物

本发明所涉及的核酸序列除了能用于指导本发明抗真菌蛋白或肽的表达以外，还具有多种其它用途。例如，在核酸杂交实施方案中，还可将其用作探针或引物。因此，推测包括这样一个序列部分的核酸片段具有特殊用途：所述序列由至少14个核苷酸长的连续序列组成，该连续序列与序列10或序列6的一个14个核苷酸长的连续DNA片段具有相同的序列或与该序列互补。在某些场合下，还可以使用更长的连续的相同序列或互补序列，例如，大约20、30、40、50、100、200、300、400、500bp的序列等(包括所有的中间长度，并可以达到和包括507bp的全长序列)。

所述核酸探针能与抗真菌蛋白编码序列特异杂交的能力，使其能被用于检测特定样品中互补序列的存在。不过，还可以设想其它用途，包括将所述序列信息用于制备突变类型的引物或用于制备其它遗传构建体的引物。

将这样的核酸分子作为杂交探针用于诸如Southern和Northern印迹分析的实验中是特别理想的：该核酸分子的序列部分由10-14、15-20、30、50或者甚至100-200个核苷酸的连续核苷酸片段组成，该序列与序列10或序列6的DNA序列相同或互补。一般，较小的片段可被用于杂交实施方案中，其中，所述连续的互补片段的长度可以变化，如大约为10-14和大约100或200个核苷酸，不过，根据人们希望检测的互补序列的长度，可以使用更大的连续互补片段。

当然，所述片段也可以通过其它技术获得，例如，通过机械剪切或通过限制酶消化。小的核酸片段通过化学方法直接合成进行制备是比较方便的，例如，像通常所采用的方法那样用一台自动寡核苷酸合成仪进行合成。另外，还可以通过使用核酸增殖技术，如美国专利US4,683,195和US4,683,202(分别被收作本文的参考文献)中所披露的PCR^TM技术获得所述片段，通过将选择的序列导入重组载体中进行重组生产，和通过分子生物学领域的技术人员所普遍公知的其它重组DNA技术生产。

因此，对本发明的核苷酸序列能选择性地与DNA片段的互补序列形成双链分子的能力可加以利用。根据所设想的用途，人们可能需要采用不同的杂交条件，以便获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对需要高选择性的用途而言，人们通常需要采用较严格的条件来形成杂合体，例如，人们会选择较低的盐度和/或高的温度条件，如大约0.02-0.15MNaCl和大约50-70℃的温度。这样的选择条件容许探针和模板或靶链之间有很少的错配(如果有的话)，而且，特别适用于提取苜蓿植物抗真菌蛋白编码DNA片段。对本领域技术人员来说，通过杂交检测DNA片段的技术是众所周知的，而美国专利US4,965,188和US5,176,995(分别被收作本文的参考文献)中所披露的技术可以作为杂交分析方法的范例。披露于下列文献中的技术是特别相关的：Maloy等，1993；Segal，1976；Prokop，1991；和Kuby，1991。

当然，对某些用途来说，例如，当人们需要用一种能与潜在的模板杂交的突变型引物链制备突变体时或希望从相关的种或功能性等同物等中提取苜蓿植物抗真菌蛋白编码序列时，通常需要不太严格的杂交条件，以便能形成异源双链。在上述场合下，人们可能需要采用诸如大约0.15-0.9M盐和大约20-55℃的温度的条件。因此，可以根据相对对照杂交的正杂交信号方便地鉴定交叉-杂交种类。一般认为，在任何情况下通过添加较大量的甲酰胺都可以使得杂交条件更严格，提高甲酰胺的浓度能像提高温度一样使所述杂合双链去稳定。因此，杂交条件可以方便的加以操作，因此，通常是一种根据所希望的结果选择方法。

在某些实施方案中，将本发明的核酸序列与诸如标记物的合适的工具组合使用，用于检测杂交是有利的。本领域有多种合适的标记工具，包括荧光、放射性、酶或其它配体，如亲和素/生物素，所述配体能产生可检测的信号。在优选实施方案中，人们可能希望使用荧光标记物或诸如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶的酶标记物，而不采用放射性或其它对环境有害的试剂。就酶标记物而言，已知比色指示底物可被用于产生能用人的肉眼或通过分光光度法检测到的标记，以鉴定与含有互补核酸的样品的特异杂交。

一般，希望本文所披露的杂交探针既可作为用于溶液杂交中的试剂，又可用作

采用固相实施方案的试剂。在与固相有关的实施方案中，将试验DNA(或RNA)吸附或以其它方式固定在一种特定的基质或表面上。然后，在希望的条件下将这种固定的、单链核酸与特定探针进行特异杂交。特定的杂交条件取决于以特定指标要求为基础的特定场合(例如，取决于G+C含量，靶核酸的类型，核酸的来源，杂交探针的大小等)。洗涤杂交表面，以除去非特异结合的探针分子，然后通过所述标记物检测特异杂交，甚至进行定量。

本发明还提供了可用于从基因组和其它核酸文库中筛选编码具有与AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的肽、多肽、和蛋白的DNA序列的寡核苷酸杂交探针，这些探针可以根据本文所提供的序列进行设计。在具体的实施方案中，所述探针的长度可以在大约16-28个核苷酸的范围内变化，一般其长度大约为16个核苷酸，更常见的是大约为20个核苷酸，优选为大约24个核苷酸，更优选为大约28个核苷酸。优选地，所述探针可以与编码具有与AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的肽、多肽、或蛋白的基因组DNA或其它DNA序列特异杂交。所述寡核苷酸探针可以通过自动合成的方法合成，并可以用诸如放射性核素的报道分子，例如，³²P或生物素对其5’末端进行方便地标记。

诸如上文所提到的寡核苷酸探针可用于检测基因组或cDNA文库。举例来说，基因组文库可以这样构建：用诸如Sau3A的限制酶裂解或消化基因组DNA，将由此得到的DNA片段连接到诸如λ噬菌体的合适载体中，并在合适的宿主细胞中表达，宿主细胞通常为大肠杆菌(E.coli)。cDNA文库是mRNA的互补DNA拷贝，这种文库通常是优选的，因为所获得的克隆没有存在于基因组DNA上的内含子或其它非编码序列。在任何场合下，基因组和cDNA文库的构建对本领域技术人员来说都是熟知的，这些技术披露于众多文献中，例如，Thompson和Thompson，1991.

一旦构建成文库，即可根据所采用的载体将该文库铺平板形成菌落或噬菌体，并将重组DNA转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。对所述DNA进行变性，中和，并将其固定到所述膜上，然后用所述标记探针(报道分子)与该膜进行杂交。在此之后，洗涤所述膜，并检测所述报道分子。然后分离并繁殖具有杂交DNA的菌落或噬菌体。可以用多种方法鉴定含有编码AlfAFP1和AlfAFP2或具有与AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的相关肽、多肽、或蛋白的DNA的候选克隆或PCR^TM扩增片段。因此，可以用以下方法检验其所编码的肽、多肽、或蛋白的抗真菌活性：将所述DNA克隆在诸如酵母或大肠杆菌的合适宿主中、并在该宿主中表达，然后提取所述肽、多肽、或蛋白，通过诸如例3中所披露的方法分析其抗真菌活性。通过这种方法，可以提取到编码AlfAFP1和AlfAFP2、或在生物学功能上与其相当的肽、多肽、或蛋白的植物核酸，这种核酸可用于控制不希望的真菌并保护植物免受真菌病原体的侵害。

可以用适当设计的简并寡核苷酸直接筛选基因组文库，并可将所分离的编码序列整合到转化/表达载体中。可以用基于AlfAFP1(序列10)和AlfAFP2(序列14)的核苷酸序列的简并寡核苷酸序列检测从诸如高等植物的生物中分离的基因组DNA和cDNA。所述探针可以与PCR^TM技术组合使用，利用逆转录酶扩增可杂交的cDNA(E.S.Kawasaki，1990)。可将cDNA方便地克隆到合适的转化/表达载体中，并导入合适的宿主细胞中，例如单子叶和双子叶植物细胞。由所述DNA编码的多肽可以在转化的细胞中表达，并用已建立的方法提取，这些方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析。

另外，简并寡核苷酸可以用作筛选源于植物的cDNA文库的探针，例如，所述文库构建在诸如λZapII(Stratagene，La jolla，CA)的λ噬菌体载体上。以上述方法分离的cDNA可以转入合适的转化/表达载体中，以便导入宿主细胞。

2.3重组载体和抗真菌蛋白表达

在其它实施方案中，预计通过将所述编码DNA片段置于重组、或异源启动子的控制之下可以获得某些优点。在本文中，重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与编码苜蓿植物抗真菌蛋白或肽的DNA片段结合的启动子。所述启动子可以包括正常情况下与其它基因结合的启动子，和/或从任何细菌、病毒、真核细胞、或植物细胞中分离的启动子。当然，重要的是使用能在用于表达的细胞类型、生物、或者甚至是动物中有效指导所述DNA片段表达的启动子。将启动子和细胞类型组合用于蛋白表达的用途是分子生物学领域的技术人员所普遍公知的，例如，参见Sambrook等，1989。所使用的启动子可以是组成型的，或诱导型的，并可以在合适条件下使用，以指导所导入的DNA片段的高水平表达，如有利于重组蛋白或肽的大规模生产的条件。适用于高水平表达的合适启动子系统包括，但不限于毕赤酵母表达载体系统(Pharmacia LKDBiotechnology)。

就制备重组蛋白和肽的表达实施方案而言，最理想的是，将最常用的较欠的DNA片段与编码所述完整的肽序列的DNA片段一起使用。不过，应当理解，将较短的DNA片段用于指导苜蓿植物抗真菌肽或表位核心部分的表达，如可用于制备抗-苜蓿植物抗真菌蛋白抗体的用途也属于本发明的范畴。特别有用的是编码具有大约8-50个氨基酸的肽抗原的DNA片段，或者所述肽抗原的长度更优选为大约8-30个氨基酸，进一步优选大约8-20个氨基酸。所述肽表位可以是包括源于序列2或序列14的连续氨基酸序列的氨基酸序列。

2.4苜蓿植物抗真菌蛋白转基因和转基因植物

在其它方面，本发明提供了用于生产能表达编码本发明的新型苜蓿植物抗真菌蛋白的核酸片段的转基因植物的方法。生产转基因植物的方法是本领域中众所周知的。一般，该方法包括用含有可操作地连接于alfAFP1或alfAFP2编码区的启动子的DNA片段转化的合适的宿主细胞。所述编码区通常可操作地连接于一个转录-终止区，以使得所述启动子能够启动所述编码区在所述细胞中的转录，并因此赋予该细胞在体内产生重组蛋白的能力。另外，在需要控制、调节、或降低特定重组苜蓿植物抗真菌蛋白在特定转基因细胞中的表达量的场合下，本发明还提供了苜蓿植物抗真菌蛋白反义mRNA的表达。将反义mRNA用作控制或降低一种细胞中感兴趣的特定蛋白量的方法是本领域中众所周知的。

本发明的另一方面包括能表达编码本文所披露的一种或几种新型多肽组合物的基因或基因片段的转基因植物。在本文中，“转基因植物”一词是指具有整合的DNA序列的植物，所述DNA序列包括，但不限于可能在正常状态下不存在的基因、正常状态下不能转录成RNA或翻译成蛋白(“表达”)的DNA序列、或人们希望导入未转化的植物中的任何其它基因或DNA序列，如正常情况下可能存在于未转化的植物中的，但人们希望对该基因进行遗传工程操作或改变其表达的基因。

在某些场合下，希望本发明的转基因植物的基因组能通过稳定导入一个或几个alfAFP1或alfAFP2转基因进行扩增，所述转基因或者是天然的、合成修饰的、或突变的。在某些场合下，需要将一个以上的转基因整合到转化宿主植物细胞的基因组中。当把一个以上的苜蓿植物抗真菌蛋白编码DNA片段整合到该植物的基因组时就是这种情况。在某些场合下，可能需要将一种、两种、三种、四种、或更多种苜蓿植物抗真菌蛋白(天然的或重组工程生产的)整合到转化的转基因植物中，并进行稳定表达。

可能还需要将其它DNA片段整合到一种转基因植物的基因组中，其中，该DNA编码与所披露的苜蓿抗真菌蛋白不同源的其它抗真菌蛋白，或各种能改善该植物的植物产品的质量或农艺性状的其它蛋白。因此，由所述DNA编码的其它类型的蛋白可以包括抗细菌、抗病毒、抗真菌或杀昆虫蛋白，如苏云金芽孢杆菌(B.t.)蛋白。

在植物中同时共表达多种抗真菌和/或其它抗病原体蛋白的优点是，它利用了一种以上的控制植物病原体的模式。这样，当表达两种或更多种抗真菌蛋白时，可以降低产生抗性真菌种的可能性，拓宽抗性范围，并有可能导致协同抗真菌效果，从而增强抗性水平。与B.t.杀昆虫毒素蛋白的共表达，预计能在提供对多种昆虫幼虫的抗性方面产生额外的优点。杀昆虫B.t.毒素蛋白业已在包括谷类植物在内的若干种植物中得到表达。

能产生某些优点的其它蛋白同样能与编码本发明多肽的DNA共表达；包括：(1)编码酶的DNA，如葡萄糖氧化酶(它能将葡萄糖转化成葡糖酸，同时产生过氧化氢，过氧化氢能对植物病原体产生广谱性抗性)；丙酮酸氧化酶；oxylate氧化酶；胆固醇氧化酶；氨基酸氧化酶；和其它将分子氧用作一级或二级底物产生包括过氧化氢在内的过氧化物的其它氧化酶；(2)病理相关蛋白，如SAR8.2a和SARB.2b蛋白；酸性和碱性形式的烟草PR-1a，PR-1b，PR-1c，PR-1’，PR-2，PR-3，PR-4，PR-5，PR-N，PR-O，PR-O’，PR-P，PR-Q，PR-S，和PR-R蛋白；壳多糖酶，如烟草碱性壳多糖酶和黄瓜壳多糖酶/溶菌酶；诸如黄瓜碱性过氧化物酶的过氧化物酶；诸如烟草碱性葡聚糖酶的葡聚糖酶；渗透蛋白-样蛋白；(3)病毒衣壳蛋白和植物病毒的复制酶；(4)植物R-基因(抗性基因)，如拟南芥属RPS2(Bent等，1994)，拟南芥属RPM1(Grant等，1995)，烟草N-基因和N’-基因(Whitham等，1994)，烟草Cf-9(Jones等，1994)，亚麻L6(Ellis)等，1995)，和稻Xa21(Song等，1995)。以上基因可以用组成型启动子、组织特异性启动子、或能用真菌病原体和其它生物和化学诱导物诱导的启动子表达；(5)病原体Avr基因，如黄枝孢(Cladosporium fulvum)Avr9(VanDen Ackerveken等，1992)，该基因可以用病原体或化合物诱导启动子表达；和(6)参与水杨酸生物合成的基因，如苯甲酸2-羟化酶(Leon等，1995)。

为了免受病原体真菌的侵害，可以导入的优选基因包括，例如，来源于植物的苜蓿植物抗真菌蛋白编码DNA序列，特别是本文所披露的获自苜蓿属的一种或几种基因，或为了降低或提高苜蓿植物抗真菌蛋白在所述转化的宿主细胞中的抗真菌活性而通过遗传工程方法产生的任何序列。不过，据信在其它植物种中也会存在具有相似的抗真菌活性的高度同源的抗真菌蛋白，所述物种包括，但不限于以下物种：

拟南芥属、大麦、花茎甘蓝、甘蓝、油菜、胡萝卜、玉米、大蒜、洋葱、豌豆、胡椒、马铃薯、稻、大豆、甜菜、烟草、番茄和小麦；

诸如曲霉属，青霉属，链霉属，链格孢属(芸苔链格孢Alternariabrassicola；马铃薯早疫病链格孢Alternaria solani)；壳二孢属(豌豆壳二孢Ascochyta pisi)；葡萄孢属(灰葡萄孢Botrytis cinerea)；尾孢菌属(菊池尾孢Cercospora kikuchii；玉米尾孢Cercosporazaea-maydis)；刺盘孢属(豆刺盘孢Colletotrichumlindemuthianum)；色二孢属(玉米色二孢Diplodia maydis)；白粉菌属(禾白粉菌禾本科变种Erysiphe graminis f.sp.graminis；禾白粉菌大麦变种Erysiphe graminis f.sp.hordei)；镰孢属(雪腐镰孢Fusarium nivale；尖镰孢Fusarium oxysporum；禾本科镰孢Fusariumgraminearum；大刀镰孢Fusarium vulmorum；腐皮镰孢Fusariumsolani；串珠镰孢Fusarium moniliforme；粉红镰孢Fusariumroseum)；顶囊壳属(禾顶囊壳小麦变种Gaeumanomyces graminisf.sp.tritici)；长蠕孢属(大斑病长蠕孢Helminthosporiumturcicum；灰色长蠕孢Helminthosporium carbonum；玉米长蠕孢Helminthosporium maydis)；壳球孢属(菜豆壳球孢Macrophominaphaseolina；Maganaporthe grisea)；丛赤壳属(Nectriaheamatococca)；霜霉属(东北霜霉Peronospora manshurica；烟草霜霉Peronospora tabacina)；茎点霉属(甜菜茎点霉Phoma betae)；瘤梗孢属(多主瘤梗孢Phymatotrichum omnivorum)；疫霉属(樟疫霉Phytophthora cinnamomi；恶疫霉Phytophthora cactorum；菜豆疫霉Phytophthora phaseolina；寄生疫霉Phytophthora parasitica；柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrothora；大雄疫霉大豆变种Phytophthora megasperma f.sp.sojae；致病疫霉Phytophthorainfestans)；单轴霉属(葡萄生单轴霉Plasmopara vitivola)；单囊壳属(白叉丝单囊壳Podosphaera leucotricha)；柄锈菌属(高粱柄锈菌Puccinia sorghi；条形柄锈菌Puccinia striiformis；小麦柄锈病Puccinia graminisf.sp.tritici；天门冬属柄锈病Pucciniaasparagi；隐匿柄锈菌Puccinia recondita；落花生柄锈病Pucciniaarachidis)；腐霉属(瓜果腐霉Pythium aphanidermatum)；核腔菌属(偃麦草核腔菌Pyrenophora tritici-repentens)；Pyricularia(Pyricularia oryzae)；腐霉属(终极腐霉Pythium ultimum)；丝核菌属(立枯丝核菌Rhizoctinia solani；禾本科丝核菌Rhizoctiniacerealis)；Scerotium(Scerotium rolfsii)；核盘菌属(核盘菌Sclerotinia sclerotiorum)；壳针孢属(番茄壳针孢Septorialycopersici；大豆壳针孢Septoria glycines；颖枯壳针孢Septorianodorum；小麦壳针孢Septoria tritici)；梭壳孢属(茎生梭壳孢Thielaviopsis basicola)；钩丝壳属(葡萄钩丝壳Uncinulanecator)；黑星菌属(苹果黑星菌Venturia enaequalis)；和轮枝孢属(大丽花轮枝孢Verticillium dahliae；黄萎轮枝孢Verticilliumalbo-atrum)的微生物；和其它非植物生物。

优选的核酸序列是获自苜蓿植物种子的序列，或为了降低或提高苜蓿植物抗真菌蛋白在所述转化的宿主细胞中的抗真菌活性而通过遗传工程方法产生的序列。

转化植物细胞和制备转基因细胞系的方法在本领域中是众所周知的，并且，将在本文中加以讨论。当然，用于转化所述细胞的载体、质粒、粘粒、YACs(酵母人工染色体)和DNA片段一般包括操纵子、基因、和本发明的基因-衍生的序列，这些序列是天然的或合成的，特别是编码所披露的苜蓿植物抗真菌蛋白的序列。所述DNA构建体还可以包括诸如启动子、增强子、多接头、或者甚至是基因序列的结构，所述结构可根据所需要的特定感兴趣的基因具有正-或负-调节活性。所述DNA片段或基因可以编码天然的或改性的苜蓿植物抗真菌蛋白，该蛋白可以在所得到的重组细胞中表达，和/或赋予所再生的植株改进的表现型。

所述转基因植物可能需要加强单子叶或双子叶植物的抗真菌抗性，这一目的是通过将一种或几种AlfAFP1或AlfAFP2苜蓿植物抗真菌蛋白的转基因DNA片段整合到所述植物中而实现的，所述抗真菌蛋白对真菌有毒性。特别优选的植物包括小麦、蔬菜、观赏植物、果树、苹果、苜蓿、大麦、花茎甘蓝、甘蓝、油菜、胡萝卜、柑桔、玉米、棉花、大蒜、燕麦、洋葱、观赏植物、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、稻、黑麦、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、番茄、草坪草、树木、和藤本植物。

在一个相关的方面，本发明还涉及由所述转化植物生产的种子、由该种子产生的子代、和由原始转基因植物的子代产生的种子，所述转基因植物是通过上述方法生产的。所述子代和种子具有稳定地整合到其基因组中的苜蓿植物抗真菌蛋白编码转基因，这些子代以孟德尔方式遗传通过导入稳定的转基因而产生的性状。在其基因组中整合了编码一种或几种AlfAFP1或AlfAFP2苜蓿植物抗真菌蛋白或多肽的转基因DNA片段的所有的转基因植物均属于本发明的范畴。

2.4在单子叶植物中表达

提取AlfAFP1或AlfAFP2用的苜蓿是双子叶植物。正如由Campbell等(1990)所披露的，尽管单子叶和双子叶植物在密码子使用方式方面存在明显的差异，但众所周知的是，单子叶植物以类似于双子叶植物的方式表达基因。基于上述发现，似乎双子叶基因的密码子使用对于在单子叶植物中表达双子叶基因来说不存在大的障碍。在任何情况下，本领域普通技术人员都熟悉对密码子使用进行修改以适应相应的宿主植物的原理(参见Murray等，1989)，而DNA构建体的表达现在已成为本领域中的常规方法。

2.5位点专一性诱变

位点专一性诱变可用于通过对基本DNA进行专一性诱变制备个别的肽，或生物学功能等同的蛋白或肽。该技术还具有这样的方便性：制备并试验序列变体，例如，通过将一个或几个核苷酸序列的变化引入该DNA，而引入一种或几种外源因素。位点专一性诱变可以通过使用编码所希望的突变的DNA序列的特异寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸产生变体，通过以上方法提供具有足够大小和在所通过的缺失接头两侧形成稳定的双链的序列互补性。通常，优选长度大约为17-25个核苷酸的引物，在所述序列的结合点两侧有大约5-10个残基是改变了的。

一般，位点专一性诱变在本领域中是众所周知的，众多的出版物可以证实这一点。可以理解，该技术通常使用以单链形式和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。这种裁体很容易通过商业渠道获得，其使用对于本领域技术人员来说，一般也是熟知的。双链质粒通常也被用于定点诱变中，使用这种质粒可以省略将感兴趣的基因从质粒转移到噬菌体的步骤。

一般，本文所述的定点诱变是通过首先获得单链载体或将双链载体的两股链解链而实现的，在所述载体的序列中包括编码所需要的肽的DNA序列。通常，通过合成方法制备具有所需要的突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与所述单链载体退火，并用诸如大肠杆菌聚合酶IKlenow片段的DNA聚合酶处理，以完成所述具有突变的链的合成。由此形成一种异源双链，其中的一股链编码原始非突变序列，而第二股带有所需要的突变。然后将该载体用于转化诸如大肠杆菌细胞的合适细胞，筛选含有具有所述突变序列结构的重组载体的克隆。

通过定点诱变制备特定肽编码DNA片段的序列变体，提供了一种生产潜在的有用种类的方法，但这不意味着不能用其它方法获得肽的序列变体和编码这种肽的DNA序列。例如，可以用诸如羟胺的诱变剂处理编码所需要的肽序列的重组载体，以获得序列变体。

2.6 AlfAFP1和AlfAFP2抗体组合物和制备抗体的方法

在特定实施方案中，本发明人提出了抗体的用途，所述抗体是与本文所披露的苜蓿植物抗真菌蛋白结合的单克隆或多克隆抗体。制备和鉴定抗体的方法在本领域中是众所周知的(例如，参见抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988；该文献被收作本文的参考资料)。制备单克隆抗体(mAbs)的方法通常沿着与制备多克隆抗体相同的路线开始。简单地讲，多克隆抗体是这样制备的：用本发明的免疫原组合物对动物进行免疫，并从免疫的动物中收集抗血清。可将多种动物用于生产抗血清。通常，用于制备抗一抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。由于兔具有大量的血，因此，优选将兔用于生产多克隆抗体。

正如本领域所众所周知的，特定组合物的免疫原性可以变化。因此，通常需要加强刺激宿主的免疫系统，这一目的可以通过将一种肽或多肽免疫原结合到一种载体上而实现。优选载体的例子是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。还可将诸如卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白的其它白蛋白用作载体。将一种多肽与一种载体蛋白缀合的方法在本领域中是众所周知的，所述方法包括使用戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯，碳二亚胺和双-重氮化联苯胺。

正如本领域所熟知的，通过使用非特异性免疫反应促进剂，可以加强特定免疫原组合物的免疫原性，这种促进剂称被为佐剂。佐剂的例子和优选佐剂包括完全弗氏佐剂(一种免疫反应的非特异性促进剂，含有灭活的结核分支杆菌)，不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。

用于生产多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质和用于免疫的动物而变化。可以用多种方法施用所述免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可以在免疫之后的各个时间点采集免疫动物的血样以监测多克隆抗体的产生。还可以进行第二次加强注射。加强和滴定过程可以重复进行，直到达到合适的滴度。当达到所需要的免疫原性水平以后，即可将免疫的动物放血，提取和保存血清，和/或将所述动物用于制备mAbs。

可以用众所周知的方法方便地制备mAbs，如在美国专利US4,196,265中所披露的方法，该专利被收作本文的参考文献。通常，该方法包括用一种特定的免疫原组合物免疫合适的动物。例如，纯化的或部分纯化的抗真菌蛋白、多肽或肽。以能有效刺激抗体产生细胞的方法使用所述免疫组合物。优选的动物为诸如小鼠和大鼠的啮齿类，不过，也可以使用兔、绵羊或蛙细胞。使用大鼠具有某些优点(Goding，1986，pp.60-61)，但优选小鼠，以BALB/c小鼠为最佳，因为这种小鼠是最常用的，并且通常能产生较高百分比的稳定融合体。

在免疫之后，选择具有产生抗体的潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，将其用于mAb制备方案。这种细胞可以从活检脾、扁桃体或淋巴结中获得，或从外周血样品中获得。优选脾细胞和外周血细胞，选择前者是因为它富含抗体产生细胞，这些细胞处于分裂浆母细胞期，而选择后者是因为外周血容易获得。通常要对一组动物进行免疫，并将具有最高抗体效价的动物脾去掉，通过用注射器对所述脾进行匀浆-获得脾淋巴细胞。通常，源于免疫的小鼠的脾含有大约5×10⁷-2×10⁸淋巴细胞。

然后，将源于免疫动物的抗体产生B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，通常，骨髓瘤细胞是与免疫的动物的同一种类。适用于杂交瘤生产融合方法的骨髓瘤细胞系优选为不产生抗体的，具有高的融合效率，并具有酶缺陷，这使得它不能在某些选择培养基中生长，这种选择培养基仅能支持所需要的融合细胞(杂交瘤)生长。

正如本领域技术人员所熟知的，可以使用多种杂交瘤细胞中的任一种(Goding，1986，pp.65-66；Campbell，1984，pp.75-83)。例如，当免疫的动物是小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul；对大鼠而言，可以使用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3，IR983F和4B210；而U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2  和UC729-6均可用于人细胞融合体。

一种优选的鼠类骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也被称作P3-NS-1-Ag4-1)，该细胞系可以方便地从NIGMS人类遗传突变细胞保藏中心(Human Genetic Mutant Cell Repository)获得，索取的细胞系保藏号为GM3573。另一种可以使用的鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤-抗性小鼠鼠类骨髓瘤SP2/0非生产细胞系。

用于制备产抗体脾细胞或淋巴节细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括将体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，不过，在有能促进细胞膜融合的试剂(化学或电学试剂)的条件下，所述比例可分别在大约20∶1至大约1∶1的范围内变化。业已披露的融合方法有使用仙台病毒的方法(Kohler，Milstein，1975；1976)，和使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的方法(Gefter等，1977)。电诱导融合方法的使用也很合适(Goding，1986，pp.71-74)。

融合方法通常以很低的频率产生活性杂合体，其频率大约为1×10^-6-1×10^-8。不过，这并不会造成问题，因为这种活的融合杂合体是通过在选择培养基中培养由亲代未融合的细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，这种细胞通常能持续无限制地分裂)分化而来的。所述选择培养基通常是这样的：它含有一种能抑制核苷酸在组织培养基中从头合成的试剂。优选试剂的例子是氨基蝶呤、氨甲蝶呤、和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤能抑制嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅能抑制嘌呤的合成。当使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，将次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源添加到所述培养基中(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，向所述培养基中添加次黄嘌呤。

优选的选择培养基是HAT。只有那些具有核苷酸补救途径的细胞在HAT培养基中存活。所述骨髓瘤细胞缺少所述补救途径的关键酶，例如，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，因此，这种细胞不能存活。B-细胞可以使用该途径，但这种细胞在培养中具有有限的生命极限，通常会在大约2周内死亡。因此，唯一能在所述选择培养基中存活的细胞是由骨髓瘤细胞和B-细胞形成的杂交细胞。

这种培养方法可以提供一种杂交瘤群体，从该群体中选择特殊杂交瘤。通常，杂交瘤的选择是这样进行的：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释培养所述细胞，然后检测每一种克隆上清液(大约2-3周以后)的所需反应活性。所述测试应当灵敏、简单并且快速，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、斑点免疫结合测定等。

然后，可以对所选择的杂交瘤进行一系列的稀释，并克隆到每一种抗体生产细胞系中，然后将这些克隆进行无限增殖，以产生mAbs。可将所述细胞系用于通过两种基本方法生产mAb。将所述杂交瘤的样品注射到(通常注射到其腹膜腔)组织相容性动物体内，这种动物是用于提供原始融合所需要的体细胞和毒性瘤细胞的动物。接受注射的动物会产生能分泌特殊单克隆抗体的肿瘤，所述单克隆抗体是用所述融合细胞杂合体产生的。然后，可以放出该动物的体液，如血清或腹水，以提供高浓度的mAbs。还可以在体外培养所述单细胞系，在这种情况下，mAbs能自然分离到培养基中，从该培养基中可以方便地获得高浓度的mAbs。如果需要的话，可以对通过任一种方法生产的mAbs作进一步纯化，使用过滤、离心和各种层析方法，如HPLC或亲和层析。

2.7 ELISAs和免疫沉淀

ELISAs可以与本发明组合使用。在ELISA测定中，将整合到苜蓿植物抗真菌蛋白抗原序列上的蛋白或肽固定在一种选定的表面上，优选具有蛋白亲和力的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的孔中。洗涤以除去不完全吸附的材料，然后需要用一种非特异性蛋白结合或包被该测定板孔，这种非特异性蛋白已知为对所述试验抗血清而言，在抗原性上是中性的，如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。这样可以封闭所述固定表面上的非特异吸附位点，从而减弱由抗血清与该表面的非特异结合所产生的背景。

在抗原材料与所述孔结合以后，用非反应材料进行包被，以减弱背景，并洗涤以除去未结合的材料，让该固定化表面与待测定的抗血清或临床或生物提取物接触，接触方式能诱导免疫复合体(抗原/抗体)形成。所述条件优选包括用诸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸缓冲的盐溶液(PBS)/Tween^稀释所述抗血清。所添加的上述试剂还有助于减弱非特异背景。然后将分层的抗血清培养大约2-4小时，培养温度优选为25-27℃。在培养以后，洗涤所述接触过抗血清的表面，以清除非免疫复合的材料。优选的洗涤方法包括用诸如PBS/Tween^或硼酸缓冲液的溶液洗涤。

在形成了试验样品和所结合的抗原的特异免疫复合体之后，接着进行洗涤，然后测定免疫复合体的形成，甚至测定所形成的免疫复合体的量，这种测定是通过用具有第一种抗体的特异性的第二种抗体处理该免疫复合体而实现的。为了提供一种检测手段，所述第二种抗体优选具有一种结合的酶，这种酶在与合适的生色底物一起培养时能产生一种颜色。因此，例如，人们可能希望用一种碱性磷酸酶或过氧化物酶-缀合的抗-兔IgG与抗血清-结合的表面接触并培养一段时间，而且培养是在有利于免疫复合体形成的条件下(例如，在室温下、在诸如PBS/Tween^的含有PBS的培养基中)进行的。

用第二种酶标记的抗体进行培养，洗涤以除去未结合的材料，然后通过与一种生色底物培养对所述标记物进行定量，如当所述酶标记物是过氧化物酶时，所述生色底物是尿素和溴甲粉紫或2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和过氧化氢。然后通过测定颜色生成程度进行定量，例如使用可见光谱分光光度仪。

本发明的抗苜蓿植物抗真菌蛋白抗体特别适用于通过免疫沉淀提取其它苜蓿植物抗真菌蛋白抗原。免疫沉淀包括从复杂的混合物中分离靶抗原成分，并将其用于分辨或提取微量蛋白。为了提取膜蛋白，必须将细胞溶解到洗涤剂微团中。优选非离子型盐，因为诸如胆汁盐的其它试剂在酸性pH或在有二价阳离子的条件下会沉淀。

在另一种实施方案中，本发明的抗体被用于两种抗原的密切结合。对于提高抗原，例如酶-底物对的局部浓度来说，这是特别有用的。

2.8 Western印迹

本发明的组合物在免疫印迹或Western印迹分析方面十分有用。可将所述抗-肽抗体用作高亲和力一级试剂，用于鉴定固定在诸如硝酸纤维素、尼龙或其组合物的固体支持基质上的蛋白。在免疫沉淀之后，接着进行凝胶电泳，可将其用作用于检测抗原的一步试剂，用于检测该抗原的第二种试剂会导致负背景。当所研究的抗原是免疫球蛋白时，这样做是特别有用的(排除了免疫球蛋白结合细菌细胞壁成分的使用)，所研究的抗原能与所述检测试剂交叉反应，或者它能以与交叉反应信号相同的相对分子量迁移。

特别有用的用于和Western印迹分析组合使用的、以免疫学为基础的检测标记包括酶学-、放射标记-、或荧光标记的抗所述抗真菌成分的第二抗体。

2.9抗真菌苜蓿植物抗真菌蛋白筛选和检测试剂盒

本发明涉及用于筛选怀疑其含有苜蓿植物抗真菌蛋白或肽或苜蓿植物抗真菌蛋白相关多肽的样品、或产生所述多肽的细胞的方法和试剂盒。一个试剂盒可以含有一种或几种本发明的抗体，并可以含有用于检测一种样品与本发明的抗体之间的相互作用的试剂。所提供的试剂可以是用放射性-、荧光-或酶标记过的。所述试剂盒可以含有能与本发明的核酸或抗体结合或相互作用的已知的放射性标记的试剂。

所述试剂盒的试剂可以作为液体溶液，结合于固体支持物上或作为干粉形式提供。优选地，当所述试剂是以液体溶液形式提供的时，该液体溶液是一种水溶液。优选地，当所提供的试剂与一种固体支持物结合时，该固体支持物可以是层析介质、具有若干孔的实验平板、或显微镜载玻片。当所提供的试剂是干粉时，可以通过添加可以得到的合适的溶剂对该粉末进行重建。

在另一种实施方案中，本发明涉及免疫检测方法和相关的试剂盒。建议将本发明的苜蓿植物抗真菌蛋白或肽用于检测能与它反应的抗体，或者，将用本发明方法制备的抗体用于检测苜蓿植物抗真菌蛋白或含有苜蓿植物抗真菌蛋白相关表位的肽。

一般，所述方法包括以下步骤：首先获得被怀疑含有蛋白、肽或抗体的样品，在能有效形成免疫复合体的条件下让所述样品与本发明的抗体或肽接触，然后检测所述免疫复合体的存在。一般，免疫复合体形成的检测方法在本领域中是众所周知的，并可以通过使用多种方法来完成。例如，本发明涉及ELISA、RIA、免疫印迹(例如，斑点印迹)和直接免疫荧光技术等的应用。一般，免疫复合体的形成可以通过使用诸如放射性标记物或酶标记物(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)的标记物进行。当然，正如本领域所熟知的，人们会发现通过使用诸如第二抗体或生物素/亲和素配体结合结构的第二结合配体还可以带来额外的优点。

为了进行分析，建议实际上可以使用任何被怀疑含有待检测的苜蓿植物抗真菌蛋白或肽或苜蓿植物抗真菌蛋白相关肽或抗体的样品。预计这些实施方案可用于滴定抗原或抗体样品，以及筛选杂交瘤等。在相关的实施方案中，本发明涉及可用于检测样品中苜蓿植物抗真菌蛋白或相关肽和/或抗体的存在的试剂盒。样品可以包括被怀疑含有苜蓿植物抗真菌蛋白或肽的细胞、细胞上清液、细胞悬浮液、细胞提取物、酶级分、蛋白提取物、或其它无细胞组合物。严格来说本发明的试剂盒可以包括一种合适的苜蓿植物抗真菌蛋白、肽或抗所述蛋白或肽的抗体，和一种免疫检测试剂，以及用于容纳所述抗体或抗原和试剂的装置。所述免疫检测试剂通常包括一种与所述抗体或抗原结合的，或与第二结合配体结合的标记物。代表性的配体可以包括已结合有标记物的针对所述第一抗体或抗原或生物素或亲和素(或链霉亲和素)的第二抗体。当然，如上文所述，有多种标记物的例子都是本领域人员众所周知的，这些标记物均可用于本发明中。

所述容器通常包括一个可以放置所述抗体、抗原或检测试剂的小瓶，并且优选适当地等分过的小瓶。本发明的试剂盒通常还包括供商业销售使用的用于密封容纳所述抗体、抗原、和试剂容器的装置。所述容器可以包括注模或吹塑的塑料容器，将所需要的小瓶固定在该容器中。

2.10组合物表位核心序列

本发明还涉及无全细胞及其它肽的蛋白或肽组合物，该组合物含有一种纯化的蛋白或肽，在该蛋白或肽上整合了一种能与一种或几种抗苜蓿植物抗真菌蛋白抗体发生免疫交叉反应的表位。具体地讲，本发明涉及源于苜蓿植物抗真菌蛋白或肽的表位核心序列。

在本文中，“整合了一种能与一种或或几种抗苜蓿植物抗真菌蛋白抗体发生免疫交叉反应的表位”一句是指一种肽或蛋白抗原，该抗原包括类似于位于苜蓿植物抗真菌蛋白或多肽中的一个表位的一级、二级或三级结构。其相似程度通常能达到这种水平：抗所述苜蓿植物抗真菌蛋白或多肽的单克隆或多克隆抗体能与之结合、反应、或以其它方式识别所述交叉反应的肽或蛋白抗原。可将所述抗体用于多种免疫测定方法中，例如，Western印迹分析、ELISA、和RIA等，这些方法是本领域技术人员所熟知的。

苜蓿植物抗真菌蛋白免疫显性表位和/或其适用于疫苗的功能性等同物的鉴定是比较简单的事情。例如，可以使用由Hopp在US4，554，101中所披露的方法，该专利被收作本文的参考文献，该专利披露了根据亲水性由氨基酸序列鉴定并制备表位的方法。在若干其它文献中所披露的方法，以及基于这些方法的软件程序也可用于鉴定表位核心序列(例如，参见Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；US4,554,101)。可通过采用肽合成或重组技术将所述“表位核心序列”的氨基酸序列方便地整合到肽中。

用于本发明的优选肽通常为大约8-20个氨基酸长，更优选为大约8-15个氨基酸长。有人认为，在某些场合下使用较短的抗原性苜蓿植物抗真菌蛋白衍生的肽具有优势，例如，在制备免疫学检测试验时就是这样。典型的优点包括容易制备和纯化，较低的成本和较高的生产可再现性，以及有利的生物分布。

有人建议通过制备含有修饰过的和/或延长了的表位/免疫原核心序列的合成肽可以实现本发明的特殊优点，通过这种方法可以产生针对苜蓿植物抗真菌蛋白，特别是针对AlfAFP相关序列的“通用”表位肽。这种表位核心序列在本发明的特定场合下被确定为所述特定多肽抗原的亲水部分。有人认为该部分最有可能促进T细胞或B细胞的刺激作用，因此，能诱导特定抗体的产生。

本文所述的表位核心序列是一种较短的氨基酸片段，该片段“互补”于本文所披露的苜蓿植物抗真菌蛋白抗体上的抗原结合位点，因此能与该位点结合。另外，表位核心序列还可以是这样一种物质：它所诱导的抗体能与针对本发明肽组合物的抗体发生交叉反应。可以理解，在本说明书的含义范围内，“互补”一词是指彼此之间具有吸引力的氨基酸或肽。因此，本发明的某些表位核心序列实际上可根据其与相关的蛋白针对的抗血清竞争结合所希望的蛋白抗原的能力或排斥这种结合的能力进行定义。

一般，所述多肽抗原的大小不被认为是特别重要的，只要这种抗原大到足于携带特定的核心序列或序列即可。一般，本发明所披露的预期的最小有用核心序列的长度为大约8个氨基酸，更优选10-20个氨基酸的序列。因此，这一大小一般相当于用本发明方法制备的最小的肽抗原的大小。不过，如果需要的话，所述抗原的大小可以更大一些，只要它含有一个基础表位核心序列即可。

表位核心序列的鉴定对本领域技术人员来说是众所周知的，例如，在US4,554,101中所披露的，该专利被收作本文的参考文献，该专利披露了根据其亲水性由氨基酸序列鉴定并制备表位的方法。另外，有多种计算机程序可用于预测蛋白的抗原部分(例如，参见Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；)。根据本说明书，还可将计算机化的肽序列分析程序(例如，DNAStar^软件，DNAStar公司，Madison，WI)用于设计合成肽。

表位序列或在其序列中包括一个抗原表位的肽可以通过诸如固相方法的常规合成技术方便地实现(例如，通过使用市售肽合成仪进行，如Applied Biosystems Model430A肽合成仪)。然后，可将以这种方法合成的肽抗原以预定的量进行等分，并以常规方法保存，如保存于水溶液中或更优选为以粉状或冷冻干燥状态保存待用。

一般，由于肽具有相对的稳定性，如果必要的话可以水溶液形式将其保存相当长的时间，例如长达6个月或更长时间。实际上可以在没有明显降解作用或丧失其抗原活性的一切水溶液中保存。不过，当在水溶液中进行长时间的保存时，一般需要包括含有缓冲液的试剂，如Tris或磷酸缓冲液，以保持大约7.0-7.5的pH。另外，可能需要包括能抑制微生物生长的试剂，如叠氮化钠或硫柳汞。为了在水溶液中长期保存，需要将该溶液保存在大约4℃下，更优选冷冻保存。当然，当所述肽是以冻干或粉状形式保存时，实际上可以无限期的保存下去，例如，以计量过的等分试样保存，在使用之前可以用预定量的水(优选蒸馏水)或缓冲液对该试样进行重新水合。

2.11生物学功能等同物

2.11.1在其基础多肽序列中含有保守氨基酸改变的肽、多肽和蛋白

在生物学功能上等同于AlfAFP1和AlfAFP2的肽、多肽、和蛋白包括在其如序列2或序列14所示的基础序列中含有保守氨基酸变化的氨基酸序列。在所述氨基酸序列中，在所述基础序列上的一个或几个氨基酸被其它氨基酸所取代，取代氨基酸的电荷和极性类似于原有氨基酸的电荷和极性，即这是一种保守氨基酸取代，会导致一种沉默变化。

用于取代所述基础多肽序列中的氨基酸的取代基可以选自天然存在的氨基酸所属类型中的其它成员。可将氨基酸分成以下四种类型：(1)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性极性氨基酸；和(4)中性非极性氨基酸。以上各种类型的代表性氨基酸包括，但不限于(1)酸性(带负电荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。

在所述基础多肽序列中所发生的保守氨基酸变化，可以通过用属于同一类型的一种氨基酸取代该类型的另一种氨基酸而实现。AlfAFP1和AlfAFP2的生物学功能等同物可以具有10个或更少的保守氨基酸变化，更优选为具有7个或更少的保守氨基酸变化，最优选为具有5个或更少的保守氨基酸变化。因此，其编码核苷酸序列(基因、质粒DNA、cDNA、或合成DNA)具有相应的碱基取代，使其能编码AlfAFP1和AlfAFP2的生物学功能等同物。

本发明所涉及的生物学功能等同肽、多肽和蛋白应当与基础AlfAFP1和AlfAFP2的氨基酸序列或该序列中的相关部分具有大约80％或更高的序列相似性，优选大约为85％或更高的序列相似性，最优选大约为90％或更高的序列相似性。

正如所指出过的，可以对本发明的肽结构和编码这种肽结构的DNA片段进行修饰和改变，并且仍能得到一种功能性分子，该分子编码具有所需特性的蛋白或肽。以下说明基于通过改变蛋白中的氨基酸以产生一种等同的或甚至是改进的二代分子。在本发明的特定实施方案中，涉及将突变的苜蓿植物抗真菌蛋白用于加强所述蛋白的抗真菌活性，并因此加强重组转基因在植物细胞中的抗真菌活性和/或表达。所述氨基酸变化可以按照在表1中给出的密码子通过改变所述DNA序列的密码子而实现。表1氨基酸                        密码子丙氨酸    Ala    A    GCA    GCC  GCG  GCU半胱氨酸  Cys    C    UGC    UGU天冬氨酸  Asp    D    GAC    GAU谷氨酸    Glu    E    GAA    GAG苯丙氨酸  Phe    F    UUC    UUU甘氨酸    Gly    G    GGA    GGC  GGG  GGU组氨酸    His    H    CAC    CAU异亮氨酸  Ile    I    AUA    AUC  AUU  GCU赖氨酸    Lys    K    AAA    AAG亮氨酸    Leu    L    UUA    UUG  CUA  CUC  CUG  CUU甲硫氨酸  Met    M    AUG天冬酰胺  Asn    N    AAC    AAU脯氨酸    Pro    P    CCA    CCC  CCG  CCU谷氨酰胺  Gln    Q    CAA    CAG精氨酸    Arg    R    AGA    AGG  CGA  CGC  CGG  CGU丝氨酸    Ser    S    AGC    AGU  UCA  UCC  UCG  UCU苏氨酸    Thr    T    ACA    ACC  ACG  ACU缬氨酸    Val    V    GUA    GUC  GUG  GUU色氨酸    Trp    W    UGG酪氨酸    Tyr    Y    UAC    UAU

例如，可以用某些氨基酸取代一种蛋白结构中的其它氨基酸而不会显著降低其与诸如抗体的抗原结合部分或底物分子上的结合位点的结构的相互结合能力。因为是蛋白的相互作用能力和性质决定着蛋白的生物学功能活性，可以在该蛋白序列中进行某些氨基酸序列的取代，并理所当然的改变其DNA编码序列，而所获得的蛋白具有相似的特性。因此，本发明人设想可以对所披露的组合物的肽序列或编码所述肽的相关DNA序列进行改变，而又不会使其明显丧失生物学活性或用途。

在进行这种改变时，需要考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物学功能方面的重要性得到了本领域的普遍认同(Kyte和Doolittle，1982，被收作本文的参考文献)。人们认为，所述氨基酸的亲水特性会影响所得到的蛋白的二级结构，这种二级结构反过来又决定该蛋白与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。

每一种氨基酸都根据其亲水性和电荷特征赋予一种亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)，其中，异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

在本领域中众所周知的是，某些氨基酸可以用具有相似的亲水值或等级的其它氨基酸取代，而仍然能得到具有相似生物学活性的蛋白，即仍能获得一种生物学功能等同蛋白。在进行所述改变时，取代的氨基酸优选亲水指数在±2以内的氨基酸，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸，尤其亲水指数在±0.5以内的氨基酸。

本领域中还了解的是，类似氨基酸的取代可以根据亲水性有效进行。被收作本文参考文献的US4,554,101指出，由相邻的氨基酸的亲水性所决定的一种蛋白的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。

如在US4,554,101中所详细披露的，氨基酸残基具有以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

2.11.2 AlfAFP片段和变体

尽管本发明的抗真菌多肽优选包括序列2和序列14所示的氨基酸序列，不过，本发明还包括具有与所述抗真菌多肽相同或相似的抗真菌活性的所述序列的片段和变体。因此，序列2或序列14中的8个或更多个氨基酸的连续序列可能具有所述活性，例如，包括序列1。

AlfAFP1和AlfAFP2的片段可以是截短的形式，其中从该多肽的N-末端、C-末端、中部缺失了一个或几个氨基酸，或为以上缺失的组合。所述片段可以是AlfAFP1和AlfAFP2的天然存在的或合成的变体，但仍保留了AlfAFP1和AlfAFP2的抗真菌活性。

AlfAFP1和AlfAFP2的变体包括将一个或几个氨基酸插入其天然序列中的形式。所述变体还可以是天然存在的或合成的AlfAFP1和AlfAFP2的变体，但仍保留了AlfAFP1和AlfAFP2的抗真菌活性。

本发明还包括上述形式的组合，即同时含有氨基酸缺失和添加的多肽。其中还可以有氨基酸取代。

本发明所涉及的AlfAFP1和AlfAFP2的变体和片段应当优选与具有序列2和序列14所示相应氨基酸序列的AlfAFP1和AlfAFP2的相应部分具有大约70-75％或更高的序列相似性，更优选具有大约80％、85％、88％或更高的序列相似性，最优选具有大约90％或95％或更高的序列相似性。

2.11.3 AlfAFP的其它生物学功能等同形式

可用于本发明中的AlfAFP1和AlfAFP2的其它生物学功能等同形式包括上文所披露的多肽或其生物学功能等同物与其它肽、多肽、或蛋白的缀合物，以形成融合产物，该融合产物具有与具有序列2或序列14所示氨基酸序列的AlfAFP1和AlfAFP相同、相似的抗真菌活性或更高的抗真菌活性。

2.12蛋白组合物

提供了一种抗真菌组合物，该组合物含有抗真菌有效量的本发明所分离的一种或几种抗真菌多肽。优选的组合物含有序列2和序列14所示的氨基酸序列，以及一种可以接受的载体。抗真菌组合物可用于抑制病原真菌的生长或杀死病原真菌。所述组合物可以用常规方法制备，如披露于下列文献中的方法，Winnacker-Kuchler(1986)；van Falkenberg(1972-1973)；和K.Martens(1979)。必需的配制助剂，如载体、惰性材料、表面活性剂、溶剂、及其它添加剂同样是本领域中众所周知的，而且披露于诸如以下文献中：Watkins(YEAR)，和Winnacker-Kuchler(1986)。使用所述制剂，还可以制备本发明抗真菌多肽与其它抗真菌活性物质、肥料和/或生长调节剂等的混合物，所述混合物可以是成品制剂或罐装混合物形式。

本发明所涉及的抗真菌组合物还包括宿主细胞形式，如能产生本发明的抗真菌多肽的细菌和真菌细胞，所述细胞能定居在植物的根部和/或叶部。能以这种方式使用的细菌细胞的例子包括土壤杆菌属、节杆菌属、固氮螺菌属、棍状杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、根瘤杆菌属、和酵母属等的菌株。

可以与本发明抗真菌多肽组合的多种常见真菌抗生素和化学杀真菌剂是本领域中熟知的，并详细披露于Worthington和Walker(1983)的著述中。例如，所述真菌抗生素包括多氧菌素、三国霉素、羧酰胺、芳族糖类、萎锈灵、吗啉、固醇生物合成抑制剂、和有机磷化合物。可以与本发明的抗真菌多肽组配的其它活性成分包括杀昆虫剂、引诱剂、灭菌剂、杀螨剂、杀线虫剂和杀草剂。US5,421,839中包括对许多活性剂进行的综述，诸如本发明杀真菌多肽的物质可以与这些活性剂组配。

本发明的抗真菌多肽无论是单独使用或是与其它活性剂组合，其用量范围均大约为0.1-100mg/ml，优选为大约5-50mg/ml，其pH范围大约为3-9。例如，所述组合物可以用大约1mM-1M的磷酸缓冲液缓冲，该磷酸缓冲液的浓度优选为大约10-100mM，更优选为大约15-50mM。

因此，AlfAFP1，AlfAFP2及其生物学功能等同物预计可用于在多种植物中控制真菌，所述真菌的例子包括下列属和种：

链格孢属(芸苔链格孢Alternaria brassicola；茄链格孢Alternaria solani)；

壳二孢属(豌豆壳二孢Ascochyta pisi)；

葡萄孢属(灰葡萄孢Botrytis cinerea)；

尾孢菌属(菊池尾孢Cercospora kikuchii；玉米尾孢Cercosporazaea-maydis)；

刺盘孢属(豆刺盘孢Colletotrichum lindemuthianum)；

色二孢属(玉米色二孢Diplodia maydis)；

白粉菌属(禾白粉菌禾本科变种Erysiphe graminisf.sp.graminis；禾白粉菌大麦变种 Erysiphe graminisf.sp.hordei)；

镰孢属(雪腐镰孢Fusarium nivale；尖镰孢Fusarium oxysporum；禾本科镰孢Fusarium graminearum；大刀镰孢Fusarium vulmorum；腐皮镰孢Fusarium solani；串珠镰孢Fusarium moniliforme；粉红镰孢Fusarium roseum)；

顶囊壳属(禾顶囊壳小麦变种Gaeumanomyces graminisf.sp.tritici)；

长蠕孢属(大斑病长蠕孢Helminthosporium turcicum；灰色长蠕孢Helminthosporium carbonum；玉米长蠕孢Helminthosporiummaydis)；

壳球孢属(菜豆壳球孢Macrophomina phaseolina；Maganaporthegrisea)；

丛赤壳属(Nectria heamatococca)；

霜霉属(东北霜霉Peronospora manshurica；烟草霜霉Peronosporatabacina)；

茎点霉属(甜菜茎点霉Phoma betae)；

瘤梗孢属(多主瘤梗孢Phymatotrichum omnivorum)；

疫霉属(樟疫霉Phytophthora cinnamomi；恶疫霉Phytophthoracactorum；菜豆疫霉Phytophthora phaseolina；寄生疫霉Phytophthora parasitica；柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrothora；大雄疫霉大豆变种Phytophthora megasperma f.sp.sojae；致病疫霉Phytophthora infestans)；

单轴霉属(葡萄生单轴霉Plasmopara vitivola)；

单囊壳属(白叉丝单囊壳Podosphaera leucotricha)；

柄锈菌属(高粱柄锈菌Puccinia sorghi；条形柄锈菌Pucciniastriiformis；小麦柄锈病Puccinia graminisf.sp.tritici；天门冬属柄锈病Puccinia asparagi；隐匿柄锈菌Puccinia recondita；落花生柄锈病Puccinia arachidis)；

腐霉属(瓜果腐霉Pythium aphanidermatum)；

核腔菌属(偃麦草核腔菌Pyrenophora tritici-repentens)；

Pyricularia(Pyricularia oryzae)；

腐霉属(终极腐霉Pythium ultimum)；

丝核菌属(立枯丝核菌Rhizoctinia solani；禾本科丝核菌Rhizoctinia cerealis)；Scerotium(Scerotium rolfsii)；

核盘菌属(核盘菌Sclerotinia sclerotiorum)；

壳针孢属(番茄壳针孢Septoria lycopersici；大豆壳针孢Septoria glycines；颖枯壳针孢Septoria nodorum；小麦壳针孢Septoria tritici)；

梭壳孢属(茎生梭壳孢Thielaviopsis basicola)；

钩丝壳属(葡萄钩丝壳Uncinula necator)；

黑星菌属(苹果黑星菌Venturia enaequalis)；

轮枝孢属(大丽花轮枝孢Verticillium dahliae；黄萎轮枝孢Verticillium albo-atrum)；

通过下面所提供的详细说明和附图可以了解本发明的其它使用范围。不过，应当理解的是，所述详细说明和特定实施例尽管表示了本发明的优选实施方案，但给出这些实施例仅是为了说明目的，因为对本领域技术人员来说，通过阅读该详细说明在本发明构思范围内所作的各种改变和改进是显而易见的。

3.0附图说明

通过下面结合附图所作的详细说明，可以更好的理解本发明的上述及其它目的、特征、和优点，提出这些附图仅仅是为了说明目的，而不是为了限定本发明。

本发明给出的与质粒图谱中相同的DNA片段有：AMP：氨苄青霉素抗性、ori-pUC：源于pUC质粒的复制起点；LAC：Lac Z基因的部分序列；p-e35S：启动子e35S；HSP70内含子：源于玉米的热激蛋白70的内含子；NOS3’：农杆菌属Ti质粒的胭脂氨酸合成酶(nos)基因的3’非翻译部分；ori-M13：M13噬菌体复制起点；Spc/Str：细菌壮观霉素/链霉素抗性基因；p-MMV：玄参属花叶病毒35S启动子；EPSPS/CTP2：源于拟南芥属5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶基因(EPSPS)；CP4syn：合成的细菌glyphosate抗性CP4 5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶(EPSPS)基因；E9 3’：豌豆ssRUBISCOE9基因的3’非翻译区；PetHSP70-前导序列：矮牵牛热激蛋白70基因的5’非翻译前导序列；ori-322：pUC322复制起点。

图1表示AlfAFP1的cDNA核苷酸序列和推测的氨基酸序列。三角表示成熟AlfAFP1多肽的起点。下面划线的氨基酸序列表示信号肽。在下面划有双线的序列表示潜在的polyA信号序列。星号表示终止密码子。

图2是AlfAFP1、AlfAFP2和pI230的叠加比较。除了AlfAFP1之外，所有氨基酸序列均源于cDNA序列，并包括信号肽和成熟蛋白。线条表示保守氨基酸残基。AlfAFP1的成熟蛋白用黑体表示。

图3是回收的AlfAFP1和AlfAFP2的5’cDNAs的比较。相同的碱基用省略线表示。

图4是pMON23317的物理图谱。

图5是pMON22653的物理图谱。

图6是pMON22575的物理图谱。

图7是pMON22656的物理图谱。

图8是pMON17227的物理图谱。

图9是pMON22659的物理图谱。

图10是相当于表2数据的棒图，表示用表达AlfAFP1 cDNA的转基因马铃薯植物进行的黄萎病试验结果。

4.0 对典型实施方案的说明

4.1

本发明的研究所鉴定的cDNAs和其它核酸，在作为转基因整合到易感植物中后能产生对真菌病原体的抗性。通过以功能上可操纵的方式将所述DNA导入农艺、园艺、观赏、及其它经济上或商业上有利用价值的植物中，可使这些植物产生对真菌病原体的抗性，使所导入的DNA以能有效产生对真菌病原体的抗性的水平在所述植物中表达。

4.2定义

下列词句具有以下含义。

表达：细胞内过程的总称，包括由诸如结构基因的编码DNA分子所进行的转录和翻译，以产生多肽。

启动子：一个DNA序列上或一类DNA序列上的识别位点，由它提供结构基因的表达控制因子，而且，RNA聚合酶能与该位点特异结合，并启动所述基因的RNA合成(转录)。

再生：由植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)长成植株的过程。

结构基因：能表达生成一种多肽的基因。

转化：将外源DNA序列(例如，载体、重组DNA分子)导入细胞或原生质体的过程，其中，所述外源DNA序列被整合到染色体上或能够自主复制。

转化细胞：其DNA通过将外源DNA分子导入该细胞中而发生了改变的细胞。

转基因细胞：由转化细胞或植物产生或再生的一切细胞。典型的转基因细胞包括由转化的植物细胞，特别是诸如叶、根、茎的细胞，例如体细胞产生的植物愈伤组织，或获自转基因植物的生殖(胚)细胞。

转基因植物：由转化的植物细胞或原生质体所产生的植物或其后代，其中，该植物的DNA含有导入的外源DNA分子，该外源DNA分子原来并不存在于同一种天然的、非转基因植物中。“转基因植物”和“转化植物”两个名词在本领域中有时被作为同一名词用来定义其DNA中含有外源DNA分子的植物。不过，我们认为将由转化的植物细胞或原生质体获得的再生植株或愈伤组织称作转基因植物从科学角度讲更正确一些，因此，在本文的以下部分采用这一称呼。

载体：一种能够在宿主细胞中复制的和/或能与另一个DNA片段可操作地连接，以引起所连接的片段复制的DNA分子。质粒是一种典型的载体。

生物学功能等同物：在本文中，与本发明抗真菌蛋白相关的等同物是肽、多肽和蛋白，该等同物含有一个与本发明的新型肽，如AlfAFP1和AlfAFP2的序列具有相似性的序列或部分，该等同物具有与本文所披露的多肽相同或相似的功能特性，包括抗真菌活性。生物学等同物还包括能与抗AlfAFP1和AlfAFP2的抗体反应，即特异结合的肽、多肽和蛋白，这种等同物具有相同或相似的抗真菌活性，包括单克隆和多克隆抗体。

抗真菌多肽：是指具有抗真菌特性的多肽，例如，抑制真菌细胞生长，或杀死真菌细胞，或终止或延迟真菌生活周期的时机，如孢子萌发、孢子形成或交配。

消除或控制真菌损伤：从农业意义上讲，是指降低因感染真菌病原体而对作物造成的损伤。更常见的是，该短语是指减弱因不希望的真菌在任何特定位点出现而引起的不利影响。

结构编码序列：是指编码一种肽、多肽和蛋白的DNA序列，所述肽或蛋白是由细胞通过以下过程产生的：将该结构编码序列转录成信使RNA(mRNA)，然后将该mRMA翻译成所需要的肽、多肽或蛋白产物。

4.3探针和引物

由本发明所提供的DNA序列信息能够制备较短的DNA(或RNA)序列，该序列具有与本文所披露的特定多核苷酸基因序列进行特异性杂交的能力。可以根据特定的首蓿植物抗真菌蛋白基因序列，例如序列10或序列13所示的序列制备具有适当长度的核酸探针。所述DNA和核酸探针与苜蓿植物抗真菌蛋白基因序列进行特异杂交的能力使其特别适用于多种实施方案中。最重要的是，该探针可用于检测互补序列在特定样品中存在的多种试验中。

在某些实施方案中，优选使用寡核苷酸探针。所述引物的序列是使用本发明的多核苷酸设计的，将该引物用于通过PCR^TM技术检测、扩增或突变源于苜蓿属的苜蓿植物抗真菌蛋白基因的一个特定片段。还可以使用所述引物通过PCR^TM扩增源于其它种的与苜蓿植物抗真菌蛋白基因相关的片段。

为了产生本发明的某些优点，用于杂交研究或测定的优选核酸序列包括互补于苜蓿植物抗真菌蛋白编码序列，如序列10或序列13所示序列的一个至少14-30个核苷酸的片段的序列。至少14个核苷酸的长度大小有助于确保该片段具有形成一种稳定而又具有选择性的双链分子的足够长度。一般，不过，为了提高杂交的稳定性和选择性，优选在超过14个碱基的片段长度上具有互补序列的分子，并因此改善所得到的特异杂交分子的质量和程度。一般，优选设计出具有14-20个核苷酸的基因互补片段的核酸分子，如果需要的话可以更长。例如，通过采用核酸再生技术用化学方法直接合成可以方便地制备所述片段，如由US4,683,195和US4,683,202所披露的PCR^TM技术，以上专利被收作本文的参考文献，或通过从含有合适的插入片段和合适的限制位点的重组质粒中切除特定的DNA片段进行制备。

4.4重组载体

本发明涉及一种含有本发明多核苷酸的表达载体。因此，在一种实施方案中，表达载体是一种分离的和纯化的DNA分子，该分子包括一个与编码本发明的多肽的编码片段可操作地连接的启动子，所述编码片段还与一个转录终止信号连接，以便由所述启动子启动该编码片段的转录。

在本文中，“可操作地连接”一词是指是以这种方式与一个编码片段连接的启动子：该编码片段的转录受该启动子的控制和调节。将一个启动子与一个编码片段可操作地连接的方法在本领域中是众所周知的。

在另一个实施方案中，编码本发明的苜蓿植物抗真菌蛋白的DNA的重组表达是用转化过的格兰氏细菌，如大肠杆菌或假单胞菌宿主细胞完成的。能在大肠杆菌和其它格兰氏阴性宿主细胞中进行目标多肽的高效表达的启动子在本领域中是众所周知的。

在将本发明的表达载体用于转化植物时，选择具有能在植物中启动表达的能力的启动子。能在植物中起作用的启动子同样是众所周知的。可用于在植物中表达所述多肽的启动子是所披露的诱导型、病毒、合成的、组成型的(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)，并可以是时间调控的、空间调控的、和时-空调控的(Chau等，1989)。

4.4.1启动子

还要选择启动子指导转化的植物细胞或转基因植物的对编码片段的转录活性的能力。在植物组织中结构基因可以由多种启动子启动。启动子可以是近-组成型的，如CaMV35S启动子，或能影响双子叶植物或单子叶植物的组织特异性或发育特异性启动子。

正如所讨论的，可将编码AlfAFP1和AlfAFP2的DNA在植物细胞中的表达置于天然存在的同源启动子，或多种异源启动子的控制之下。在有关文献中披露了可在植物细胞中起作用的多种启动子。例如，其中包括胭脂氨酸合成酶(nos)、甘露氨酸合成酶(mas)和章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子，所述启动子由根癌农杆菌的致瘤质粒携带；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；强化CaMV35S启动子；玄参属花叶病毒(FMV)35S启动子；源于核糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的(ssRUBISCO)的光诱导型启动子；源于烟草的EIF-4A启动子(Mandel等，1995)；源于拟南芥属的壳多糖启动子(Samac等，1991)；源于花茎甘蓝的LTP(运脂蛋白)启动子(Pyee等，1995)；源于玉米的遍在蛋白启动子(Christensen等，1992)；以及源于稻的肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)。以上所有启动子均被用于构建在植物中表达的各种类型的DNA构建体。例如，参见PCT国际公开WO84/02913。

可用于本发明方法中的DNA构建体上的启动子可以根据其在受到真菌感染时赋予一种编码序列的特异表达的能力进行选择。由真菌病原体感染植物，可以诱导多种蛋白，这些蛋白被称为防卫相关的或致病相关的(PR)蛋白(Bowles，1990；Bol等，1990；Linthorst，1991)。所述防卫相关的或PR基因可以编码参与苯丙酸代谢的酶(例如，苯丙氨酸脱氨酶，查耳酮合成酶)，能修饰植物细胞壁的蛋白(例如，富羟脯氨酸糖蛋白，富甘氨酸蛋白，过氧化物酶)，能降解真菌细胞壁的酶(如，壳多糖酶，葡聚糖酶)，奇甜蛋白-样蛋白，或起功能尚不清楚的蛋白。业已从多种植物中提取并鉴定了防卫相关或PR基因。可将所述基因的启动子用于在受到真菌病原体感染的转基因植物中启动AlfAFP1和AlfAFP2及其生物学功能等同物的表达。例如，所述启动子源于从马铃薯植物中分离的防卫相关或PR基因(Fritzemeier等，1987；Cuypers等，1988；Logemann等，1989；Matton等，1989；Schroder等，1992)。另外，可以使用诸如获自烟草的PRP1启动子的病原体诱导型启动子(Martini等，1993)。

还可以根据其在AlfAFP1和AlfAFP2蛋白最为有效的组织中进行特异表达的能力选择启动子，所述组织如植物的开花部分(Weigel，1995)。

在任何场合下，被选择用于启动AlfAFP1和AlfAFP2在转基因植物中表达的特定启动子都应当能够促进抗真菌有效量的AlfAFP1和AlfAFP2在植物组织中的表达。能够启动所述表达的组成型启动子的例子有e35S，FMV35S，稻肌动蛋白，玉米遍在蛋白和eIF-4A启动子。

如果必要的话，可以对用于本发明DNA构建体中的启动子进行修饰，以影响其控制特性。例如，可将CaMV35S连接在ssRUBISCO基因的特定部分上，在没有光照的条件下，抑制该基因的表达，从而产生一种能在叶片中起作用但不能在根部起作用的启动子。对本发明来说，“CaMV35S”包括CaMV35S启动子的变体，例如，通过与操纵子片段连接、随机或受控制的诱变等所产生的启动子。另外，可以对用于本发明的启动子加以改变，使其含有多个增强子序列，以提高基因的表达水平。所述增强子序列的例子由Kay等披露(1987)。

当所述启动子是近-组成型启动子时，如CaMV35S，能在多种转化的植物组织(例如，愈伤组织、叶片、种子、和根)中加强多肽的表达。另外，可以使用含有组织特异性启动子的植物整合载体指导转化的效果。

一种典型的组织特异性启动子是对种子组织具有特异性的凝集素启动予。大豆种子中的凝集素蛋白是由单基因(Lel)编码的，该基因仅能在种子成熟过程中表达，其含量占种子总mRNA的大约2-5％。所述凝集素基因和种子特异启动子已被全面鉴定，并被用于在转基因烟草植物中指导种子特异性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。

4.4.2表达载体

制备表达载体的方法是本领域中众所周知的。用于转化植物的表达载体(转化载体)以及制备这种载体的方法披露于以下美国专利中：US4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011，以上专利所披露的内容被收作本文的参考。可以对所述载体进行修饰，使其含有本发明的编码序列。

业已建立了多种通过宿主的粘性末端或平末端将DNA可操作地连接到载体上的多种方法。例如，可以将互补的均聚物尾加到待插入载体DNA中的DNA片段上。然后通过所述互补的均聚尾之间的氢键将所述载体和DNA片段连接在一起，以形成重组DNA分子。

编码一种具有赋予细胞抗真菌活性多肽的能力的编码区优选为AlfAFP1或AlfAFP2基因。在优选实施方案中，所述多肽具有序列2或序列14所示的氨基酸残基序列，或所述序列的功能性等同物。按照该实施方案，所述编码区优选包括序列10所示的DNA序列或序列13所示的DNA序列。

由用组织特异性启动子转化的植物细胞所产生的本发明的转基因植物，可以与由不同组织特异性启动子转化的植物细胞所产生的第二种转基因植物杂交，以产生一种杂交转基因植物，这种杂交转基因植物能在一种以上的特定组织中表现出转化效应。

典型的组织特异性启动子有玉米蔗糖合成酶1(Yang等，1990)，玉米醇脱氢酶1(Vogel等，1989)，玉米集光复合体(Simpson等，1986)，玉米热激蛋白(Odell等，1985)，豌豆小亚基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)，Ti质粒甘露氨酸合成酶(Langridge等，1989)，Ti质粒胭脂氨酸合成酶(Langridge等，1989)，矮牵牛查耳酮异构酶(Van Tunen等，1989)，菜豆富甘氨酸蛋白1(Keller等，1989)，CaMV35S转录物(Odell等，1985)和马铃薯patatin(Wenzler等，1989)。优选的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

表达载体的选择以及最终将一种多肽编码区同哪一种启动子可操作地连接，直接取决于所希望的功能特性，例如，蛋白表达的位点和时间，以及待转化的宿主细胞。以上是在构建重组DNA分子时所固有的众所周知的限制因素。不过，用于实现本发明的载体能够指导可操作地与其连接的所述多肽编码区的表达。

用于在高等植物中表达基因的常用载体是本领域中众所周知的，并包括源于根癌农杆菌的Ti质粒的载体(Rogers等，1987)。不过，已知有几种其它的植物整合载体系统能在植物中起作用，包括pCaMVCN转移控制载体(Fromm等，1985)。质粒pCaMVCN(由Pharmacia出售，Piscataway，NZ)包括花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子。

在优选实施方案中，用于表达所述多肽的载体包括一个选择标记，该标记能在植物细胞中起作用，优选为抗药性选择标记。一种优选的抗药性标记是一种基因，该基因的表达可产生卡那霉素抗性；即含有胭脂氨酸合成酶启动子，Tn5新霉素磷酸转移酶II(nptII)和胭脂氨酸合成酶3’非翻译区的嵌合基因(Rogers等，1988)。

本发明的嵌合构建体的3’非翻译区应当含有转录终止子，或一个具有相同功能的元件，以及一个聚腺苷酸化信号，该信号在植物中起着导致腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3’末端的作用。所述3’区的例子包括含有农杆菌属Ti质粒基因的聚腺苷酸化信号的3’转录的、非翻译的片段，如胭脂氨酸合成酶(nos)基因，以及植物基因，如大豆7s储藏蛋白基因和豌豆ssRUBISCO E9基因(Fischoff等，欧洲专利申请0 385962)。举例来说，可将以上因子进行组合，以产生一种重组的、双链DNA分子，该分子包括从5’至3’方向可操作地连接的以下部分：

a)一个启动子，该启动子能在植物细胞中起作用，导致一种mRNA序列的产生；

b)一种编码AlfAFP1或AlfAFP2的DNA编码序列；和

c)一个3’非翻译区，它能在植物细胞中起作用，导致转录的终止和聚腺苷酸化核苷酸向所述RNA序列的3’末端添加。

AlfAFP1和AlfAFP2的DNA编码序列可以包括序列13或序列6所示的完整的核苷酸序列或其具有相同功能的任何部分，如截短的形式。另外，为了利用所述肽产生抗所述抗真菌多肽的抗体，需要表达该抗真菌多肽的表位区。

通常，位于所述聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对处的DNA序列起着终止转录的作用。该DNA序列在本文中被称为转录终止区。该区是对转录的信使RNA(mRNA)进行有效聚腺苷酸化所需要的，并被称为3’非翻译区。RNA聚合酶能通过聚腺苷酸化的起始位点转录编码DNA序列。

还可将翻译增强子作为所述载体DNA的一部分整合进去。因此，本发明的DNA构建体还应当优选包括一个或几个5’非翻译前导序列，该序列起着增强由所得到的mRNA转录物所得到的基因产物的表达。所述序列可源于被选择用于表达该基因的启动子或可对其进行特异修饰，以加强mRNA的翻译。片段还可以从病毒RNA、合适的真核基因、或合成基因序列获得(Griffiths等，1993)。

希望所述“增强子”序列能加强或改变所得到的mRNA的翻译效率。本发明并不局限于这样的构建体：其中增强子源于天然的5’非翻译启动子序列，而且，还可以包括源于其它不相关的启动子的非翻译前导序列，如其它增强子转录激活物或基因。例如，矮牵牛热激蛋白70(Hsp70)含有所述前导序列(Winter，1988)。

4.4.3用于在转基因植物中表达AlfAFP的DNA构建体

如上文所述，本发明提供了有利于本发明所讨论的DNA序列在高等植物和各种微生物中表达的DNA构建体或表达载体。在本文中，“载体构建体”或“表达载体”是指以功能性形式可操作地连接的DNA片段组件，该组件能指导本文所讨论的DNA序列，以及任何感兴趣的其它序列或基因的表达。

以双链DNA形式存在的植物结构编码序列(基因、cDNA、合成DNA或其它DNA)的表达包括通过RNA聚合酶由所述DNA的一股链转录信使RNA(mRNA)，以及随后在细胞核里面对该mRNA的原始转录物进行加工。所述加工涉及3’非翻译区，该区能将聚腺苷酸化核苷酸添加到该mRNA的3’末端。

由DNA到mRNA的转录过程是受一段被称为“启动子”的DNA调控。该启动子片段包括一个碱基序列，该序列指示RNA聚合酶与所述DNA结合，并用该DNA的一股链作为模板开始mRNA的转录，以形成相应的RNA链。

因此，可用于本发明的载体包括可操作地与感兴趣的编码序列连接的启动子因子，并且，还可以包括5’非翻译前导序列，3’非翻译区，以及一个或几个选择标记。有多种这样的标记是本领域中众所周知的。

4.4.4所述cDNA序列的核苷酸序列生物学功能等同物

本发明不仅包括如序列13或序列6所示的cDNA序列，而且还包括在生物学功能上等同的核苷酸序列。“生物学功能上等同的核苷酸序列”一词表示DNA和RNA，包括基因组DNA，质粒DNA，cDNA，合成DNA和mRNA核苷酸序列，它编码具有与AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的肽、多肽和蛋白，即在将其以功能上可操作地方式导入宿主细胞以便其能够表达时，它能以足于赋予宿主细胞或植物对真菌病原体的抗性的量产生具有抗真菌活性的肽、多肽或蛋白。

4.4.5编码AlfAFP保守氨基酸改变的核苷酸序列

本发明的生物学功能等同核苷酸序列，包括编码基础AlfAFP1和AlfAFP2氨基酸序列中的保守氨基酸改变的核苷酸序列，能使其产生沉默变化。所述核苷酸序列包括相对编码野生型AlfAFP1和AlfAFP2的核苷酸序列的相应碱基取代。

4.4.6含有碱基取代、添加、或缺失的核苷酸序列

除了编码所述基础AlfAFP1和AlfAFP2多肽序列中的保守氨基酸改变的核苷酸序列之外，本发明的生物学功能等同核苷酸序列还包括含有其它碱基取代、添加、或缺失的核苷酸序列。其中包括含有与序列13或序列6所示DNA相同的遗传信息的核酸，该核酸编码能赋予宿主细胞和植物与AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌抗性的肽、多肽或蛋白。所述核苷酸序列可被称为“序列13或序列6所示cDNA的遗传学上等同的修饰形式”，并可以用本文所披露的方法鉴定。在编码AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA、质粒DNA、基因组DNA、合成DNA或其它核酸中所产生的突变优选能保留该编码序列的读框。另外，所述突变优选不会产生互补片段，这种片段能够杂交以产生二级mRNA结构，如环或发卡，这种二级结构会对mRNA翻译产生不利影响。

尽管突变位点可以预先确定，但没有必要预先确定突变本身的性质。例如，为了在特定位点上选择最佳突变特性，可以在靶密码子上进行随机诱变。

另外，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸将突变引入特定位点，在所述突变序列的旁侧是限制位点，使其能够连接到天然AlfAFP1或AlfAFP2的cDNA序列的片段上。在进行连接以后，所得到的重构核苷酸序列编码具有所需的氨基酸插入、取代或缺失的衍生形式的AlfAFP1或AlfAFP2。

在任何情况下，都可以通过诸如例3中所披露的方法筛选所表达的突变体的希望的抗真菌活性。

序列13或序列6的cDNA的有用的遗传学等同修饰形式的具体例子包括具有与序列13或序列6的cDNA有很高同源性，即序列相同性的核苷酸序列的DNA。可以与序列13或序列6的cDNA或其相应部分有大约70％或更高的序列相同性，更优选大约80％或更高的序列相同性，最优选大约90％或更高的序列相同性。

所述遗传学上等同的修饰形式可以用常规的DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术(Sambrook等，1989)提取或通过聚合酶链式反应(PCR^TM)方法扩增。所述修饰形式应当具有在通过常规转化技术将其导入正常情况下对真菌病原体敏感的植物细胞中后，赋予该植物对所述真菌病原体的抗性的能力。

4.4.7编码AlfAFP的片段和变体的核苷酸序列

在例5中所讨论的AlfAFP1和AlfAFP2的片段和变体可以由cDNA、质粒DNA、基因组DNA、合成DNA或mRNA编码。所述核酸与具有序列13和序列6中所示核苷酸序列的编码AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA的相应片段或部分，或与其对应的mRNA之间具有大约70％或更高的序列相似性，优选大约80％或更高的序列相似性，最优选大约90％或更高的序列相似性。

在本发明中，具有序列13和序列6所示核苷酸序列的AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA的核酸生物学功能等同物包括：

1)其长度通过天然或人工突变，如部分核苷酸缺失、插入、添加等而发生了改变的DNA，因此，当序列13的完整长度被100％地采用时，所述生物学功能等同序列的长度大致为序列13或序列6所示序列的60-120％，优选80-110％；或

2)含有部分(优选为其完整长度的20％或更低，优选为10％或更低，更优选为5％或更低)天然或人工突变的核苷酸序列，以使该序列能编码不同的氨基酸。不过，其中，所得到的多肽保留了AlfAFP1和AlfAFP2的抗真菌活性。以这种方法产生的突变DNA通常编码一种与由序列13和序列6的核苷酸序列所编码的AlfAFP1和AlfAFP2(序列2)的氨基酸序列之间具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高的序列相同性的多肽。

在本发明中用于产生人工突变的方法并不受特别的限制，而且所述突变可以用本领域中任何常规方法产生。

例如，可以用合适的限制酶对AlfAFP1或AlfAFP2的cDNA或基因进行处理，以便插入或缺失合适的DNA片段，使正确的氨基酸读框得以保存。在用限制性内切酶处理之后，对消化过的DNA进行处理，以补平所有的突出端，并将这些DNA重新连接。

还可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸序列将突变引入特定的位点，该序列旁侧的限制位点使其能被连接到天然AlfAFP1或AlfAFP2的cDNA或基因组序列的片段上。在连接以后，所得到的重构序列编码具有所希望的氨基酸插入、取代或缺失的衍生物。

另外，可将寡核苷酸位点专一性或片段专一性诱变方法用于产生改变了的cDNA或基因组DNA序列，该序列可根据所需要的取代、缺失或插入而具有特定的密码子变化。

产生上述变化的代表性方法披露于以下文献中：Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik等(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)；和Walder等(1986)。可以对通过上述任一种方法产生的本发明所披露的cDNA序列的生物学功能等同物进行选择，选择是通过用例3所述的方法测定其所编码的肽、多肽或蛋白而进行的。

4.4.8编码能与抗AlfAFP的抗体反应的肽、多肽和蛋白的核苷酸序列

编码AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA的生物学功能等同形式包括编码能与抗AlfAFP1和AlfAFP2的抗体起反应，即特异结合的肽、多肽和蛋白的核苷酸序列，它具有与该多肽相同或相似的抗真菌活性。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

4.4.9遗传学简并核苷酸序列

由于遗传密码的简并性，即天然存在蛋白中的大部分氨基酸具有一个以上的密码子，可以将其它DNA(和RNA)序列用于实施本发明，所述其它DNA序列含有大体上与本发明的cDNA相同的遗传信息，并编码大体上与由序列13与序列6的核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。这一原理同样适用于本文所讨论的任何其它核苷酸序列。

4.4.10为了增强在特定宿主细胞中表达而设计的合成DNA序列

本发明cDNA的生物学功能等同形式还包括为了增强在特定宿主细胞中表达而设计的合成DNAs。宿主细胞通常具有优选形式的密码子使用(Murray等，1989)。因此，为了增强在特定宿主中表达而设计的合成DNA s应当体现该宿主细胞中的密码子使用形式。

在本发明中，可以用序列分析软件包的“BestFit”或“Gap”程序测定序列相似性或相同性(遗传学计算机组公司，威斯康逊大学生物技术中心，Madison，WI53711)。

4.4.11编码融合形式AlfAFP1的核苷酸序列

可用于本发明的序列13或序列6的cDNA的其它生物学功能等同形式包括这样的序列：该序列被修饰成能编码与其它肽、多肽或蛋白的缀合物，如在“本发明概述”和例5部分所讨论的，因此它能编码一种融合产物。

4.4.12通过杂交检测AlfAFP cDNA的生物学功能等同形式

尽管在序列13或序列6中示出了编码AlfAFP1和AlfAFP2的核苷酸序列的一种实施方案，但应当理解的是，本发明还包括能与序列13和序列6的序列及其互补序列杂交的核苷酸序列，而且该序列所编码的肽、多肽和蛋白具有与AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性。所述核苷酸序列优选能在中等至高度严格的条件下与序列13和序列6或其互补序列杂交(参见Samrook等，1989)。典型的条件包括首先在6XSSC，5XDenhardt’s溶液，100mg/ml鱼精DNA，0.1％SDS中，在55℃进行足够时间(例如，几小时至过夜)长度的杂交，接着洗涤两次，每次15分钟，洗涤是在室温下在2XSSC，0.1％SDS中进行的，接着再在0.5-1XSSC，0.1％SDS中，在55℃下进行两次，每次15分钟，然后进行放射性自显影。通常，当所述杂交混合物在0.1XSSC中洗涤至少一次时所述核酸分子能够杂交，所述洗涤是在55℃，优选60℃，更优选65℃的温度下进行的。

本发明还涉及能在相当于上述条件的盐和温度条件下与序列13和序列6的cDNA杂交的核苷酸序列，该核苷酸序列所编码的肽、多肽和蛋白具有与本发明所披露的AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性。

如果上述核苷酸序列所编码的肽、多肽或蛋白的抗真菌活性与AlfAFP1和AlfAFP2抗真菌活性相差大约±25％或更低，则认为该序列具有大体上与编码AlfAFP1和AlfAFP2的序列13和序列6的cDNA相同的生物学功能。

4.4.13能与抗AlfAFP的抗体起反应的肽、多肽和蛋白

AlfAFP1和AlfAFP2的生物学功能等同形式还包括能与抗AlfAFP1和AlfAFP2的抗体起反应，即特异结合的肽、多肽和蛋白，它具有与该多肽相同或相似的抗真菌活性。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

4.5新型抗真菌蛋白的鉴定

本发明还提供了构成AlfAFP1或AlfAFP2抗真菌蛋白的全部或一部分的新型多肽。AlfAFP1是分子量大约为5,186道尔顿的多肽。SDS凝胶电泳显示其大致分子量为6kDa。按照例2所述方法测定氨基酸序列，并按照例3所述方法测定其生物学效力。其氨基酸序列包括序列2所示的45个氨基酸。

4.7转化的宿主细胞和转基因植物

本发明的其它方面包括用一种或几种表达载体转化细菌、酵母细胞、植物细胞或完整的植株的方法和组合物，所述表达载体含有苜蓿植物抗真菌蛋白编码基因片段。由所述转化方法所产生的转基因细菌、酵母细胞、植物细胞或由所述转化方法所产生的植物或由转基因植物所产生的子代和种子是本发明的进一步的实施方案。

用于转化细菌和酵母细胞的方法为本领域所熟知。通常，转化方法类似于用于转化诸如大肠杆菌或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的其它细菌或真菌的众所周知的方法。用DNA转化植物细胞的方法包括农杆菌介导的植物转化，原生质体转化，将基因转入花粉，注射到生殖器官，注射到成熟的胚和粒子轰击。所述每一种方法具有独特的优点和缺点。因此，将基因导入一种特定植物种的一种特定方法对另一种植物种来说不一定是最有效的，不过，将哪一种方法用于特定的植物种是众所周知的。

存在很多用于将转化DNA片段导入细胞中的方法，但并不是所有方法都适用于将DNA转入植物细胞中。据信，合适的方法实际上包括可将DNA导入细胞的所有方法，如农杆菌感染，通过PEG-介导的原生质体转化直接导入DNA(Omirullh等，1993)，通过脱水/抑制-介导的DNA摄取，通过电穿孔，通过用碳化硅纤维激发，通过加速涂有DNA的粒子等。在某些实施方案中，优选加速方法，其中包括，例如微粒轰击等。用于将DNA导入细胞的方法为本领域技术人员所熟知。业已披露了四种用于将基因导入细胞的方法：(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法，如微量注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；US5,2384,253)和基因枪(Johnston，Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受体-介导机制(Curiel等，1994；1992；Wagner等，1992)。

4.7.1电穿孔

对多种动物和植物细胞施加简单的高电压电脉冲可导致在其细胞质膜上形成纳米级的孔。通过这些孔将DNA直接摄入细胞质中，或因为细胞膜成分的再分配而进入细胞质中，与此相伴的是所述孔的关闭。电穿孔方法可能极其有效，既可用于克隆基因的瞬时表达，又可用于建立带有整合的感兴趣的基因拷贝的细胞系。与磷酸钙介导的转染和原生质体融合不同，电穿孔方法通常能产生带有一个或至多几个整合的外源DNA拷贝的细胞系。

通过电穿孔方法导入DNA的技术，是本领域技术人员所熟知的。在该方法中，要使用某些细胞壁降解酶，如果胶降解酶，使得靶受体细胞比未处理过的细胞更容易通过电穿孔方法转化。或者，通过机械创伤使得受体细胞更容易被转化。为了通过电击法进行转化，人们可以采用诸如细胞悬浮培养物或胚发生愈伤组织的易碎组织，或者直接转化未成熟的胚或其它有机组织。人们可以通过用果胶降解酶(果胶裂解酶)处理或以受控制的方式进行机械创伤对所选择的细胞的细胞壁进行部分降解。这种细胞随后可以通过电击法接受DNA转移，电穿孔可以在这一时期进行，然后通过合适的选择或筛选方法鉴定转化的细胞，所述筛选方法取决于新整合的DNA的性质。

4.7.2微粒轰击

用于将转化DNA片段导入细胞的另一种优选方法是微粒轰击。在该方法中，可以用核酸涂覆粒子，并通过推力将其送入细胞。典型的粒子包括由钨、金、白金等组成的颗粒。

微粒轰击除了是一种再生稳定转化的单子叶植物的有效方法之外，其另一个优点是既不需要提取原生质体(Cristou等，1988)，又不需要易受农杆菌属感染。用于通过加速将DNA导入玉米细胞中的一种代表性实施方案是Biolistics Particle Delivery System，该装置可用于将涂有DNA的颗粒或细胞通过一个诸如不锈钢或Nytex网的网射在覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤膜表面上。所述网将所述颗粒分散，以便这些颗粒不会以大的团聚体输入受体细胞中。据信，插在所述微粒装置和待轰击的细胞之间的网可以降低微粒团聚体的大小，并可以以较高的频率转化，因为降低了由于过大的微粒对受体细胞造成的伤害。

对轰击而言，优选将悬浮液中的细胞浓缩在滤膜或固体培养基上。另外，可以将未成熟的胚或其它靶细胞放在固体培养基上。将待轰击的细胞放在大颗粒阻挡板下方的合适距离处。如果需要还可将一个或几个网放在所述加速装置和待轰击的细胞之间。通过使用本发明的技术可以获得多达一千个或更多个能瞬时表达一种标记基因的细胞转化灶。能在轰击之后48小时表达所述外源基因产物的转化灶中的细胞数，通常为1-10个，平均为1-3个。

在轰击转化时，人们可以优化轰击前培养条件和轰击参数，以产生最大数量的稳定转化体。在该方法中，用于轰击的物理和生物学参数都很重要。物理因素有参与DNA/微粒沉淀的控制的因素，或影响所述大颗粒或微颗粒的飞行和速度的因素。生物学因素包括在轰击之前和轰击之后对细胞进行操作的所有步骤，为了减轻与轰击相关的创伤而对靶细胞进行的渗透压调节，以及转化DNA的性质，如线性化DNA或完整的超螺旋质粒。据信，对于未成熟胚的成功转化来说，轰击前操作是特别重要的。

因此，在小规模研究中人们希望调节各种轰击参数，以全面优化其调节。人们可能特别希望调节诸如间隙距离、飞行距离、组织距离、和氦气压力之类的物理参数。还可以通过改变影响受体细胞的生理状态的条件降低创伤减弱因子(TRFs)，并能因此影响转化和整合的效率。例如，为了进行最佳的转化，可以对渗透压状态、组织水合和继代培养阶段或受体细胞的细胞周期进行调整。通过阅读本说明书，本领域技术人员可以了解其它常规调节的执行情况。

4.7.3农杆菌介导的转移

农杆菌介导的转移是一种被普遍用于将基因导入植物细胞的系统，因为，可将DNA导入全植株组织中，省略了由原生质体再生全植株的必要性。用农杆菌介导的植物整合载体，将DNA导入植物细胞的方法在本领域中是众所周知的。例如，参见公开的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。另外，Ti-DNA的整合是一种比较精确的方法，会产生很少的重组。待转移的DNA片段由边界序列确定，而间插DNA通常是以所披露的方式插入植物基因组中(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。

现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌属中复制，可以用所公开的方法进行方便地操作(Klee等，1985)。而且，在用于农杆菌介导的基因转移载体方面的最新技术发展改善了基因或限制位点在所述载体中的排列，以便构建能够表达各种多肽编码基因的载体。所披露的载体(Rogers等，1987)具有常见的多接头片段，其旁侧为一个启动子和一个聚腺苷酸化位点，用于指导插入的多肽编码基因的表达，并适用于本发明目的。另外，含有有臂和无臂Ti基因的农杆菌属可用于转化。在农杆菌介导的转化有效的植物种中，由于该方法的简易和确定的基因转移性质而选择该方法。

农杆菌介导的叶片和诸如子叶和下胚轴的其它组织的转化似乎局限于受农杆菌天然感染的植物。农杆菌介导的转化在双子叶植物中最为有效。虽然单子叶植物不是农杆菌属的天然宿主，但业已报导了用农杆菌属载体实现了天门冬属的转化(Dytebier等，1987)。

用农杆菌转化方法所产生的转基因植物通常含有位于一条染色体上的单基因。所述转基因植物相对所增加的基因而言可以被称为杂合的。不过，“杂合的”一词的使用通常意味着在染色体对的第二条染色体上的相同的位点上存在一个互补基因，但在本发明的含有一个添加基因的植物中没有这样的互补基因，有理由相信这种植物的更准确的名称是独立的分离体，因为所述添加的外源基因在有丝分裂和减数分裂期间是独立分离的。

更优选的是对所述添加的结构基因而言是纯合的转基因植物；即一种含有两个添加基因的转基因植物，在染色体对的每一条染色体的相同位点上各有一个基因。纯合转基因植物可以通过以下方法获得：使含有单一的添加基因的独立分离的转基因植物进行有性交配(自交)，让某些所产生的种子萌发，对所得到的植株进行分析，分析其相对对照(天然的、非转基因的)或独立分离转基因植物的增强了的转基因活性。

可以理解，可以让两种不同的转基因植物进行交配，以产生含有两个独立分离的、添加的外源基因的后代。通过合适子代的自交可以产生对于两个添加的外源基因来说都是纯合的植株，所述外源基因编码感兴趣的多肽。还可以与一个亲本植株进行回交，和与一种非转基因植物进行异型杂交。

4.7.4其它转化方法

植物原生质体的转化可以用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔、和以上处理的组合的方法实现(例如，参见Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1986；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。

所述系统在不同植物种上的应用取决于特定植物种由原生质体再生的能力。披露了用于禾谷类植物由原生质体再生的典型方法(Fugimura等，1985；Toriyema等，1986；Yamada等，1985；Abdullah等，1986)。

为了转化不能由原生质体成功地再生的植物种，可以使用其它方法将DNA导入完整的细胞或组织。例如，可以用公开的方法实现谷类由未成熟的胚或外植体进行的再生(Vasil，1988)。另外，可以使用“粒子枪”或高速微粒方法(Vasil，1992)。

使用后一种方法，让携带在小的金属颗粒表面上的DNA通过细胞壁进入细胞质，正如所披露的那样(Klein等，1987；Klein等，1988；McCabe等，1988)。所述金属颗粒能穿透几层细胞，因此，能转化组织外植体中的细胞。

4.8生产抗真菌转基因植物的方法

通过用含有重组AlfAFP1和/或AlfAFP2的基因片段转化诸如植物细胞的合适宿主细胞，其所编码的苜蓿植物抗真菌蛋白的表达可导致抗真菌植株的形成。

具体来说，可以用一种含有苜蓿植物抗真菌蛋白的编码片段和合适的选择标记的表达载体转化诸如小麦或玉米细胞的胚性植物细胞的悬浮液，转化是使用诸如粒子轰击的方法进行的(Maddock等，1991；Vasil，1992)，以便将涂覆在微粒上的DNA导入受体细胞。然后由能表达所述抗真菌蛋白的转化胚愈伤组织再生转基因植株。

还可以用其它细胞转化方法实现转基因植物的形成，这些方法为本领域所熟知，如农杆菌介导的DNA转移(Fraley等，1983)。可以通过直接DNA转移将DNA导入花粉(Zhou等，1983；Hess等，1987；Lou等，1988)，通过将DNA注射到植物的生殖器官(Pena等，1987)，或通过将DNA注射到未成熟胚的细胞中而将DNA导入植物中，然后使脱水的胚重新水合(Neuheus等，1987；Bendrook等，1986)。

由单个的植物原生质体转化体或各种转化的外植体进行的植株的再生、发育、和培养为本领域所熟知(Weisseach和Weisseach，1988)。所述再生和生长过程通常包括以下步骤：选择转化的细胞，培养这些独特的细胞，使其通过常见的胚胎发育阶段，通过长根的小植株阶段。以类似方法再生转基因胚和种子。然后将所得到的转基因长根的幼苗种植到诸如土壤的合适植物生长介质中。

由叶片外植体进行的含有通过农杆菌导入的编码感兴趣的多肽的外源基因的植物的发育或再生可以通过本领域众所周知的方法完成，如由Horsch等(1985)所披露的。在该方法中，在有选择试剂的条件下，在能诱导被转化的植物种再生幼苗的培养基中培养转化体，如所披露的(Fraley等，1983)。

所述方法通常能在2-4个月内产生幼苗，然后将这些幼苗转移到合适的根诱导培养基中，该培养基含有选择试剂和一种抗生素，以抑制细菌的生长。在有选择试剂的条件下能长根的幼苗形成小植株，然后将这些小植株移植到土壤或其它介质中，以便产生根。所述方法根据所使用的特定植物种而变化，这种变化在本领域中是众所周知的。

优选地，让再生的植株自花授粉，以产生纯合的转基因植物，如上文所述。或者，让由所述再生植株获得的花粉与农业上重要的结实植物杂交，所述植物优选为近交系。相反，可将所述重要的近交系的花粉用于为再生的植株授粉。用本领域技术人员熟知的方法栽培本发明的含有一种需要的多肽的转基因植物。

因此，本发明的转基因植物具有较大量的编码区(例如，AlfAFP基因)，该基因编码感兴趣的AlfAFP多肽。优选的转基因植物是一种独立的分离体，它能将所述基因及其活性传给其子代；例如，所述基因处于纯合或杂合状态的转基因植物，并能将所述基因传给其所有有性杂交的后代。还可以用营养繁殖或嫁接的方法获得无性系。另外，可将转基因植物的种子种植到大田中或温室中，并让所得到的性成熟的转基因植物进行自花授粉，以产生纯育植株。由这些植株所产生的后代形成纯育系，评价所述纯育系例如加强了的抗真菌病原体的抗真菌能力，所述评价优选在大田中、在环境条件下进行。本发明人认为，本发明特别适用于产生具有商业价值的转基因植物，包括各种草坪草、小麦、玉米、稻、大麦、燕麦、马铃薯、大豆、棉花、诸如草莓的浆果、各种观赏植物和蔬菜、以及多种长坚果和长水果的树木和植物。

4.9表达AlfAFP1的转基因马铃薯植物的产生和黄萎病控制发病试验结果

可以通过以下步骤产生能表达抗真菌有效量的AlfAFP1和AlfAFP2及其生物学功能等同物的转基因植物：

(a)用一种重组DNA分子转化植物细胞，所述DNA分子在

5’-3’方向上包括可操作地连接的：

(i)一个能指导基因在植物中转录的启动子片段；

(ii)一个DNA编码序列，该序列所编码的RNA能编码AlfAFP1和AlfAFP2或具有与AlfAFP1或AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的其生物学功能等同物；和

(iii)一个3’非翻译区，它编码一个聚腺苷酸化信号，该信号在植物细胞中起着使转录终止和将聚腺苷酸化核苷酸添加到所述RNA序列的3’末端的作用；

(b)筛选被转化的植物细胞；

(c)再生被转化了的植物细胞，以产生分化的植株；和

(d)选择转化的植株，该植株的细胞能袁达所述DNA编码序

列，并产生抗真菌有效量的AlfAFP1或AlfAFP2或其生物学功能等

同物。

本发明的方法可以用多种方法实现。通过上述任一种方法制备的抗真菌多肽可以与载体或包括其它抗真菌剂在内的其它添加剂混合的形式直接施加到植物上，正如本领域中众所周知的。所述多肽可以由细菌或酵母细胞表达，可将这些细胞施加到植物上，其中的某些细胞可以与植物共生。还可以用常规方法转化植物细胞，使其含有编码抗真菌多肽的DNA。所述基因可以组织特异性形式以组成型方式表达，或在植物受到真菌病原体感染以后表达。

所述新型苜蓿植物抗真菌多肽的氨基酸序列业已通过直接测序法和通过克隆cDNA的翻译测定，其同源性有别于其它植物防卫素型抗真菌多肽。最接近的多肽序列源于豌豆mRNA(pI230)，它们具有70％的同源性。在图2中示出了将AlfAFP1的氨基酸与pI230的氨基酸序列进行比较的叠加图。

本发明还涉及本文所披露的一切DNA序列或其生物学功能等同物的用途，可将其用于生产能被用于鉴定能赋予植物细胞对真菌病原体抗性的相关DNA序列的重组质粒、转化的微生物、探针、和底物，并可将其用于生产抗所述真菌病原体的转基因植物。

如上文所述，本发明的抗真菌多肽还可用于与化合物以及其它抗真菌剂组合，包括与具有抗真菌活性的其它肽、多肽、和蛋白组合，以便产生一种广谱活性，即能控制更多的病原体，和/或提供控制同一种真菌病原体的多种作用模式。所述其它抗真菌剂的例子包括壳多糖酶、富半胱氨酸壳多糖结合蛋白、D-1，3-葡聚糖酶、透肽菌素(包括zeamatins)，硫素，核糖体-失活蛋白，核非特异性脂转移蛋白。

提供下列本发明的详细说明，是为了帮助本领域技术人员实施本发明。尽管如此，以下详细说明不应被视为对本发明的不适当限定，因为本领域普通技术人员在不脱离本发明的构思或范围的前提下能对本文所披露的实施方案进行改进或改变。

5.0实施例：

通过以下说明性的、非限定性实施例可以更好地理解本发明。

5.1例1

首先用Laemmli的方法(1970)通过电泳测定AlfAFP1的分子量。将所述多肽溶解在含有450mN Tris-HCl，pH8.45，12％甘油，4％SDS，0.06％考马斯蓝G，和0.0025％酚红(Novex，San Diego，CA)的变性加样缓冲液中，煮沸10分钟，并在16％的Tricine凝胶(Novex，San Diego，CA)中电泳，电泳是在含有100mM Tris，100mM Tricine，和1％SDS的电泳缓冲液中进行的，以125V的恒定电压电泳2小时。银染(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，发现了一条分子量大约为4kDa的带。

通过Scoble等(1993)披露的正离子电喷射质谱对AlfAFP1进行质谱分析。所观察到的所述天然多肽的分子量大约为5,186道尔顿。

5.2例2

AlfAFP1的氨基酸序列

为了测定AlfAFP1的氨基酸序列，在含有8mM二硫苏糖醇的8M尿素中使纯化的多肽(根据质谱分析数据，其纯度大于98％)变性。通过用Stone等(1993)所披露的S-羧基-甲基化方法修饰半胱氨酸残基。通过用截至分子量为1,000kDa的膜对蒸馏水透析除去试剂。在一台Applied Biosystems model 470A蛋白测序仪(Applied Biosystems，Norwalk CT)进行自动Edman降解。用一台Applied Biosystems model120PTH分析仪以联机形式通过反相分析鉴定相应的PTH-氨基酸衍生物。

所述多肽的N-末端测序证实了序列1所示的43个氨基酸，在其40和41位上具有不确定的信号。通过对所述多肽进行质谱分析所得到的资料表明，所述多肽含有45个氨基酸，而且，未测定的氨基酸残基是第40位上的色氨酸，第41位上的半胱氨酸，第44位上的精氨酸，和第45位上的半胱氨酸。

成熟AlfAFP1多肽的全氨基酸序列如序列2所示。该多肽的计算分子量为5,187，这一结果与所测定的分子量5,186(例1)吻合。

5.3例3

AlfAFP1的生物效力

AlfAFP1(序列2)的抗真菌活性用抑制50％的真菌菌丝生长(IC₅₀)所需要的以μg/ml为单位表示的浓度。真菌菌丝生长抑制的百分比被定义为100x试样培养物中平均菌丝长度与对照培养物中平均菌丝长度的比，在所述对照培养物中，用缓冲液取代所述多肽样品。

在倒置显微镜下面，通过测定在有所述多肽的条件下对多种不同真菌的真菌菌丝体长度的抑制作用，测定AlfAFP1的抗真菌活性。根据实验中所使用的真菌，让真菌孢子(2×10⁴孢子/ml)在50μl的双强实验培养基中萌发5-15小时。最终的单强度实验培养基含有：K₂HPO₄(2.5mM)，MgSO₄(50μM)，CaCl₂(50μM)，FeSO₄(5μM)，CoCl₂(0.1μM)，CuSO₄(0.1μM)，Na₂MoO₄(2μM)，H₃BO₃(0.5μM)，KI(0.1μM)，ZnSO₄(0.5μM)，MnSO₄(0.1μM)，葡萄糖(10g/l)，天冬酰胺(1g/l)，甲硫氨酸(20mg/l)，肌醇(2mg/l)，生物素(0.2mg/l)，盐酸硫胺素(1mg/l)，和盐酸吡哆醇(0.2mg/l)。为了研究阳离子的拮抗效应，分别以1mM和50mM的终浓度加入CaCl₂和KCl。这种添加了盐的培养基被称为“高盐培养基”，而其原始培养基被称为“低盐培养基”。在孢子萌发以后，将50μl过滤消毒的溶解在蒸馏水中的多肽溶液加入含有所述萌发孢子的试验孔中，将该混合物在24℃下培养15-24小时。以0-80μg/ml的浓度对AlfAFP1进行试验，以测定其IC₅₀值。用获自Pierce(Rockford，IL)的BCA蛋白测定试剂盒测定多肽浓度。

袁2表示AlfAFP1抗大刀镰孢(小麦头疥病的致病剂)和大丽花轮枝孢(马铃薯早期死亡的致病剂)的抗真菌活性。

表2

AlfAFP1的抗直菌活性

真菌	IC50(μg/ml)
			低盐	高盐
	大刀镰孢	1			15
大丽花轮枝孢			4	15

袁2中的数据表明，AlfAFP1具有潜在的抗镰孢菌属和轮枝孢属的抗真菌活性，所述真菌能在包括大麦、玉米、棉花、燕麦、马铃薯、大豆、番茄和小麦在内的很多作物上引起发病。与披露于PCT国际公开号WO93/05153中所披露的其它抗真菌肽相比，该多肽的抗真菌活性对存在于试验培养基中的盐的拮抗作用不那么敏感。在用编码AlfAFP1或AlfAFP2的DNA转化的植物中，所述以μg/ml表示的导致真菌菌丝生长50％抑制(IC₅₀)所需的浓度可以实现。IC₅₀值落在许多市售杀真菌剂的范围内，并反应了将该抗真菌多肽用在植物的感染部位的用途。

5.4.1 例4

克隆AlfAFP cDNAs

mRNA提取

用获自Bio101公司(La Jolla，CA)的RNaide Plus试剂盒，按照生产商推荐的方法由苜蓿种子制备总RNA。按照Celano等所披露的方法(1993)用寡聚(dT)纤维素(GIBCO BRL/生命技术，Gaithersburg，MD)提取mRNA或聚腺苷酸化mRNA。

5.4.2 cDNA克隆

用5’RACE试剂盒(GIBCO BRL/生命技术，Gaithersburg，MD)克隆所述多肽cDNA的5’片段。通过用寡聚-dT引物进行逆转录，由聚腺苷酸化mRNA制备第一条cDNA。通过RNaseH1消化和旋转桶分离除去所述mRNA链，然后用末端脱氧核苷酸转移酶在该酶的生产商推荐的条件下将poly-C尾添加到一股cDNA链上。通过PCR^TM扩增所述多肽基因的5’片段，使用GeneAmp DNA扩增试剂盒(Perkin Emmer Cetus)和生产商所推荐的反应条件。

用于扩增的两个引物是：1)混合的寡核苷酸33-聚体(14个核苷酸编码克隆位点，19个编码基因特异性的核苷酸，简并性32，序列3)，由它编码所述多肽序列沿反义方向的C-末端的35-41位的氨基酸；和2)寡聚-dT引物，它与所述cDNA(序列4)的poly-C尾退火。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR^TM反应产物，在全反应混合物中存在一条大约330bp的带，但在仅含有一种引物的对照反应混合物中没有该带。从所述凝胶中切除该带，并使用Ultrafree-MC离心过滤装置(Millipore，Bedford，MA)提取DNA。用BamHI消化该DNA片段，将其克隆到质粒pGEM11Zf(+)(Promega，Madison，WI)中，并用PRISM Ready ReactionDideoxy Terminator Cycle Sequencing试剂盒(Applied Biosystems)在一台373DNA Sequencer Stretch Model上对插入片段进行测序。

提取了AlfAFPcDNA的两种不同同系物。第一份克隆AlfAFP1如序列5所示，具有预测的氨基酸序列，但缺少其5’末端的信号序列的前7个氨基酸。第二个5’cDNA克隆AlfAFP2与AlfAFP1高度同源。它含有完整的信号肽编码序列，如序列6所示。所述cDNA的翻译能产生如序列14所示的具有39个氨基酸的截短的成熟肽。在图3中对两种同系物AlfAFP1和AlfAFP2的核苷酸序列进行了比较。

所述多肽cDNA 3’片段的克隆如下。将为了5’RACE而制备的cDNA的第一条链用作模板，通过PCR^TM扩增所述多肽cDNA的3’部分，扩增时使用GeneAmp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus)和生产商所推荐的反应条件。

用于扩增的两个引物是：1)混合的寡核苷酸34-聚体(14个核苷酸编码克隆位点，20个编码基因特异性的核苷酸，简并性32，序列7)，由它编码所述多肽序列的4-10位氨基酸；和2)寡聚-dT引物，它与所述cDNA(序列8)的poly(A+)尾退火。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR^TM反应产物，在全反应混合物中存在一条大约400bp的带，但在仅含有一种引物的对照反应混合物中没有该带。从所述凝胶中切除该带，并使用Ultrafree-MC离心过滤装置(Millipore，Bedford，MA)提取DNA。用BamHI消化该DNA片段，将其克隆到质粒pGEM11Zf(+)(Promega)中，并用PRISM Ready Reaction Dideoxy Terminator CycleSequencing试剂盒(Applied Biosystems)在一台373DNA SequencerStretch Model上对插入片段进行测序。其序列如序列9所示。

所述多肽cDNA的5’末端(序列5)和3’末端(序列9)有112个核苷酸的重叠。通过以下3个序列因子的组合形成序列6所示的全长多肽cDNA：序列6的1-112号核苷酸，序列5的20-198号核苷酸，和序列9的111-308号核苷酸。

如图1所示，所述抗真菌多肽cDNA含有一个74bp的5’前导序列，一个编码72个氨基酸的多肽的219bp的开放读框，以及一个加在poly(A+)尾上的179bp的3’非翻译区。推测的多肽包括一个由27个氨基酸组成的推定信号肽和一个由45个氨基酸组成的成熟多肽，这一结果与通过质谱分析和直接氨基酸测序所测定的序列一致(参见例1和例2)。实际上信号肽裂解发生在丙氨酸和精氨酸之间，即发生在图1中的箭头位置。

为了方便克隆，通过PCR^TM用工程方法将限制位点整合在含有所述多肽cDNA编码区的cDNA片段的末端。5’基因特异引物含有起始密码子(ATG)的15bp上游和具有BamHI限制位点的39bp的多肽(序列11)，而3’基因特异引物具有一个位于终止密码子(TAA)之后的BamHI限制位点(序列12)，将这两个引物用于扩增cDNA片段，该cDNA是按照上述方法通过mRNA的逆转录而制成的。该PCR^TM扩增片段如序列13所示。

将该PCR^TM产物作为一个241bp BamHI片段亚克隆到预先构建的含有一个具有玉米Hsp70内含子的E35S启动子的大肠杆菌盒式载体pMON23317(图4)的BamHI位点上，以形成pMON22653(图5)。所述nos基因的3’非翻译聚腺苷酸化序列也可以作为终止子。该载体还含有一个位于所述内含子和终止序列之间的多接头位点，位于所述启动子和终止子之前和之后的Not1位点，一个氨苄青霉素抗性基因。用一个针对BamHI克隆位点上游50bp的HSP70内含子的序列的引物对插入pMON22653的cDNA进行测序。该cDNA插入片段的序列如序列13所示，该序列为其正确转录取向，其推测的氨基酸序列与通过直接氨基酸序列分析所测定的所述多肽的序列吻合(参见序列2)。

5.5 例5

5.5.1 用于马铃薯转化的质粒

将编码AlfAFP1的263bp的BamHI/EcoRI片段由质粒pMON22653(图5)克隆到预先构建的大肠杆菌盒式载体pMON22575(图6)中，取代它上面的p46基因。所得到的质粒被命名为pMON22656(图7)，用NotI裂解该质粒，以提取含有所述多肽编码cDNA的NotI片段。然后将该NotI片段插入pMON17227(图8)的NotI位点上，该质粒是一种双臂植物转化载体。所得到的质粒被命名为pMON22659(图9)，它含有以下DNA片段：细菌壮观霉素/链霉素抗性基因(Spc/St)(Fling等，1985)，其后是所述T-DNA的右臂。与所述右臂邻接的是合成的细菌glyphosate抗性CP4 5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶(EPSPS)基因，该基因由FMV启动子启动(参见PCT公开WO92/04449)。所述CP4基因赋予所述转化体glyphosate抗性，并因此赋予其用glyphosate作为选择转化体的手段的能力。将源于拟南芥属CP4 5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶(EPSPS)的叶绿体转运肽与CP4基因融合，以便引导CP4-EPSPS蛋白至叶绿体。在所述CP4基因的3’末端是E9 3’末端，由它提供转录终止位点和聚腺苷酸化信号序列。随后的嵌合片段包括FMV启动子，所述抗真菌多肽cDNA，和nos3’末端。其后是所述T-DNA的左臂，以及复制起点(ori-322)(Stalker等，1981)。

5.5.2 三亲交配方法

在转化之前，通过三亲交配方法让含有pMON22659的大肠杆菌与农杆菌ABI交配，再与具有辅助质粒pRK2013(Ditta等，1980)的大肠杆菌交配。ABI是携带无臂pTiC58质粒pMP90RK(Koncz，1986)的A208根癌农杆菌菌株。在结合到所述ABI菌株中之后，由所述无臂Ti质粒提供pMON载体自主复制所必需的trfA基因功能。当植物组织与ABI：：pMON缀合物一起培养时，所述载体通过由所述无臂pMP90RK Ti质粒编码的vir功能转入植物细胞。

在30℃下让农杆菌属在含有25μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基(每升含有10克胰胨，5克酵母浸膏，和5克NaCl)中生长30小时。在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中让含有pRK2013的大肠杆菌生长过夜。让获得了pMON22659的大肠杆菌，在含有75μg/ml壮观霉素的LB培养基中生长。在所有培养物均已长成后，将4mlLB培养基加入分别含有100μl农杆菌ABI、大肠杆菌pRK2013和大肠杆菌pMON22659的试管中。该混合物在离心机中离心1分钟，并倒掉上清液部分。将沉淀部分重新悬浮于剩余液体中(大约100μl)，将一份等份试样(大约25μl)移液到LB琼脂(1.5％)板的中部。在30℃下生长过夜，然后用来自所述琼脂板的一等份细胞划线接种添加了75μg/ml壮观霉素、50μg/ml卡那霉素、和25μg/ml氯霉素的LB琼脂板。

在30℃下培养24-48小时之后，在用由含有pMON22659质粒的大肠杆菌、含有pRK2013的大肠杆菌和农杆菌ABI进行三亲交配所得到的细胞划线的平板上出现菌落，而在用由含有pMON22659的大肠杆菌、和ABI交配所产生的细胞(无含有pRK2013的大肠杆菌，这种大肠杆菌是质粒转移所必需的)划线的对照平板上没有出现菌落。在进行三亲交配之后，从前一个平板上选择4个菌落，并将每一个菌落分别接种到添加了75μg/ml壮观霉素、50μg/ml卡那霉素、和25μg/ml氯霉素的液体LB培养基中，在30℃下生长。通过对从农杆菌属细胞中分离的质粒DNA进行限制性分析，证实了编码所述不同抗真菌多肽的DNA的存在。将含有编码AlfAFP1的DNA的培养物用于转化马铃薯植物。

5.5.3 转化马铃薯植物

让含有pMON22659的农杆菌在含有75μg/ml壮观霉素、25μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素，pH7.0的2ml LB培养基中生长过夜。第二天，用MSO培养基以1∶10的比例稀释所述细菌，1L体积的MSO培养基含有4.4g MS盐(Sigma化学公司，St.Louis，MO)，30g蔗糖，和2ml维生素B5(Sigma化学公司，产品目录号G1019)，pH5.7，或者一直稀释到在600nm波长下的光密度读数为0.2-0.33。

将叶片从马铃薯植株(Solanum tuderosum var.Russet Burbank)的茎上除去，所述马铃薯植株是在无菌条件下由含有节的茎的切片长成的，所述条件包括19℃的温度，16小时光照/8小时黑暗的光照周期，和100μE/s/m²的光照强度，在每升含有4.4gMS盐(Sigma化学公司，St.Louis，MO)，30g蔗糖，0.17g NaH₂PO₄.H₂O，0.4mg盐酸硫胺素，25g抗坏血酸，和0.1g肌醇pH6.0，和0.2％的Gelrite琼脂的PM培养基中生长3周。将所述茎切成3-5毫米的节段。

在接种之前，将30个茎段放在共培养平板上，将其作为非接种的对照。共培养平板含有0.9％琼脂-固化1/10MS盐(Murashige等，1962)和3％蔗糖，该共培养平板是这样制备的：首先在所述琼脂上涂2ml 6-7日龄的烟草悬浮细胞，作为饲养层(Fraley等，1983)，然后用一个8.5cm的无菌Whatman滤纸片覆盖所述细胞。

通过将所述稀释的细菌悬浮液浸在所述茎段上接种待转化的外植体切段，并让该混合物培养15分钟。然后将细菌悬浮液从外植体切段上吸走，然后将这些外植体切段均匀分布在共培养平板上(大约每个平板90个茎插条)。在19℃、16小时光照/8小时黑暗周期和100μE/s/m²的光照强度下，进行为期两天的共培养，然后将外植体放在1X MS盐、5.0mg/l玉米素核糖苷、10mg/l AgNO₃、3％蔗糖、500mg/l羧苄青霉素、和0.1mg/l萘乙酸的0.9％的琼脂/固化愈伤组织诱导培养基上，并在19℃和16小时光照/8小时黑暗周期的条件下培养两天。然后将外植体转移到添加了0.025mM glyphosate的愈伤组织诱导培养基上进行选择。4周以后，将外植体放在含有1X MS盐、5.0mg/l玉米素核糖苷、10mg/lAgNO₃、3％蔗糖、500mg/l羧苄青霉素、0.3mg/l GA3、和0.025mMglyphosate的0.9％琼脂固化芽诱导培养基上。8周以后开始出现芽。在为期12周的时间内每隔4周将外植体转移到新鲜的芽诱导培养基上。将芽从愈伤组织上切除，并放在由0.2％Glerite琼脂固化的PM培养基上，生长大约2周或生长到出现根而且大到足于种植到土壤中。一旦移植到Metro-Mix 350(Hummert种子公司，St.Louis)中，用2-3个月的时间在温室中生长幼苗，生长条件为14小时光照/8小时黑暗周期，光强为600-700μE/s/m²，日间温度为65-75°F，夜间为55-65°F，相对湿度为60％。

5.5.4 分析抗真菌多肽在转基因马铃薯植物中的表达

从生长至1-2英寸高的转基因植株上取叶片样品(20-100mg)。在含有1mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4，和0.05％Tween-20的PBST缓冲液(15μl/mg组织)中研磨所述叶片样品，并在4℃下放置过夜。离心，然后将100μl上清液用于ELISA测定。抗AlfAFP多肽(序列2)的多克隆抗体是由Pocono Rabbit Farm(Canadensis，PA)制备的。通过加入100μl以1∶250的比例稀释于包被缓冲液的抗体(1mg IgG/ml)用抗AlfAFP1多肽的抗体包被NuncMaxi-sorp 96孔板(Nunc#4-39454)的孔，并在4℃下培养过夜，所述包被缓冲液为每升蒸馏水中含有1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃，pH9.6。然后将所述包被溶液从所述孔中除去，用PBST洗涤该孔3次。将100μl叶片上清液或用添加了0.2％(w/v)BSA、成分V(Sigma，St.Louis)的PBST适当稀释过的多肽标准物加入所述孔中。

由标准曲线测定从转基因植物中分离的每一种多肽的浓度，该标准曲线是用各种量的相应的纯化多肽绘制的。AlfAFP1能与所述多克隆抗体制剂发生交叉反应。在4℃下培养过夜，然后将所述溶液从所述孔中取出，并用PBST洗涤3次。将0.5毫克/毫升按照Boorsma等(1975)所述方法制备的AlfAFP1抗体/碱性磷酸酶缀合物的以1∶1000的比例稀释于PBST中的100μl溶液加入每一个孔中。将该板于22℃下培养4小时，然后用PBST洗涤该孔5次。将100μl溶解于200mM Tris缓冲液，pH9的新制备的对硝基苯磷酸(1mg/ml)(Sigma化学公司，St.Louis，MO)加入每一个孔中，将该板在22℃下培养1小时，用Thermo-max微量板读数器(Molecuar Devices，Menlo Park，CA)在605nm波长下测定其光密度。将以不同水平表达抗真菌多肽的植物用于随后的发病试验。

5.5.5 转基因植物的黄萎病控制

将烈性大丽花轮枝孢菌的2-3周龄培养物的分生孢子和菌丝体用于接种PBA(马铃薯，200g/l；Bacto葡萄糖，20g/l；和Bacto琼脂，15g/l)培养平板上。让该培养物在22℃下生长4-5天。然后通过用无菌蒸馏水洗涤该培养板，并通过两层纱布过滤该液体以收获分生孢子。用一台血细胞记数器测定分生孢子的浓度，并用无菌蒸馏水调整至1×10⁶分生孢子/ml。

按照上述方法，在装有50ml PM-琼脂培养基的塑料杯中在无菌条件下由茎插条生长转基因和非转基因马铃薯植株。当植株大约1-2英寸高时，将其从所述培养基中取出，并将其根浸泡在所述孢子悬浮液中(Joaquim等，1991)。然后将接种过的植株移植到装有Metro-Mix350土壤的6英寸盆中。将所述盆放入生长箱中，置于如下条件下：温度20℃，光照强度320μE/s/cm²，12小时白天/12黑夜光周期，每天两次进行地下渗灌，每次浸泡20分钟。在接种4周以后，按照0-100％的等级对发病严重程度进行评级(Horsfall等，1945)。为了绘制病害随时间发展的曲线，每周对植株进行一次评价，至少进行8周时间。

5.5.6 AlfAFP-表达马铃薯植株对黄萎病的抗性

试验21个独立的表达AlfAFP的转基因马铃薯系对黄萎病的抗性。AlfAFP1在叶片中的表达是其在整个植株中表达的标记，因为用于指导相应的编码DNA表达的FMV启动子能在马铃薯植株的所有类型的组织中以组成形式指导基因的表达。在该发病试验中包括21个独立的不表达AlfAFP的系，这些系是在表达AlfAFP表达分析过程中鉴定的，这些系被作为负对照。在该试验中，还包括18个独立的载体对照系，作为负对照。这18个系是通过用获得了质粒pMON17227的农杆菌转化而获得的(载体对照，图8)，它不含有任何抗真菌多肽编码DNA。

表3中归纳了所述每一个系的定性蛋白表达数据，以及在接种后第46天测定的每一个系在黄萎病试验中发病严重程度的等级。为方便起见，在图10中相同的发病数据以棒图形式表示。每一个马铃薯系在表3(从上到下)和图10(从左到右)中的出现顺序是相同的。表3AlfAFP1在转基因马铃薯植物中的表达和黄萎病抗性植株       系#      蛋白表达     发病程度(％)

              (定性ELISA)    (接种后46天)AlfAFP1    17562       +             5阳性       17554       +             17.5植株       17556       +             20

       17557       +             22.5

       17563       +             25

       17570       +             27.5

       17566       +             30

       17567       +             35

       17550       +             40

       17551       +             45

       18945       +             50

       18968       +             50

       18944       +             45

       17652       +             35

       18940       +             35

       17564       +             30

       17568       +             25

       17654       +             25

       17561       +             22.5

       17558       +             20

       17636       +             17.5

                         平均    29.6AlfAFP1    17638       -             22.5阴性       18946       -             37.5植株       17642       -             45

       17555       -             50

       18971       -             60

       17643       -             65

       17655       -             70

       17637       -             72.5

       17646       -             75

      18955    -                  80

      18950    -                  100

      18958    -                  100

      17552    -                  80

      18975    -                  75

      18963    -                  70

      18972    -                  70

      18952    -                  65

      18956    -                  60

      18974    -                  45

      18943    -                  40

      17648    -                  35

                          平均    62.7裁体      14947    0                  30对照      14924    0                  40

      14925    0                  40

      14918    0                  50

      14926    0                  50

      14928    0                  50

      14936    0                  75

      14920    0                  100

      14923    0                  100

      14927    0                  100

      14935    0                  100

      14941    0                  95

      14933    0                  60

      14930    0                  50

      14931    0                  50

      14940    0                  50

      14946    0                  40

      14949    0                  40

                          平均    62.2

如表3和图10所示，AlfAFP1表达植株的病害严重程度比所述非表达植株或载体对照平均低52％。这一数据是按以下方式计算的：[(18个载体对照系的平均值)-(21个表达系的平均值)]×100％/(18个载体对照系的平均值)；或[(21个非表达系的平均值)-(21个表达系的平均值)]×100％/(21个非表达系的平均值)。21个AlfAFP1表达系中的13个的发病严重程度等级等于或低于30％；相反，在21个非表达系中仅有一个或在18个载体对照系仅有一个系的发病严重性的得分低于30％。上述结果表明，AlfAFP1能赋予表达该蛋白的植物对黄萎病抗性。本发明是以上述方式说明的，但显而易见的是，该方法可以多种形式改变。这些改变不应被视为超出本发明的构思和范围，而且，对本领域技术人员来说显而易见的是，所有类似改变均被视为包括在以下权利要求的范围内。

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                序列表(1)一般资料：

(i)申请人：

   (A)名称：Monsanto公司

   (B)街道：700 Chesterfield Parkway North

   (C)城市：St.Louis

   (D)州：MO

   (E)国家：美国

   (F)邮编：63198

   (G)电话：512-418-3000

   (H)传真：713-789-2679

(ii)发明名称：抗真菌多肽和用于控制植物致病真菌的方法

(iii)序列数：14

(iv)计算机可读形式：

   (A)媒体类型：软盘

   (B)计算机：IBM PC兼容

   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)

(vi)在先中请数据：

   (A)申请号：US08/766,355

   (B)申请日：1996年12月13日(2)序列1资料：

(i)序列特征：

   (A)长度：43个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：

   (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：序列1：Arg Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asp Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Ser1               5                   10                  15Gly Cys Asp Thr His  Cys Thr Thr Lys Glu Asn Ala Val  Ser Gly Arg

        20                   25                   30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Xaa Xaa Thr Lys

    35                  40(2)序列2资料：

(i)序列特征：

   (A)长度：45个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：

   (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：序列2：Arg Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asp Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Ser1               5                   10                  15Gly Cys Asp Thr His Cys Thr Thr Lys Glu Asn Ala Val Ser Gly Arg

        20                  25                  30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Trp Cys Thr Lys Arg Cys

    35                  40                  45

(2)序列3资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：33个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑结构：线形

(ix)特征

    (A)名称/键：modified_base

    (B)位置：(16，22)中的一个

    (D)其它资料：/mod_base＝其它

    /note＝“N＝肌苷”

(ix)特征

    (A)名称/键：modified_base

    (B)位置：(19，25，28，31)中的一个

   (D)其它资料：/mod_base＝其它

                /note＝“D＝A或G或T”

(ix)特征

   (A)名称/键：modified_base

   (B)位置：24

   (D)其它资料：/mod_base＝其它

                /note＝“K＝G或T”

(xi)序列描述：序列3：GGGAATTCGG ATCCANCADC ANCKDAADTC DTC                                  33

(2)序列4资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑结构：线形

(ix)特征

    (A)名称/键：modified base

    (B)位置：(18..19，23..24，28..29)的结合

    (D)其它资料：/mod_base＝其它

                /note＝“N＝肌苷”

(xi)序列描述：序列4：GGGAATTCGG ATCCGGGNNG GGNNGGGNNG                                       30

(2)序列5资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：200个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双

    (D)拓扑结构：线形

(ix)特征

   (A)名称/键：modified_base

   (B)位置：17

   (D)其它资料：/mod_base＝其它

               /note＝“N＝A或C或G或T”

(xi)序列描述：序列5：GGGGGGGGGG GGGGGGNCAG GCTTATGCTT CCTCTTCTTG GTTCTCTTTG TTGCACAAGA    60AATTGTGGTG ACAGAAGCCA GAACATGTGA GAATTTGGCA GATAAATATA GGGGACCATG    120CTTTAGTGGT TGTGACACTC ACTGCACAAC CAAAGAGAAC GCAGTTAGTG GAAGGTGTAG    180GGACGACTTC CGCTGCTGCT                                                200

(2)序列6资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：293个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双

    (D)拓扑结构：线形

(ix)特征

    (A)名称/键：modified_base

    (B)位置：(17，265)中的一个

    (D)其它资料：/mod_base＝其它

                /note＝“N＝A或C或G或T”

(xi)序列描述：序列6：GGGGGGGGGG GGGGGGNTGT CAAACACACA CATAACACAT AAGTGACCGT GAGTCATTAA    60ATTTATATAT ATTCATCAAT CTAATCAA C TATGGAGAAG AAATCACTAG CTGGCTTATG    120CTTCCTCTTC CTCGTTCTCT TTGTTGAACA AGAAATTATG GTGACCGAGG CAGCTACTTG    180TGAGAATTTG GCTAACACAT ACAGGGGACC ATGCTTCGGT GGTTGTGACT TTCACTGCAA    240AACCAAAGAA CACTTACTTA GCGGNAGGTG CAGGGACGAC TTCCGCTGCT GCT           293

(2)序列7资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：33个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单

  (D)拓扑结构：线形(ix)特征

  (A)名称/键：modified_base

  (B)位置：(17，31)中的一个

  (D)其它资料：/mod_base＝其它

              /note＝“D＝A或G或T”(ix)特征

  (A)名称/键：modified_base

  (B)位置：(19，20，28)中的一个

  (D)其它资料：/mod_base＝其它

              /note＝“B＝C或G或T”(ix)特征

  (A)名称/键：modified_base

  (B)位置：(22，25)中的一个

  (D)其它资料：/mod_base＝其它

              /note＝“肌苷”

(xi)序列描述：序列7：GGGAATTCGG ATCCGADABB TNGCNGABAA DTA                                  33(2)序列8资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：32个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单

  (D)拓扑结构：线形(xi)序列描述：序列8：GGGAATTCGG ATCCTTTTTT TTTTTTTTTT TT                                    32

(2)序列9资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：327个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双

    (D)拓扑结构：线形

(ix)特征

    (A)名称/键：modified_base

    (B)位置：(244，305)中的一个

    (D)其它资料：/mod_base＝其它

                /note＝“N＝A或C或G或T”

(xi)序列描述：序列9：GAGAATTTGG CGGATAAGTA TAGGGGACCA TGCTTTAGTG GTTGTGACAC TCACTGCACA    60ACCAAAGAGA ACGCAGTTAG TGGAAGGTGT AGGGATGACT TTCGTTGTTA GTGTACTAAA    120AGATGTTAAA TGGATCTCCT CCAACATCAA GATGTGCATG GAATAGTCTT TATAATAAAA    180CTAAATAAAT AAAATGCACG CAGTATAGCT ACAACTTCAT CTATATATAT GTACTCAATA    240TCGNGCATAA CGTATTAGTT ATGCACTTCT ATCATATGGA ATAAACATCA ATAAGTAATT    300TCGTNTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA                                        327

(2)序列10资料：

   (i)序列特征：

     (A)长度：507个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：双

     (D)拓扑结构：线形

(ix)特征

    (A)名称/键：modified_base

    (B)位置：(17，424，485)中的一个

   (D)其它资料：/mod_base＝其它

                /note＝“N＝A或C或G或T”

(xi)序列描述：序列10：GGGGGGGGGG GGGGGGNTGT CAAACACACA CATAACACAT AAGTGACCGT GAGTCATTAA    60ATTTATATAT ATTCATCAAT CTAATCAAAC TATGGAGAAG AAATCACTAG CTGGCTTATG    120CTTCCTCTTC TTGGTTCTCT TTGTTGCACA AGAAATTGTG GTGACAGAAG CCAGAACATG    180TGAGAATTTG GCAGATAAAT ATAGGGGACC ATGCTTTAGT GGTTGTGACA CTCACTGCAC    240AACCAAAGAG AACGCAGTTA GTGGAAGGTG TAGGGACGAC TTCCGCTGCT GGTGTACTAA    300AAGATGTTAA ATGGATCTCC TCCAACATCA AGATGTGCAT GGAATAGTCT TTATAATAAA    360ACTAAATAAA TAAAATGCAC GCAGTATAGC TACAACTTCA TCTATATATA TGACTCAATA    420TCGNGCATAA CGTATTAGTT ATGCACTTCT ATCATATGGA ATAAACATCA ATAAGTAATT    480TCGTNTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA                                        507(2)序列11资料：

(i)序列特征：

   (A)长度：62个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单

   (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：序列11：GGGGATCCCA ATCTAATCAA ACTATGGAGA AGAAATCACT AGCTGGCTTA TGCTTCCTCT    60TC                                                                   62

(2)序列12资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：47个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：序列12：GGGGATCCTT AACATCTTTT AGTACACCAG CAGCGGAAGT CGTCCCT                    47

(2)序列13资料：

   (i)序列特征：

     (A)长度：250个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：双

     (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：序列13：GGGGATCCCA ATCTAATCAA ACTATGGAGA AGAAATCACT AGCTGGCTTA TGCTTCCTCT    60TCTTGGTTCT CTTTGTTGCA CAAGAAATTG TGGTGACAGA AGCCAGAACA TGTGAGAATT    120TGGCAGATAA ATATAGGGGA CCATGCTTTA GTGGTTGTGA CACTCACTGC ACAACCAAAG    180AGAACGCAGT TAGTGGAAGG TGTAGGGACG ACTTCCGCTG CTGGTGTACT AAAAGATGTT    240AAGGATCCCC                                                           250

(2)序列14资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：序列14：Ala Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asn Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Gly1               5                   10                  15Gly Cys Asp Phe His Cys Lys Thr Lys Glu His Leu Leu Ser Gly Arg

        20                  25                  30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys

    35

Claims (33)

1.一种编码苜蓿植物抗真菌多肽的纯化核酸片段。

2.如权利要求1的核酸片段，它所编码的多肽包括序列2或序列14的氨基酸序列。

3.如权利要求1的核酸片段，它包括序列13的核酸序列或与该序列互补的序列或能在高严格条件下与序列13杂交的序列。

4.如权利要求1的核酸片段，它包括序列13中105-242位之间的核酸序列，或与该序列互补的序列，或能在高严格条件下与序列13的105-242位之间的序列杂交的序列。

5.如权利要求1的核酸片段，进一步限定为包括序列10的核酸序列，或与该序列互补的序列，或能在高严格条件下与序列10的序列杂交的序列。

6.一种分离的DNA分子，它具有选自以下的核苷酸序列：

a)图1的核苷酸序列(序列10上18-507位之间)；

b)序列13的核苷酸序列；

c)序列13上105-242位之间的核苷酸序列；

d)能由于遗传密码的简并编码与a)、b)或c)的核苷酸序列所编码的肽相同的肽的核苷酸序列

e)a)、b)、c)或d)中任一个的互补序列；和

f)能在高严格条件下与(a)-(f)中任一个杂交的核苷酸序列。

7.如权利要求1的核酸片段，还可被限定为RNA片段。

8.一种含有分离的苜蓿植物抗真菌基因的DNA片段。

9.如权利要求8的DNA片段，包括一个分离的苜蓿属基因。

10.如权利要求9的DNA片段，它所编码的抗真菌多肽包括一个由序列2或序列14的至少15个氨基酸组成的连续的氨基酸序列。

11.如权利要求10的DNA片段，还可被限定为重组载体。

12.如权利要求11的DNA片段，其中，所述DNA可操作地连接于一个启动子上，该启动子能表达所述DNA片段。

13.如权利要求12的DNA片段，其中，所述启动子选自下列一组：FMV 35S启动子，CaMV 35S启动子，ssRUBISCO启动子，EIF-4A启动子，LTP启动子，肌动蛋白启动子，和遍在蛋白启动子。

14.一种重组宿主细胞，包括权利要求10所述的DNA片段。

15.如权利要求14的重组宿主细胞，还可进一步限定为植物细胞，所述植物细胞选自下列一组：苹果、苜蓿、大麦、花茎甘蓝、甘蓝、油菜、胡萝卜、柑桔、玉米、棉花、大蒜、燕麦、洋葱、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、稻、黑麦、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、番茄、草坪草、和小麦。

16.如权利要求14的重组宿主细胞，还可被限定为马铃薯植物细胞。

17.一种利用编码一种分离的苜蓿植物抗真菌多肽的DNA片段的方法，包括以下步骤：

a)制备一种如权利要求11所述的重组载体，其中，所述苜蓿植物抗真菌多肽编码DNA片段处于一个启动子的控制之下；

b)将所述重组载体导入宿主细胞中；

c)在能有效表达所编码的抗真菌多肽的条件下培养所述宿主细胞；

d)收集所述表达的抗真菌多肽。

18.一种分离的核酸片段，选自下列一组：

a)序列3、5、6-7、9-10或13中任一个的核苷酸序列；

b)与序列3、5、6-7、9-10或13中任一个互补的序列；

c)由于遗传密码的简并编码与序列3、5、6-7、9-10或13中任一个所编码的肽产物相同的肽的核苷酸序列；和

d)能在高严格条件下与序列3、5、6-7、9-10或13中任一个杂交的核苷酸序列。

19.一种由权利要求6所述的DNA编码的分离苜蓿植物抗真菌多肽。

20.如权利要求19的多肽，包括序列2或序列14的氨基酸序列。

21.如权利要求19的多肽，其中，所述多肽是从苜蓿中分离的。

22.一种分离的苜蓿植物抗真菌多肽，含有序列2、序列14的氨基酸序列或其功能变体。

23.如权利要求22的多肽，其中，所述变体包括所述序列的至少8个氨基酸的截短片段。

24.一种组合物，含有溶解在合适溶剂中的抗真菌有效量的权利要求19所述的多肽。

25.一种转基因植物，在其基因组中整合了一个编码权利要求19所述抗真菌多肽的转基因。

26.如权利要求25的转基因植物，其中，所述多肽具有序列2或序列14的氨基酸序列。

27.如权利要求25的转基因植物，其中，该多肽是由序列13的DNA或能在高严格条件下与序列13杂交的序列编码的。

28.权利要求25所述植物的子代。

29.源于权利要求25所述植物的种子。

30.权利要求25所述植物的无性系。

31.一种控制植物真菌的方法，包括为一种植物提供抗真菌有效量的如权利要求19所述的多肽。

32.如权利要求31的方法，其中，所述多肽是由权利要求24所述组合物提供的。

33.如权利要求31的方法，其中，所述多肽是这样提供的：用一种含有编码具有序列2或序列14所示氨基酸序列的多肽的DNA的载体转化植物细胞，让抗真菌有效量的所编码的多肽表达。

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