CN105664252A

CN105664252A - 固定的生物实体的改进

Info

Publication number: CN105664252A
Application number: CN201511008867.2A
Authority: CN
Inventors: K·里昂坦恩; P·安东尼; D·尼斯特伦; P·比格瓦奇; K·皮埃特扎克
Original assignee: WL Gore and Associates Inc
Current assignee: WL Gore and Associates Inc; Gore Enterprise Holdings Inc
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2032-03-09
Also published as: EP2683420B1; RU2013145487A; JP2023017012A; CN103596603A; BR112013023241A2; CA2828797C; US9408950B2; BR112013023241A8; KR101933237B1; EP3375462A1; JP2019202226A; US20160310646A1; EP2683420A1; US11497838B2; BR112013023241B1; JP6251039B2; EP3375462B1; KR20140015429A; CN105664252B; ES2682482T3

Abstract

固定的生物实体的改进。本申请描述但不限于一种具有含层状涂层的表面的装置，其中外涂层包含大量阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与抗凝血实体共价结合。

Description

固定的生物实体的改进

本申请是2012.03.09提交的CN201280012639.0，题为“固定的生物实体的改进”的分案申请。

发明领域

本发明涉及固定的生物实体，具有含该实体的表面涂层的装置，以及其生产方法和中间体。本发明特别涉及固定的抗凝血实体例如肝素，以及装置例如具有含固定肝素的表面涂层的医疗、分析和分离装置。

技术背景

当医疗装置放置在体内或接触体液时，会引发多种不同的反应，其中有一些会使接触装置表面的血液发生凝结。为消除这种严重的不良反应，长期以来都是在医疗装置植入其体内前或接触其体液时，向患者全身性给予熟知的抗凝血化合物肝素来提供抗血栓作用。

凝血酶是多种凝结因子中的一种，这些凝结因子共同作用使接触血液的表面形成血栓。抗凝血酶(也称为抗凝血酶III)(“AT”或“ATIII”)是最突出的凝结抑制剂。它中和凝血酶和其它凝结因子的反应，并因此局限或限制血液凝结。肝素显著提高抗凝血酶抑制凝结因子的速率。

然而，全身性给予高剂量的肝素通常伴有严重的副作用，其中主要的是出血。肝素疗法的另一个罕见而严重的并发症是发生一种免疫应答，称为肝素诱导的血小板减少症(HIT)，这可能导致血栓形成(包括静脉和动脉)。高剂量的全身性肝素处理(例如手术期间)也需要频繁监控活化的凝血时间(用于监控和引导肝素疗法)并根据需要调整相应剂量。

因此正寻求一种解决方法，使患者不必或有限地需要全身性肝素化。认为这可以通过用肝素的抗凝血特性表面修饰医疗装置来实现。因此已发展多种不同程度的成功技术，这些技术将一层肝素结合于医疗装置表面以使该表面不形成血栓。对于需要长期生物活性的装置，肝素层理想上应该抗沥滤及降解。

肝素是一种在糖单元上带有负电硫酸和羧酸基团的多糖。已尝试将肝素与聚阳离子表面离子结合，但这些表面修饰往往缺乏长期稳定性，最终随着肝素从表面沥滤失去无血栓形成的功能。

因此已制备将肝素共价结合于表面基团的不同表面修饰。

得到无血栓形成的医疗装置的一种最成功的方法是将肝素片段共价结合到修饰的装置表面。该总体方法和其改进记载于欧洲专利EP-B-0086186、EP-B-0086187、EP-B-0495820和US6,461,665中。

这些专利描述了通过以下步骤来制备表面修饰基材：首先，选择性切割肝素多糖链，例如利用亚硝酸降解形成末端醛基。其次，在医疗装置表面上引入带有伯氨基的一个或多个表面改性层，之后使多糖链上的醛基与表面改性层上的氨基发生反应，随后还原中间的席夫碱以形成稳定的仲胺键。

已知改性表面的其它方法。例如，US2005/0059068涉及用于微试验的基材。将一种活化的多胺枝状聚合物通过含有硅烷的部分与基材表面共价结合。该枝状聚合物具有分支点，其为叔胺和NH₂、OH、COOH或SH基团的末端残基。含有OH或NH₂官能团的分子可通过枝状聚合物的末端残基与该枝状聚合物结合。由于该基材是用于微试验，其通常为片材、珠子、孔板、膜等。并且含有OH或NH₂基团的部分是核酸、蛋白或肽。

WO03/057270描述了一种装置，例如含具有高表面亲水性的润滑涂层的隐形眼镜。提出许多涂层材料的示例，包括糖胺聚糖(例如肝素或硫酸软骨素)和PAMAM枝状聚合物。据称PAMAM枝状聚合物是优选的涂层之一。该文献例举了具有多层PAMAM枝状聚合物和聚丙烯酰胺与聚丙烯酸酸的共聚物(PAAm-共-PAA)的隐形眼镜。通过将隐形眼镜连续浸入两种涂层材料溶液中，形成具有PAAm-共-PAA外层的涂层。

US2003/0135195揭示了一种医疗装置例如具有高度润滑亲水性涂层的导管，该涂层由胶体脂族聚氨酯聚合物、聚(1-乙烯基吡咯烷酮-共-2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-PVP的水性稀释物、和枝状聚合物的混合物形成。该文献揭示了所述涂层可通过将装置浸入含脂族聚氨酯聚合物的胶体分散体的聚(1-乙烯基吡咯烷酮-共-2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-PVP溶液和含活性剂(例如肝素)的枝状聚合物、水、N-甲基-2-吡啶烷酮和三乙基胺的混合物中从而施涂到该装置上。该文献揭示了肝素可包含在枝状聚合物的空隙中。该文献还揭示了加载的肝素会以预定的速率从亲水性聚合物基质中溶出。

US2009/0274737揭示了移植物，例如具有润湿角≤80°的亲水表面的支架。可得到永久性结合到表面的一种、两种或更多种抗凝血成分，抗凝血剂的示例包括肝素和特定的枝状聚合物，尤其是硫酸枝状聚合物。可使表面官能化以结合抗凝血剂，官能化的示例是硅烷化和与1,1’-羰基二咪唑(CDI)反应。

US4,944,767涉及能吸附大量肝素的聚合物材料。该材料是其中聚氨酯链与聚酰胺-胺链互连的嵌段共聚物。

我们之前的申请WO2010/029189涉及具有涂层的医疗装置，其中抗凝血分子(例如肝素)通过1,2,3-三唑连接共价结合到该涂层上。该文献描述了多胺的叠氮化物或炔的官能化；炔或叠氮化物官能化的肝素的制备(天然的和亚硝酸降解的肝素)；以及通过1,2,3-三唑连接子将衍生化肝素连接到衍生的聚合物的反应。

WO2010/029189中所述的产品有很多优点，但我们已致力于发展一种改进的材料，其中肝素或其它结合的抗凝血分子的生物利用度得到提高，这对于老化有更大的稳定性，可通过稳固的方法生产并产生高度一致的产品。

肝素能结合大量不同的生物分子，包括酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如抗凝血酶)、生长因子和胞外基质蛋白、DNA修饰酶和激素受体。如果用于层析，肝素不仅是亲和配体而且是高电荷密度的离子交换物。因此生物分子可被固定于不溶性支持物上的肝素特异性和可逆性地吸附。因此固定的肝素具有多种有用的非医疗用途，特别是在分析和分离中。

发明内容

我们根据本发明提供但不限于一种具有含层状涂层的表面的装置，其中外涂层包含大量具有以下特征的阳离子高支化聚合物分子：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如，至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与抗凝血实体共价结合。

附图说明

图1是不同类型高支化聚合物的2-D示意图，其中A代表每个单体单元中都有分支点(理论上)的聚合物；B代表具有线性骨架的支化聚合物，在骨架上结合有称为树突的支化楔；C代表将支化单元引入到线性区段中的聚合物；D代表枝状聚合物。

图2显示了2-D的示例性3代PAMAM枝状聚合物(3-D结构近似球状)。

图3是示例性2代枝状聚合物的2-D示意图，其中核心有3个被取代的反应性官能团；第1层有6个被取代的反应性官能团；第二层有12个反应性官能团。该枝状聚合物具有基本上为球形的3-D形状。

图4显示了肝素部分(或其它抗凝血实体)上的第一官能团可与枝状聚合物或其它高支化聚合物的端基上的第二官能团反应。

图5显示若干枝状聚合物或其它高支化聚合物在肝素或其它抗凝血实体官能化前可能相互交联的方式。

图6显示被肝素或其它抗凝血实体官能化的若干枝状聚合物或其它高支化聚合物可能相互交联的方式。

图7是本发明组分的示意图。图中显示外涂层中含抗凝血实体的高支化聚合物与底层和外涂层中的其它高支化聚合物之间相互作用(包括共价键和/或离子间相互作用)的方式。

图8显示，与各种无血栓形成涂层接触后存留在血液中的血小板百分数(参见实施例6)。

图9显示用本发明所述含肝素涂层涂覆前和涂覆后的PVC管的示例性甲苯胺蓝染色(参见实施例3.2和实施例6.3)。图9中；板A：之前；板B：之后。

图10显示，与各种无血栓形成涂层接触后存留在血液中的血小板百分数(参见实施例11)。

发明详述

抗凝血实体

抗凝血实体是能与哺乳动物血液相互作用以防止血液凝结或血栓形成的实体。

抗凝血实体为本领域技术人员所熟知，其中很多是寡糖或多糖。一些实体是糖胺聚糖，包括含葡糖胺、半乳糖胺和/或糖醛酸的化合物。最合适的糖胺聚糖之一是“肝素部分”，尤其是全长肝素(即天然肝素)。

术语“肝素部分”指肝素分子、肝素分子片段、或者肝素衍生物或类似物。肝素衍生物可以是任何的肝素功能性或结构性变体。代表性变体包括肝素的碱金属或碱土金属盐，例如肝素钠(例如Hepsal或Pularin)、肝素钾(例如Clarin)、肝素锂、肝素钙(例如Calciparine)、肝素镁(例如Cutheparine)、和低分子量肝素(通过例如氧化解聚或去氨基切割制备，例如阿地肝素钠或达肝素)。其它示例包括硫酸乙酰肝素、类肝素、基于肝素的化合物和具有疏水性抗衡离子的肝素。其它需要的抗凝血实体包括称为“磺达肝素(fondaparinux)”组合物(例如来自葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline)的Arixtra)的合成肝素组合物，该组合物包含抗凝血酶介导的Xa因子抑制剂。其它肝素衍生物包括通过例如弱亚硝酸降解(US4,613,665)或高碘酸盐氧化反应(US6,653,457)和本领域技术人员已知的其它保留肝素部分生物活性的修饰反应进行修饰的肝素和肝素部分。

肝素部分也包括下文所述与连接子或间隔子结合的部分。去硫酸肝素或通过例如糖醛酸部分的羧酸基团官能化的肝素比起其它形式的肝素相对欠妥，因为相比其它形式的肝素，它们通常会减小抗凝血特性。只要能保持肝素生物活性，单官能化或低官能化程度的羧酸基团都可以接受。

适当地，每个抗凝血实体与高支化聚合物分子单点结合，特别是端点结合。该结合是通过下文所述的高支化聚合物分子上的官能端基。抗凝血实体端点结合于肝素部分时，适合通过其还原末端(有时称为还原端的C1位置)连接到高支化聚合物分子上。端点结合、尤其是还原端点结合的优点在于抗凝血实体(例如肝素部分)的生物活性得到最大化，这是因为相比抗凝血实体的其它结合位点，所述的抗凝血酶相互作用位点的利用度提高。

当存在多种抗凝血实体例如肝素部分时，其中的一些或全部都可以为不同类型；但通常它们都会是同一种类型。

抗凝血实体通常是阴离子(如肝素部分的情况)。

也可考虑使用其它抗凝血实体，例如蛭素、丙酮香豆素钠(4-羟基香豆素类样华法林的维生素K拮抗剂)、抗血小板药(如氯吡格雷和阿昔单抗)、阿加曲班、血栓调节蛋白或抗凝血蛋白(如蛋白C、S或抗凝血酶)。抗凝血实体也可包括酶，例如腺苷三磷酸双磷酸酶。这些物质可以带电(例如阴离子)或不带电。一些本领域技术人员可设计将这些物质结合到高支化聚合物从而保持其生物活性的方法。

高支化聚合物

图1显示不同类型高支化聚合物的示意图，A至D型。图1中的A代表每个单体单元中都有分支点(理论上)的聚合物；B代表具有线性骨架的支化聚合物，在骨架上结合有称为树突的支化楔；C代表将支化单元引入到线性区段中的聚合物；D代表枝状聚合物。如果核心区段相对该分子总尺寸而言足够小，那么这些聚合物是用于本发明内容中的高支化聚合物示例。

术语“高支化聚合物分子”为本技术领域所熟知，它是指具有从一般位于中心的核心部分发散出的树状支化结构的分子。本发明内容中，该术语也包括熟知的枝状聚合物，当支化程度为100％时称为高支化聚合物分子(本文有时称为“完全支化”，即100％的可支化官能团都发生支化)，因此围绕核心高度对称。

高支化聚合物由三个基本结构组分组成，(i)核心、(ii)内部和(iii)官能端基。核心位于分子中心，与其连接的支化楔称为树突。树突可以完全支化或低于完全支化。

高支化聚合物分子的核心是多官能的(无论是多个相同类型或多个不同类型的官能度)，其所含官能团的数目决定了该分子中可能引入的支链数。通常会利用核心的所有官能团进行支化。相似地，核心形状决定了高支化聚合物分子的形状，基本四面体的核心可产生基本球形的高支化聚合物分子，更长的核心可产生卵形或杆形的高支化聚合物分子。

本发明的核心部分是相对聚合物总尺寸较小的实体，其分子量为14-1,000Da，更通常为40-300Da，例如50-130Da。

枝状聚合物是支化程度达到100％的完全支化分子，从而结构高度规则，因此对于给定的原料而言，仅有的变化就在于层数或枝状聚合物的代数。代数通常是从核心开始向外数。参见例如，下文的表2-4。图2显示了第三代枝状聚合物，图3显示第二代枝状聚合物。因为它们具有高度的一致性和对称结构，给定代数的枝状聚合物的分子量分布极其狭窄，这样可高度有利地得到极其一致的产品。

其它高支化分子也含有大量支链，然而，支化程度例如通常至少为30％、40％或50％，如至少为60％、70％、80％或90％。与枝状聚合物不同，该高支化分子结构并不完全规则，但它们也具有大体上为球状的结构。

通常核心是不同于聚合物重复单元的分子部分。但在一个实施方式中，核心是与聚合物重复单元(或重复单元之一)的类型相同的部分。

高支化聚合物分子通常通过扩散法(从核心形成多层)或收敛法(形成片段，然后缩合)制备。枝状聚合物更通常利用扩散法制备。

在枝状聚合物的合成中，必须高度控制各支化单元的加成反应，所得产物的多分散性指数(PDI)为1.00-1.05。树突尺寸取决于单体的层数，各加成层用代数(G)表示。内部由具有ABx官能团(x≥2)的支化单体组成。支化单元的认真制备能控制A和B′之间的反应，如果B′是B的激活态。更大的枝状聚合物可形成球形、纳米尺寸的结构，从而特性粘度较低。

传统上，枝状聚合物利用迭代技术合成，其中将ABx单体交替地加到生长种类上，然后进行激活/去保护步骤。这些方案依赖确保端基B′完全取代的有效反应。任何偏差都会导致结构缺陷，这些缺陷在枝状聚合物生长期间累积从而导致复杂或不可能的纯化步骤。

参见AldrichimicaActa(2004)37(2)1-52“Dendrimers:buildingblocksfornanoscalesynthesis”(“枝状聚合物：用于纳米级合成的结构模块”)，其全部内容通过引用纳入本文，例如42-43页中的进一步论述枝状聚合物合成和命名。

用于本发明的高支化聚合物可以是具有该类型结构缺陷的枝状聚合物。

非枝状聚合物的高支化聚合物，例如，可通过反应性单体或多于一种的反应性单体聚合而成。例如，多胺高支化聚合物可通过氮丙啶聚合如用碱处理而制备。

示例性核心部分包括胺，例如胺的部分(Mw14Da)、二胺(例如，乙二胺(Mw56Da))、丙烯二胺(Mw70Da)或1,4-二氨基丁烷(Mw84Da)、和三胺(例如二亚乙基三胺(NCH₂CH₂NHCH₂CH₂N)(Mw99Da)或1,2,3-三氨基丙烷(89Da))。其它核心可包含氧，包括C(Me)(CH₂O)₃(Mw117Da)，或包含硫，包括(NCH₂CH₂S-SCH₂CH₂N)(Mw148Da)。

阳离子高支化聚合物主要携带正电荷，pH约为7，也就是说，它们只含有不带电基团和带正电荷的pH为7的带电基团，或者(较不优选)含有带负电荷、pH为7的基团，该基团数目小于带正电荷的基团。本发明的阳离子高支化聚合物通常具有作为官能端基的伯胺。

本发明所用的高支化聚合物可具有多个官能度，例如它们可以是多胺(完全或基本上含有仲胺和叔胺基，并具有作为官能端基的伯胺)、聚酰氨胺(酰胺基和仲胺和叔胺基，并具有作为官能端基的伯胺)或带有胺基官能团的聚醚(聚醚例如PEG，其中端基已转化为伯胺基)。

示例性的高支化聚合物家族是聚酰氨胺(PAMAM)，其中氨或者二胺或三胺的部分(如乙二胺)可用作核心部分，支化分子代数的加成可通过使氨或游离胺基与(例如)丙烯酸甲酯反应形成，之后通过乙二胺产生外表面上有大量游离胺基的结构。通过进一步与丙烯酸甲酯和乙二胺反应形成后续代数。其中内层所有伯胺基都已与丙烯酸甲酯和乙二胺反应的结构就是枝状聚合物。PAMAM枝状聚合物可使用树突技术公司(DendritechInc.)生产的商标名为的产品。Starburst枝状聚合物由树突技术公司、西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)和树突纳米技术公司(DNT)(DendriticNanotechnologies)出售。

其它高支化聚合物示例可包括多胺，例如由相关结构模块聚合而成的聚丙烯亚胺(PPI)和聚乙烯亚胺(PEI)聚合物。基于PPI的高支化聚合物也可从例如二氨基丁烷的核心合成，并由伯胺基与丙烯腈反应然后氢化形成。PPI枝状聚合物可使用由DSM和西格玛-艾尔德里奇公司出售的商标名Astramol^TM的产品。聚乙烯亚胺(PEI)聚合物可获自例如巴斯夫(BASF)、日本触媒公司(NipponShokubai)和武汉光明化学公司(WuhanBrightChemical)。

因此，高支化聚合物可选自聚酰氨胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯亚胺以及包含一个或多个聚酰氨胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯亚胺和多胺高支化聚合物的其它多胺聚合物和共聚物。

总之，具有作为官能端基的伯胺基的阳离子高支化聚合物，例如PAMAM或者聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，特别适用于本发明。

由于有降解的倾向，包含酯、碳酸酯、酸酐和聚氨酯的高支化胺化聚合物相对不适用。但生物稳定性可取决于可生物降解的基团数目和比例，因此一些可适用于本发明。

下表1中描述了特定高支化聚合物的特性：

表1

示于图2的PAMAM基于作为核心部分的乙二胺。下表2中描述了根据代数产生的特性。

表2

参见AldrichimicaActa(2004)37(2)1-52“Dendrimers:buildingblocksfornanoscalesynthesis”(“枝状聚合物：用于纳米级合成的结构模块”)。

*结构，参加方案1

方案1PAMAM-G0枝状聚合物的合成。方案1中：a是丙烯酸甲酯，b是乙烷-1,2-二胺。

方案2显示了通过氮丙啶聚合的基于乙二胺核心的示例性PEI高支化聚合物。

方案2PEI高支化聚合物的合成。方案2中：PEI高支化聚合物是第4代具有乙烷-1,2-二胺核心(Mw＝56Da)的聚合物。*表示可进一步加成氮丙啶单体的示例性位点。

方案3显示了通过丙烯腈聚合的基于丁烷,1,4-二胺核心的示例性PPI枝状聚合物。

方案3.PPI枝状聚合物的合成。方案3中：PPI枝状聚合物是具有丁烷-1.4-二胺核心(分子量＝84Da)的第三代聚合物。

用于本发明的高支化聚合物分子的分子量通常约为1,500-1,000,000Da，更通常约为10,000-300,000Da，例如约25,000-200,000Da。适用于本发明的高支化聚合物分子的形状基本为球形。通过激光散射测定，它们的直径通常约为2-100nm，例如2-30nm，尤其是约5-30nm。

当高支化聚合物是PAMAM枝状聚合物时，分子量通常约为5,000-1,000,000Da，更通常约为12,000-125,000Da，直径约为1-20nm，例如2-10nm，尤其约为4-9nm。

用于本发明的高支化聚合物中，总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1，例如至少100:1，例如至少200:1，例如至少500:1，例如至少1000:1。该比例通常低于20,000:1，例如低于10,000:1，例如低于5,000:1。例如，比例在80:1-20,000:1之间，例如200:1-5,000:1之间，例如200:1-1600:1之间，例如400:1-1600:1之间。

为避免疑义，本文中的高支化聚合物总分子量排除任何共价结合的抗凝血实体或任何有用试剂的重量。

该比例由核心分子量和高支化聚合物总分子量决定。所计算的比例随核心变化(以化学组合物和分子量表示)和代数的分子量变化(以每代中的单体分子量和单体数目表示)而变化。

对于PAMAM枝状聚合物，优选衍生自乙烷-1,2-二胺的核心，代数优选3-10代，更优选4-7代，即4、5、6或7代。

对于PAMAM高支化聚合物，优选衍生自乙二胺的核心，高支化聚合物中结合的反应性单体(丙烯酸甲酯，Mw＝56Da，和乙二胺，Mw＝57Da)数目示例性地为，各单体50-9,000个，例如100-5,000个，例如100-2,000个。

对于PEI高支化聚合物，优选衍生自乙二胺的核心，高支化聚合物中结合的氮丙啶单体(Mw＝42Da)数目示例性地为110-20,000个，例如110-10,000个，例如110-3,000个单体。

对于PPI高支化聚合物，优选衍生自丁烷-1,4-二胺的核心，高支化聚合物中结合的丙烯腈单体(Mw＝56Da)数目示例性地为120-17,000个，例如120-4,000个，例如120-1,000个单体。

在本发明的装置中，装置表面上的多个阳离子高支化聚合物分子可任选地互相交联。可在高支化聚合物分子涂覆于装置表面之前或之后以及在抗凝血实体与之结合之前或之后进行交联(参见图5，6)。

在高支化聚合物分子交联的情况中，可交联形成聚集体高支化聚合物的分子数为2个或更多，例如2-500，例如2-10，例如2-5；聚集体中各分子可通过一个或多个交联键(例如，多至10个交联键)与另一分子相连。

用于本发明的2个或更多个高支化聚合物分子的聚集体分子量通常约为3,000-2,000,000Da，更通常约为50.000-500,000Da。用于本发明的高支化聚合物聚集体直径约为5-100nm，尤其约为20-100nm。

利用抗凝血实体对高支化聚合物分子的衍生化

高支化聚合物分子具有大量的能与抗凝血实体(如肝素)反应的官能端基(参见附图4)。根据适当的情况，该官能端基可以是相同或几种不同的类型。因此，本发明的优点之一是可设计具有所需官能端基数目的分子，该官能端基具有特定的官能度。这样能将所需量的抗凝血实体选择性地固定到装置表面上但不干扰底层构成。

与使用基本线性的聚合物结构相比，高支化分子的支化结构能得到更高的抗凝血实体的表面密度，而仍使那些抗凝血实体实现足够的间隔以确保各实体的生物利用度相比以前的已知涂层而言不受到降低，并且实际上可以得到提高。

高支化聚合物的另一有益特性是，大部分反应性官能端基位于高支化分子表面，因此基本上所有抗凝血实体可在高支化聚合物表面上利用。在枝状聚合物中该作用尤其显著，其中所有可利用的官能团都在表面上。与反应性官能端基可能隐藏于结构内部而不是在表面上的常规涂层聚合物相比，该特性赋予了特别益处。这说明与这种常规涂层聚合物中的官能团反应的抗凝血实体可能会固定在聚合物表面的间隙中而不能被生物利用。

衍生化高支化聚合物结构使抗凝血实体在其结合的层(例如外涂层)中分布更均匀，原则上应该能提高老化稳定性。另外，高支化聚合物上抗凝血密度的可选择性和可调整性能使该装置上的抗凝血分布更可靠并且更可预测。高支化聚合物-抗凝血实体偶联物的预制造还可降低批次之间的差异性，因为不在表面上而是在溶液中更容易调整高支化聚合物被抗凝血实体(如肝素)的取代程度。

本发明另一方面提供了一种阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与抗凝血实体共价结合。

根据结合到官能端基的抗凝血实体数目和其电荷(例如，用肝素作为抗凝血实体的情况下为负电荷)，阳离子高支化聚合物可带净正电荷或净负电荷。

适当地，抗凝血实体仅与高支化聚合物分子上单个官能端基并不与任何其它分子共价连接。抗凝血实体不会与高支化聚合物的核心偶联，仅与高支化聚合物的官能端基偶联。

与抗凝血实体共价结合的官能端基数目为1个或多个，例如2个或更多个，例如2-200个，例如10-100个，但没有特定上限。可结合的数目取决于可利用的端基数目，其为阳离子高支化聚合物分子尺寸的函数。与抗凝血实体共价结合的官能端基数目可以是，例如1-95％，例如5-95％，例如10-80％，例如10-50％的可利用官能端基。与抗凝血实体共价结合的官能端基数目可以是，例如5-50％，例如5-40％，例如5-30％，例如约25％的可利用官能端基。抗凝血实体为阴离子时(例如，肝素部分的情况下)，可结合的数目也取决于是否需要所得衍生化高支化聚合物带净正电荷(在不应该有过多阴离子抗凝血实体共价结合的情况中)或净负电荷。

抗凝血实体与阳离子高支化聚合物的偶联

各抗凝血实体通常通过连接子和任选的一个或多个间隔子共价连接于阳离子高支化聚合物。通过高支化聚合物官能端基与抗凝血实体官能团反应形成该连接子。表3和方案4显示了适用于将抗凝血实体通过形成共价连接子的官能团结合到高支化聚合物的一些连接子类型和所用反应类型的示例。参见例如，参考文献ISBN:978-0-12-370501-3，Bioconjugatetechniques(《生物共轭技术》)，第二版，2008。然而，也可考虑利用自由基偶联反应。

对于各连接子，一个官能端基位于高支化聚合物上，另一个位于抗凝血实体上。原则上，任一方法都是可能的，即参照表3，官能团1和2可分别位于高支化聚合物和抗凝血实体上，或者可分别位于抗凝血实体和高支化聚合物上。

在一些情况下，抗凝血实体和高支化聚合物可通过含有多于一个官能团的连接子相连。例如，在连接子是硫醚的情况下，双官能分子(例如在各末端具有SH基团)可在各末端分别与炔/烯官能化的抗凝血实体和炔/烯官能化的高支化聚合物分子连接，以至连接子含有两个硫醚。或者，双炔/烯分子可在各末端分别与硫醇官能化的抗凝血实体和硫醇官能化的高支化聚合物连接，也产生含有两个硫醚的连接子。对于其它连接子类型存在相似可能性，如表3清楚描述。高支化聚合物也可携带两个或更多个不同官能团，例如胺和炔官能度，以至抗凝血实体可通过多于一种的连接子类型与高支化聚合物官能端基结合，然而，我们优选利用一种连接子类型结合抗凝血实体。

连接子部分分子量通常约为14-200Da，例如14-100Da。

表3

下文论述了示于表3和方案4中的示例性化合物：

-C-NH-C-连接

还原性胺化：还原性胺化，也称为还原性烷基化，是一种将羰基通过亚胺中间体(席夫碱)转化为胺连接子的胺化形式。该羰基最常用的是酮或醛。

方案4还原性胺化：

-C-NH-CHR-CHR-C(＝O)-连接

迈克尔(Michael)加成：迈克尔反应或迈克尔加成是碳负离子或其它亲核试剂(例如伯胺或硫醇)与α、β不饱和羰基化合物的亲核加成。这属于更大类别的偶联加成。这是温和形成C-C键的最有用的方法之一。

-C-S-C-连接

硫-溴：硫醚连接通常通过对硫醇烷基化来制备。硫醇可与溴化物反应产生硫醚连接。该反应通常在碱的存在下进行，其中将硫醇转化为更亲核的硫醇盐。

巯基-烯和巯基-炔：或者，硫醚连接可通过使含巯基的第一化合物与含有烯基或炔基的第二化合物反应来制备。适当的情况下，第一和第二化合物可分别为高支化聚合物分子和抗凝血实体。

适当地，在还原剂例如三(2-羧基乙基)盐酸膦或者二硫苏糖醇或硼氢化钠的存在下发生反应，以避免或逆转两个巯基通过氧化发生不需要的偶联。

在一个实施方式中，该反应由自由基引发剂引发。一个自由基引发剂的示例是4,4′-偶氮二(4-氰基戊酸)。其它示例是过硫酸钾、2,2'-偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、偶氮二异丁腈(AIBN)、1,2-二(2-(4,5-二氢-1H-咪唑-2-基)丙-2-基)二氮烯二盐酸盐、2,2'-(二氮烯-1,2-二基)二(2-甲基-1-(吡咯烷-1-基)丙-1-亚胺)二盐酸盐、3,3'-((二氮烯-1,2-二基二(1-亚氨基-2-甲基丙烷-2,1-二基))二(氮烷二基))四水合二丙酸盐、二苯甲酮和二苯甲酮衍生物，例如4-(三甲基铵甲基)氯二苯甲酮。其它示例是过硫酸铵。

在另一个实施方式中，该反应不由自由基引发剂引发。但采用更高pH的条件(如pH8-11)。使用活化的烯或炔与巯基反应时，该类型的反应更加适合。

含巯基的第一化合物与含炔基的第二化合物之间的反应可如下表示

其中，R^a和R^b中的一个为高支化多胺，R^a和R^b中的另一个为抗凝血实体。

形成含连接子的烯时，该化合物可与例如巯基(示于表3)或胺进一步发生化学转化。

当第二化合物是衍生自烯时，在一个实施方式中使用活化的烯。合适的活化烯的示例是马来酰亚胺衍生物。

含巯基的第一化合物与含马来酰亚胺基团的第二化合物之间的反应可如下表示：

其中，R^a和R^b中的一个为聚合物，R^a和R^b中的另一个为抗凝血实体。该反应通常在作为还原剂的三(2-羧基乙基)盐酸膦和作为自由基引发剂的4,4′-偶氮二(4-氰基戊酸)的存在下，在酸性条件下进行。

三唑连接(CuAAC偶联)

叠氮-炔：可通过用炔和叠氮化合物反应来制备1,2,3-三唑连接。可通过一个抗凝血实体和高支化聚合物分子中的炔基与另一个抗凝血实体和高支化聚合物分子中的叠氮基之间的反应形成连接子。实施该反应的方法与记载在WO2010/029189中的方法相似。

叠氮和炔基之间的反应可在高温(T>60℃)下或金属催化剂的存在下进行，所述金属催化剂是例如铜，如通常用于Huisgen环加成反应(叠氮和末端炔的1,3-偶极环加成反应以形成1,2,3-三唑)的使用Cu(I)催化剂的反应条件。需要时，可原位生成Cu(I)催化剂，例如通过(例如)用抗坏血酸钠还原相应Cu(II)化合物。需要时，该反应也可在流动条件下进行。

CuAAC反应可在例如大约5-80℃的温度下、优选大约室温下进行。该反应的pH值可以是大约2-12，优选大约4-9，最优选大约7。合适的溶剂包括能溶解与叠氮或炔连接的实体的那些溶剂，例如二甲亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃，优选水或水与一种上述物质的混合物。可调节表面上的实体比例以提供表面上实体的所需密度。

-C(＝O)-N-连接

酰胺化：通常用羧酸和胺反应形成酰胺。羧酸和羧酸衍生物可进行许多化学转化，通常通过攻击羰基破坏羰基双键并形成四面体中间体。已知硫醇、醇和胺都可能用作亲核试剂。在生理条件下的酰胺相比酯反应性较低。

用活化的酸进行酰胺化：在常规羧酸只会形成盐的条件下，活化的酸(基本是具有良好离去基团的酯，如NHS-活化的酸)可与胺反应以形成酰胺连接子。

-C-S-S-CH ₂ -CH ₂ -C(＝O)-N-连接

用SPDP试剂偶联：N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶二硫)丙酸盐(SPDP)及其类似物属于一种胺基和巯基反应性异双官能连接的独特基团的形成试剂，该试剂产生含二硫键的连接。

还原性胺化、迈克尔加成、硫-溴反应、用NHS活化酸酰胺化、用SPDP试剂偶联、CuAAC和巯基-烯偶联都适于提供良性的偶联条件和高产量的连接子形成。

示于表3的组别仅为示例性目的，当然也可采用其替代性或改变的官能度。例如，胺基可位于仲碳，或所示的脂族链可由芳族基团取代。

自由基引发反应

如上文简述，高支化聚合物分子的官能端基可通过自由基引发反应形成的连接子与抗凝血实体偶联。自由基可例如通过热量、光解(NorrishI型和/或II型反应)、电离、氧化、等离子体或电化学反应产生。例如，用二苯甲酮处理具有游离伯胺基的高支化聚合物分子时，产生例如碳或氧自由基的自由基，这些自由基可参与自由基引发反应(例如与烯的反应)。

在一个实施方式中，共价连接子含有仲胺连接。特别地，该连接子可含有-NH-基团；

在另一个实施方式中，共价连接子含有酰胺连接。特别地，该连接子可含有-NH-C(O)-基团；

在另一个实施方式中，共价连接子含有硫醚连接。

在另一个实施方式中，共价连接子含有1,2,3-三唑连接。

术语“硫醚连接”指硫和两个碳原子的连接。该连接有时被称为“硫化物(sulfide)”。硫可与两个饱和碳原子结合(即–C-S-C-)，或可与一个饱和和一个不饱和碳原子结合(即–C-S-C＝)。

术语“巯基”指-S-H部分。

术语“仲胺连接”指NH基团和两个碳原子之间的连接，即-C-NH-C-。

术语“酰胺连接”指两个碳原子的-C-C(O)NH-C-型连接。

在一个实施方式中，抗凝血实体(如肝素部分)和高支化聚合物分子的官能端基之间的连接子是非支化的连接子。

该连接子可生物降解或非生物降解，但非生物降解更合适，因为涂层装置需长期无血栓形成。

存在多个连接子时，其中一些可以是不同类型。

在一个实施方式中，所有连接子是同一类型。

间隔子

最简单的形式中，高支化聚合物的官能端基和抗凝血实体之间是通过连接子(例如表3中所示)共价连接。然而该连接子可任选地通过间隔子与表面和/或抗凝血部分间隔开。

若采用间隔子，其目的通常是显著增加高支化聚合物分子和抗凝血实体之间的间隔，即显著增加装置表面与抗凝血实体之间的间隔。例如，间隔子分子量可以为50-10⁶Da，一般为100-10⁶Da，例如100-10⁴Da。例如间隔子长度可为我们优选支链间隔子。在一些实施方式中，间隔子是亲水性的，例如可包含PEG链。一方面，高支化聚合物分子的官能端基与抗凝血实体之间的共价连接可视为具有三个部分－高支化聚合物分子的官能端基和连接子部分之间的“间隔子A”、连接子部分、以及连接子部分和实体之间的“间隔子B”。在一个实施方式中，间隔子A的分子量为50-10³Da。在另一个实施方式中，间隔子B的分子量为50-10³Da。在一个实施方式中，间隔子A含有一个或多个芳族环。在另一个实施方式中，间隔子A不含任何芳族环。在一个实施方式中，间隔子B含有一个或多个芳族环。在另一个实施方式中，间隔子B不含任何芳族环。在一个实施方式中，间隔子A是亲水性的。在另一个实施方式中，间隔子B是亲水性的。在一个实施方式中，间隔子A包含PEG链。在另一个实施方式中，间隔子B包含PEG链。在一个实施方式中，间隔子A和B都是亲水性的，例如它们各自含有PEG链。如本文所用，PEG链指可通过环氧乙烷聚合得到的聚合物链，通常重100-10⁶Da。另一方面，共价连接可含有两个或更多个三唑环。在另一个实施方式中，共价连接可视为含有5个部分－表面和第一连接子部分间的“间隔子A”、第一连接子部分、第一连接子部分和第二连接子部分间的“间隔子B”、第二连接子部分、以及第二连接子部分和实体间的“间隔子C”。在一个实施方式中，间隔子A的分子量为50-10³Da。在一个实施方式中，间隔子B的分子量为100-10⁶Da。在一个实施方式中，间隔子C的分子量为50-10³Da。在一个实施方式中，间隔子A和/或间隔子B和/或间隔子C是亲水性的，例如包含PEG链。例如，间隔子B(至少)可包含PEG链。

虽然可存在间隔子，但它们通常不是必需的，因为应该注意到，高支化聚合物结构通过其尺寸和形状可提供抗凝血实体与装置表面之间一定的间隔。

在存在间隔子的情况下，它们是例如约的支链间隔子。

具有包含PEG链(或其它亲水性聚合物)的间隔子的一个具体的优点在于能提供装置润滑特性。

该间隔子可生物降解或非生物降解，但非生物降解更合适，因为涂层装置需长期地无血栓形成(即涂层装置保持无血栓形成的特性)。

涂层结构模块的官能化

i.不需要在先修饰高支化聚合物分子或抗凝血实体的连接子形成。

示于上述表3中的几个连接子可直接通过高支化聚合物官能端基(如高支化多胺)和含醛的抗凝血实体反应形成。

因此表3中所示的还原性胺化、迈克尔加成、SPDP反应和酰胺化反应需要伯胺官能端基的存在。高支化分子例如高支化多胺例如PAMAM枝状聚合物具有适用于这些连接形成反应中的游离伯胺基团，因此不需要进一步修饰。

因此，在一个实施方式中，高支化聚合物分子携带多个作为官能端基的游离伯胺基团，这些高支化聚合物分子是例如PAMAM、PPI或PEI高支化聚合物分子。

亚硝酸降解的肝素和天然肝素在其还原性末端具有反应性基团，分别为醛基团和半缩醛官能团，因此亚硝酸降解的肝素和天然肝素可在还原性胺化反应中与具有游离伯胺基的高支化聚合物反应以形成含仲胺基的连接子，如上述表3和方案4表示。

在胺官能化表面和肝素衍生物之间形成仲胺连接的方法记载于例如EP-B-0086186、EP-B-0086187、EP-B-0495820和US6,461,665。

ii.需要修饰高支化聚合物和/或抗凝血实体的连接子形成。

或者，可修饰抗凝血实体和/或高支化聚合物以携带合适的官能团，下文将对其进行更详细的论述。

衍生化肝素和其它抗凝血实体(例如)以结合炔和叠氮基团的方法记载于WO2010/029189，其全部内容通过引用纳入本文。

因此，对于一些在上表3中描述的连接子，必须预先制备高支化聚合物分子和/或抗凝血实体的官能化衍生物。

可使用本领域已知技术官能化高支化聚合物分子。PAMAM枝状聚合物或相似高支化聚合物上的伯胺基团可用作适用于形成所选共价连接的官能团的连接点，例如烯基、炔基、巯基、卤素基团或叠氮基。因此高支化多胺可通过常规方法官能化以含有烯基、炔基、巯基、卤素基团或叠氮基，所述方法是例如通过多胺上的伯胺基侧基与含有烯基、炔基、巯基、卤素基团或叠氮基的活化羧酸(例如羧酸的N-羟基-琥珀酰亚胺衍生物)反应。

因此，为引入合适的烯基或炔基，如下显示了含有多个伯胺基团的高支化多胺分子：

R”-NH₂

其中R”是高支化多胺残基；

可与下式的化合物反应：

其中n是1-8的整数，例如1-4；

为得到下式的马来酰亚胺官能化多胺：

其中R”和n如上文定义。

或者，高支化多胺可与下式的活化含烯基团反应：

其中n是1-8的整数，例如1-4；

为得到下式的炔官能化高支化多胺：

其中R”和n如上文定义。

相似地，具有作为官能端基的游离伯胺的高支化聚合物可用巯基衍生化。该情况下，例如PAMAM枝状聚合物的高支化多胺含有多个如下表示的伯胺基团：

R”-NH₂

式中R”如上文定义；

可与含巯基的活化羧酸反应，该羧酸例如下式的化合物：

其中n是1-8的整数，例如1-4；

为得到下式的衍生化聚合物：

其中R”和n如上文定义。

卤素基团可以相似方式引入到高支化聚合物分子中。

人们也可考虑使用其它包括SPDP或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)的酰胺化反应，以得到相同官能化。

具有烯基、醛基、炔基、巯基、偶氮基、胺基、卤素基团、活化的羧酸、马来酰亚胺酯或α,β-不饱和羰基的抗凝血实体(如肝素)可通过本身已知的常规方法制备。例如，具有炔基/烯基的抗凝血实体(例如肝素)可通过使用本身已知的常规技术(参见例如WO2010/029189的实施例3a、3b和3c)使下式的烷氧基胺：

R¹-O-NH₂

其中R¹是含炔基/烯基的基团；与抗凝血实体上的醛基或半缩醛基团反应制备。通过形成氧-亚胺官能团进行该类型反应以得到下式的化合物：

R¹-O-N＝R’

其中R¹如上文定义，R’是抗凝血实体的残基。

亚硝酸降解的肝素和天然肝素在其还原性末端含有反应性基团，分别为醛基和半缩醛官能团，可通过该方式连接。

相似地，用巯基衍生化的抗凝血实体可通过抗凝血实体上的醛基或半缩醛基团与下式化合物反应来形成：

HS-X-NH₂

其中，X是烃类间隔子，例如(CH₂)_n，n是1-8，如1-4，其中一个或多个(如1或2个)亚甲基任选地被O取代；或者X包含具有1-100个(如1-50个，如1-10个)乙二醇单元的PEG链；

为得到下式的产物

R’-CH₂-NH-X-SH

其中X如上文定义，R’-CH₂-是抗凝血实体的残基。

该过程的一个实施例示于下文的实施例4.2中。

可采用类似方法来引入叠氮基或卤素基团，例如氟、氯或溴。

如上文所述，修饰高支化聚合物的一个原因是引入特定的官能团从而能够偶联抗凝血实体。高支化聚合物具有特定的现有官能端基(如伯胺基团)时，它们可转变为其它官能团，例如叠氮或炔基。所有或(更通常地)一些(例如0.5-25％)官能团可为该目的转变。

也可能需要引入用于其它目的的新官能团。例如一些(例如0.5-25％)现有官能端基(例如伯胺基)可转变为其它官能团，如叠氮或炔基，从而能够结合有益试剂，例如下文所述的润滑试剂。

表面涂层

该装置具有含层状涂层的表面，该涂层由一层或多层形成。该装置，尤其当它是医疗装置时，可含有一个或多个含空隙或孔的部分。该孔可位于装置内部并且/或是该装置至少一个表面的一部分。多孔医疗装置的一个示例是膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)。孔可含有或不含有涂层。

较佳地，一部分装置表面(理想上是无血栓形成的)或整个装置表面覆有涂层。

该装置表面可含有一层或多层涂层(例如2层或更多层，或者3层或4层或5层，最高至20层涂层)，术语“外涂层”指在医疗装置中接触患者组织或体液或者在分析或分离装置中会接触待分析、待分离或待处理物质的一层涂层。因此，外涂层可以是空心装置或开放结构装置(如支架)的外和/或内表面上的涂层。本文中非外涂层的层指“底层”。

本发明所述的外涂层包含大量通过官能端基共价结合一个或多个抗凝血实体的阳离子高支化聚合物分子。

通常，外涂层的大部分或甚至全部阳离子高支化聚合物分子通过其官能端基与大量抗凝血实体共价结合。

最佳层数取决于制造装置的材料类型和表面涂层的预期用途。本领域技术人员可容易地确定完全覆盖装置表面所需的层数和涂层特性。需要时，表面涂层可逐层地构成。

例如，涂层可通过以下方式形成：在装置表面上吸附阳离子聚合物，然后施涂阴离子聚合物溶液，例如阴离子多糖，如硫酸葡聚糖或带净负电荷的官能化阳离子高支化聚合物，以得到至少一层阴离子聚合物吸附层。参见MultilayerThinFilms(多层薄膜)ISBN:978-3-527-30440-0。因此表面可包含一层阳离子聚合物和一层阴离子聚合物，例如多糖或带净负电荷的官能化阳离子高支化聚合物。更通常地，表面涂层可包含一层或多层阳离子聚合物和阴离子聚合物的双涂层。一般最内层(即施涂到装置裸表面如金属、塑料或陶瓷表面上的层)为阳离子聚合物层。

下文更详细地论述了包含大量通过其官能端基共价结合一个或多个抗凝血实体的阳离子高支化聚合物分子的外涂层可以两种方式施涂。根据第一种方式，总体上带正电荷的阳离子高支化聚合物分子可施涂到装置表面的阴离子聚合物上。然后高支化聚合物分子可经修饰与抗凝血实体连接。根据第二种方式，通过其官能端基共价结合一个或多个抗凝血实体的阳离子高支化聚合物分子可施涂到装置表面的阴离子或阳离子聚合物上，具体取决于官能化高支化聚合物分子总体上是带正电荷还是带负电荷。

在一些情况下，阳离子高支化聚合物分子可通过反应性官能团与聚合物表面涂层交联。如果阳离子高支化聚合物在与抗凝血实体反应之前与装置表面或底层涂层交联，则必须确保保留足够量的氨基(或引入的其它反应性基团)以至能将所需量的抗凝血实体连接到外涂层上。或者，阳离子高支化聚合物分子可在施涂到装置表面或涂层上并发生交联后与抗凝血实体反应。抗凝血实体和表面涂层之间一般不直接交联。

多种阳离子聚合物可用于底层。示例性阳离子聚合物是多胺(例如，EP0086187Larsson和所描述的)。该聚合物可以是直链、但更通常是支链聚合物或者高支化聚合物，任选交联的。或者，除外涂层以外一层或多层(如，所有)阳离子聚合物层可包含(如，由其组成)阳离子高支化聚合物分子，该高支化聚合物与用于外涂层的高支化聚合物相同或相似。这些也可任选地交联。

涂层步骤基本上可根据EP-B-0495820所述的方法来实施，该情况中仅有外涂层包含抗凝血实体。

然而可改进EP-B-0495820所述的步骤以至外层为阴离子聚合物，然后根据下文所述与结合了一个或多个抗凝血实体的阳离子高支化聚合物(仍带净正电荷)偶联，或如下文所述与具有官能端基的阳离子高支化聚合物偶联，该官能端基能与抗凝血实体上的官能团反应形成共价连接子部分。

根据一个实施方式，提供一种装置，其中除外涂层以外的一层或多层层状涂层包含阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如，至少100:1)，以及(iv)任选地由(例如)一个或多个抗凝血实体衍生化的官能端基。

根据本发明另一实施方式，当底层包含阳离子聚合物时，它们可包含阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基。根据该实施方式，这些阳离子高支化聚合物分子可与外涂层(但不与抗凝血实体结合)中使用的那些相同，或者它们可以是不同的高支化聚合物分子。任何情况下，示例性阳离子高支化聚合物分子包括本文其它部分与那些可用于制备外涂层的阳离子高支化聚合物相关的部分中描述的那些高支化聚合物分子。

例如，包含阳离子聚合物的所有底层可包含具有以下特征的阳离子高支化聚合物分子：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基。

阳离子聚合物也可为该净负电荷的官能化阳离子高支化聚合物。

根据一个实施方式，当底层包含阴离子聚合物时，它们可包含具有以下特征的阳离子高支化聚合物分子：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与阴离子抗凝血实体共价结合以至使所述分子带净负电荷。

例如，包含阴离子聚合物的所有底层可包含具有以下特征的阳离子高支化聚合物分子：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与阴离子抗凝血实体共价结合以至使所述分子带净负电荷。

根据一个实施方式，装置表面的各涂层都是(a)阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，或者是(b)阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与阴离子抗凝血实体共价结合以至使所述分子带净负电荷。

其中一个优点是涂层的不同组分数量是最小化的。

在施涂第一涂层(即最内层)之前，可清洁装置表面以改善粘附和表面覆盖率。合适的清洁剂包括如乙醇或异丙醇(IPA)的溶剂，高pH值溶液如含醇和氢氧化物化合物(如氢氧化钠)的水性溶液的混合物的溶液，如氢氧化钠溶液，含氢氧化四甲基铵(TMAH)的溶液，碱性Piranha(氨和过氧化氢)，酸性Piranha(硫酸和过氧化氢混合物)，和其它氧化剂，包括硫酸和高锰酸钾的混合物或不同类型的过氧硫酸(peroxysulfuricacid)或过氧二硫酸(peroxydisulfuricacid)溶液(例如，铵、钠和钾盐)。

因此本发明一方面提供了一种具有表面涂层的装置，其中该表面涂层包含一层或多层阳离子聚合物和阴离子聚合物的双涂层，其中该涂层的外涂层包含大量阳离子高支化聚合物分子，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与抗凝血实体共价结合。

外涂层的形成

如上文简述，肝素部分或其它抗凝血实体可在高支化聚合物分子施涂到装置表面之前或之后与高支化聚合物分子结合。施涂外涂层的装置表面可任选地含一层或多层底层。见图7。

因此，本发明的另一方面提供一种制造上述装置的方法，该方法以任意顺序包括以下步骤：

i.使大量高支化聚合物分子的官能端基与抗凝血实体反应以至各高支化聚合物分子与大量抗凝血实体共价连接；和

ii.将高支化聚合物分子结合到装置表面。

如上所述，抗凝血实体通过共价连接与高支化聚合物分子结合，在一些情况下，必须在步骤(i)之前实施对高支化聚合物分子和/或抗凝血实体进行修饰的额外步骤以引入合适的官能团来形成高支化聚合物分子和抗凝血实体之间的共价连接。

合适的共价连接和高支化聚合物和/或抗凝血实体的修饰方法上文已详细描述。如上所述，连接子可任选地通过间隔子与表面和/或抗凝血部分间隔开。因此该方法可任选地包括通过提供间隔子修饰表面和/或抗凝血部分。

当上述方法中的第一步骤是步骤(i)时，抗凝血实体连接到高支化聚合物分子的过程可在溶液中在合适的反应条件下用合适的溶剂进行，合适的溶剂是例如THF、DCM、DMF、DMSO、IPA、甲醇、乙醇和包含其混合物的水。

当上述方法中的第二步骤是步骤(i)时)(即该方法的第一步骤是步骤(ii))，装置外涂层通常会在合适的反应条件下与抗凝血实体溶液接触。适用于抗凝血实体的溶剂是例如IPA、乙醇、THF、DMF、DMSO、DCM，尤其是包含其混合物的水。

在一个实施方式中，如上文所述，两个或更多个高支化聚合物分子可通过交联聚集。

因此，上述方法还可包括将两个或更多个高支化聚合物分子互相交联的额外步骤。两个或多个高支化聚合物分子可在用一个或多个抗凝血实体对该高支化聚合物分子官能化之前或之后通过交联聚集。进行交联的顺序可取决于该装置，例如装置的几何形状。优选在官能化后进行交联。此外，该交联步骤可在高支化聚合物分子与装置表面结合之前或之后进行。

该方法还可包括使一种或多种高支化聚合物分子与装置表面交联的步骤。例如，在外涂层上结合一个或多个抗凝血实体的高支化聚合物分子也可与位于其它涂层下层的阳离子或阴离子聚合物交联。

该交联步骤可以是上述步骤(ii)的一部分，或者交联步骤可以在步骤(ii)后进行以增强高支化聚合物分子与装置表面的粘合性并提高涂层稳定性。

如果在衍生化前进行两个或更多个高支化聚合物分子之间或高支化聚合物分子和表面之间的任何所需交联，那么必须确保该高支化分子上留有足够的游离官能团以结合适量的抗凝血实体。或者，如果首先进行衍生化，那么衍生化程度必须使留下的游离官能团能满足任何交联。

通常，优选步骤(i)在步骤(ii)前进行，因为这样更易控制结合于高支化聚合物分子上的抗凝血实体量，并且使抗凝血实体的浪费程度实现最小化，特别是在上述溶液中进行该反应。

作为本发明的一方面，我们提供一种通过上述方法所得的装置。

本发明另一方面是通过一种方法得到的无血栓形成装置，该方法包括：

(a)处理装置以呈现包含外涂层的表面涂层，该外涂层包含具有以下特征的阳离子高支化聚合物分子：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da并含有官能端基，并且(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)。

(b)一个或多个所述官能端基与抗凝血实体分子反应，该抗凝血实体经官能化具有能与高支化阳离子聚合物上的反应性官能团反应的基团；从而将抗凝血实体与高支化阳离子聚合物结合。

(a)处理装置以呈现正电荷聚合物表面层；

(b)使所述聚合物表面层与官能化的阳离子高支化聚合物分子结合，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，并且(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，且含有多个(2或10或50或100或500或更多个，取决于可用的官能端基数)带负电荷的抗凝血实体，例如肝素部分，其中所述官能化的高支化聚合物带净负电荷。

(a)处理装置以呈现负电荷聚合物表面层；

(b)使所述聚合物表面层与官能化的阳离子高支化聚合物分子结合，所述高支化聚合物分子具有以下特征：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，并且(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1(例如至少100:1)，且含有一个或多个带负电荷的抗凝血实体，例如肝素部分，其中所述官能化的高支化聚合物带净正电荷。

例如，处理装置以呈现包含阴离子聚合物(例如多糖，如硫酸葡聚糖)、其衍生物或带净负电荷的官能化阳离子高支化聚合物的表面。

交联

如本文所述，外涂层的高支化聚合物分子可任选地与其它外涂层的高支化聚合物分子交联，或可与底层分子(例如高支化聚合物分子)交联。底层中的聚合物分子可任选交联。

适当地，可根据所需的偶联化学选择用于该目的的交联剂。原则上，可使用任何双、三或多官能交联剂，例如官能化的PEG和Jeffamine。对于胺交联，适用双官能醛，例如巴豆醛或戊二醛。在一些情况下，可使用表氯醇。

交联能产生外涂层高支化聚合物分子的官能端基与另一外涂层高支化聚合物分子的官能端基或底层分子(如高支化聚合物分子或者阳离子或阴离子聚合物分子)之间的共价键。合适的交联不涉及抗凝血实体。因此适当地，抗凝血实体仅与高支化聚合物分子而并不与任何其它分子共价连接。适当地，一个高支化聚合物分子与另一高支化聚合物分子的交联涉及利用高支化聚合物分子上的不涉及与抗凝血实体连接的官能端基。在一个实施方式中，用于交联的所述官能团通过对高支化聚合物分子的原始官能端基进行再官能化而形成。

装置

该装置可以是需要结合抗凝血实体的任何装置，例如，医疗装置、分析装置或分离装置。

为本专利申请的目的，术语“医疗装置”指可植入或非可植入装置，但更通常为可植入医疗装置。可植入装置可以是永久性或暂时性可植入医疗装置，示例包括导管，支架，所述支架包括分叉状支架、球囊可膨胀型支架、自扩张支架，支架移植物，所述支架移植物包括分叉状支架移植物，移植物包括血管移植物、分叉状移植物、人工血管、血液留置监控装置、人工心脏瓣膜、起搏器电极、导丝、心脏导管、心肺转流术回路、插管、塞子、药物递送装置、气囊、组织补片装置和血泵。非可植入医疗装置的示例是体外装置，例如体外血液处理装置和输液装置。

装置可用于但不限于神经、外周、心脏、矫形外科、表皮和妇科用途。

医疗装置可具有一层或多层涂层，术语“外涂层”指当装置植入患者中或在使用中时接触患者组织或接触体液(如血液)的涂层。因此，外涂层可以是空心装置或开放结构装置(如支架)的外和/或内表面上的涂层。

例如，分析装置可以是用于实施分析方法的固体支持物，该分析方法是例如层析或免疫试验、反应性化学或催化。该装置的示例包括薄片、珠子、孔板、膜等。例如，分离装置可以是实施分离方法的固定支持物，分离方法是例如蛋白纯化、亲和层析或离子交换。该装置的示例包括过滤器和柱等。与医疗装置相似，分析或分离装置也可具有多层涂层，术语“外涂层”指与待分析、分离或处理的物质接触的涂层。

在一些情况下，可能需要调节涂层特性，该情况下除了抗凝血实体以外可将一个或多个额外实体与高支化聚合物结合。例如，如果需要提高高支化聚合物的亲水性，该额外实体可包含一个或多个PEG链。

如本文所用，术语“PEG链”指可通过环氧乙烷聚合得到的聚合物链，通常重10²-10⁶Da。

装置涂层可包含阳离子聚合物和阴离子聚合物的交替层。阳离子聚合物可以是直链聚合物，但更通常是支链聚合物、高支化聚合物或包含大量(阳离子)高支化聚合物分子的聚合物，其中，外涂层中所述高支化聚合物分子和一个或多个抗凝血实体通过其官能端基共价结合。

因此在一个本发明的实施方式中，除了外涂层，一层或多层涂层可由与外涂层相同或相似的高支化聚合物分子构成。该亚层特性可如外涂层所述，参见实施例2.2和3.3。

该装置可含有金属或合成或天然存在的有机或无机聚合物或陶瓷材料，或由其构成。

因此，例如，它可由以下物质构成：合成或天然存在的有机或无机聚合物或材料，例如聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、多糖、聚酰胺、聚氨酯(PU)、聚氯乙烯(PVC)、聚醚醚酮(PEEK)、纤维素、硅酮或橡胶(聚异戊二烯)、塑料材料、金属、玻璃、陶瓷和其它已知医疗材料或这些材料的混合物。其它合适基材材料包括氟聚合物，例如膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)、聚四氟乙烯(PTFE)、氟化乙烯-丙烯(FEP)，全氟化碳共聚物，例如四氟乙烯全氟烷基乙烯基醚(TFE/PAVE)共聚物、四氟乙烯(TFE)和全氟甲基乙烯基醚(PMVE)的共聚物，和聚合物链之间交联和不交联的上述物质的混合物。

合适的金属包括镍钛合金(Nitinol)、不锈钢、钛、钴铬、金和铂。优选Nitinol和不锈钢。也优选钛。

更通常地，合适金属包括金属质材料和合金，例如钴铬合金(ELGILOY)、不锈钢(316L)、高氮不锈钢、钴铬合金L-605、MP35N、MP20N、钽、镍钛合金、Nitinol、铂铱合金、金、镁及其混合物。

我们优选结合有抗凝血实体(如肝素或其它肝素部分)的涂层表面以至在灭菌(环氧乙烯(EO)灭菌)后保留无血栓形成特性。

可通过本领域技术人员熟知的方法进行灭菌。优选的灭菌方法是使用环氧乙烷气体。或者，其它方法例如辐射，如可使用电子束或γ射线，其中该辐射不会降解目标和/或涂层。

本发明的一个优选实施方式涉及在解剖学位点植入(例如暂时植入)或其它设置的涂层医疗装置。其它优选实施方式包括暂时用途的装置，例如导管和体外回路。示例是置入限定某空隙空间、或内腔的解剖结构以加强该解剖结构或维持该空隙空间的无菌(如灭菌的)医疗装置。适当地，所结合的抗凝血实体，如肝素或其它肝素部分，不会被洗脱至任何实质程度并保留在装置中。例如，在测试保留的AT结合能力保持充足(例如，大于1或2或4或5或10pmol/cm²)之前和/或在利用来自健康供体的新鲜血液进行血液循环评估测试(见实施例6)时，用NaCl(0.15M)清洗15小时，接触本发明所述涂层表面的血液在测试后的血液血小板数的减少量明显低于无涂层对照的减少量(例如，接触涂层表面的血液在测试后的血小板数的减少量低于20％，优选低于15％，更优选低于10％)。

根据本发明所述无血栓形成特性的装置可由多种方法检测。例如无血栓形成特性可能与较高的抗凝血酶结合能力相关，尤其与具有未处理表面的装置相比。

例如，我们优选装置(例如医疗装置)表面具有的抗凝血酶(AT)结合能力至少为1(例如至少为5)皮摩尔AT/平方厘米(pmol/cm²)表面。在其它实施方式中，AT结合能力至少为6pmol/cm²、至少为7pmol/cm²、至少为8pmol/cm²、至少为9pmol/cm²、或至少为10pmol/cm²表面。在一些实施方式中，AT结合能力至少为100pmol/cm²表面。可通过本技术领域的已知方法测定AT结合能力，例如Pasche等在“Bindingofantithrombintoimmobilizedheparinundervaryingflowconditions”(抗凝血酶在不同流动条件下与固定肝素的结合)Artif.Organs15:481-491(1991)和US2007/0264308中描述的那些。通过比较，可从Sanchez等(1997)J.Biomed.Mater.Res.37(1)37-42中推断，参见图1，AT结合值约2.7-4.8pmol/cm²(取决于实验设置)或更高时，在接触血浆时似乎没有显著提高血栓生成的酶活性。

替代性地或另外地，我们优选由于在抑制凝血上的强大能力和如实施例6所述的血液循环评估测试中所示的其它抵抗系统产生的无血栓形成表面。根据该测试，将待研究的表面施涂到PVC管上，用新鲜血液测试前先用0.15MNaCl对该PVC管清洗15小时。

测试后测得的所接触血液中血小板数减少量表明了无涂层对照表面的血栓形成。血液中血小板数减少量的基本较低水平(例如接触涂层表面的血液在测试后的血小板数减少低于20％，优选低于15％，更优选低于10％)表明了根据本文所述方法制备的表面无血栓形成。

本领域技术人员可实施不同于血液循环模型的其它相似血液评估方法以评估血栓形成/无血栓形成。

可通过选择用于涂层的高支化分子的特定尺寸和数量来容易地控制和调节结合到特定表面区域的抗凝血实体量。

抗凝血实体在表面的分布可通过已知的常规染色技术测定，例如肝素分布可利用甲苯胺蓝测定。

涂层中的有益试剂

装置(特别是医疗装置)的涂层除了抗凝血实体以外，可包含一种或多种有益试剂。示例性有益试剂包括药物分子和润滑剂。有益试剂可引入到底层或外涂层。

有益试剂可通过共价连接结合到涂层，它可以是可降解的以允许有益试剂从聚合物表面上迁移(例如洗脱)，或者若需要长期作用时，可以是非降解的。或者，它们可不通过共价连接吸附到涂层表面上或结合到涂层表面(如，任何一层)中。

医疗装置中，除抗凝血实体以外，可适合地将药物分子结合到涂层的高支化分子(例如外涂层的高支化聚合物)上。在一个实施方式中，药物分子和涂层间的连接是可降解的共价连接以允许药物分子从聚合物表面迁移(如洗脱)。或者，药物可不通过共价连接吸附到涂层表面上或结合到涂层表面中。也可在涂层形成前将药物结合到高支化聚合物的空隙中。具体地，可将疏水性药物结合到高支化聚合物的疏水空隙中。其特殊应用是药物洗脱支架。可用于该实施方式的示例性药物包括预防再狭窄的药物，例如抗血管生成或抗增殖的药物，例如紫杉醇和西罗莫司。另一个应用是使用可洗脱的肝素或其它抗凝血实体。在另一个实施方式中，除抗凝血实体以外，可将抗微生物药物结合到涂层上。

有益试剂与涂层分子的共价结合可通过以下方式实现：将有益试剂通过官能端基共价结合到本文所述的阳离子高支化聚合物分子上，所述官能端基不涉及抗凝血实体的结合。这些官能端基可以是原始官能团(如伯胺)或可在结合有益试剂前改变官能团。可根据之前的描述用与抗凝血实体偶联相似的方式实施有益试剂偶联。

可在偶联抗凝血实体前将有益试剂偶联到本发明所述的高支化聚合物上，但更通常在之后偶联。

更通常地，装置(医疗装置)的涂层任选地包括至少一种选自以下物质的有益试剂：紫杉醇、紫杉烷或其它紫杉醇类似物；雌激素或雌激素衍生物；肝素或其它血栓抑制剂、水蛭素、二价水蛭素、腺苷三磷酸双磷酸酶、阿加曲班、D-苯丙氨酰基-L-聚-L-精氨酰氯甲基酮、或其它抗血栓形成试剂、或其混合物；尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂、或其它栓溶解剂、或其混合物；纤维蛋白溶解剂；血管痉挛抑制剂；钙通道阻断剂、硝酸盐、一氧化氮、一氧化氮促进剂或其它血管扩张剂；阿司匹林、噻氯匹定或其他抗血小板试剂；血管内皮生长因子(VEGF)或其类似物；秋水仙素或其它抗有丝分裂剂、或其他抗微管抑制剂；松胞菌素或其它肌动蛋白抑制剂；重塑抑制剂；脱氧核糖核酸、反义核苷或其它分子遗传介入试剂；细胞周期抑制剂(例如视网膜母细胞瘤肿瘤抑制基因的蛋白产物)、或其类似物GPIIb/IIIa、GPIb-IX或其它抑制剂或表面糖蛋白受体；甲氨蝶呤或其他抗代谢物或抗增殖剂；抗癌化疗剂；地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松醋酸盐或其他地塞米松衍生物、或其它抗炎症类固醇；前列腺素、前列环素或其类似物；免疫抑制剂(例如环胞菌素或雷帕霉素(也称为西罗莫司)及其类似物)；抗微生物剂(如选自下组的化合物：联脒、碘和碘载体、过氧化物、苯酚、二苯酚、卤苯酚、二胍、银化合物、三氯生、氯己定、三氯卡班、六氯酚、双溴丙脒、氯二甲酚、苯酚和甲酚或其组合物)抗生素、红霉素或万古霉素；多巴胺、甲磺酸溴隐亭,甲磺酸培高利特或其它多巴胺激动剂；或其它放疗剂；含碘化合物、含钡化合物、金、钽、铂、钨或其它用作造影剂的重金属；肽、蛋白、酶、胞外基质组分、细胞组分或其它生物试剂；卡托普利、依那普利或其它血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂；抗坏血酸、α生育酚、超氧化物歧化酶、去铁胺、21-氨基甾类(lasaroid)或其它自由基清除剂、铁螯合剂或抗氧化剂；血管肽素；¹⁴C-、³H-、¹³¹I-、³²P或³⁶S-放射性标记形式或上述任何其它放射性标记形式；或这些物质的任意混合物。

可将其它有益试剂结合到装置表面中，包括润滑剂，该润滑剂包括聚合物，例如含有极性或带电官能团的亲水性或水凝胶聚合物，该官能团可使它们溶于水中。这些试剂结合了对溶液中的水分子有亲和力的极性基团，并被广义地分类为水凝胶。除抗凝血实体以外，也可适当地将润滑剂结合到涂层上。在一个实施方式中，润滑剂和外涂层间的连接可以是共价连接。或者，润滑剂可以在无共价连接的情况下通过离子吸附或物理吸附到涂层表面上或结合到涂层表面中。润滑剂的示例是，但不限于：透明质酸、透明质酸衍生物、聚-N-乙烯基吡咯烷酮、聚-N-乙烯基吡咯烷酮衍生物、聚环氧乙烯、聚环氧乙烯衍生物、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯醇衍生物、聚丙烯酸、聚丙烯酸衍生物、硅、硅衍生物、多糖、多糖衍生物、磺化聚苯乙烯、磺化聚苯乙烯衍生物、聚烯丙胺、聚烯丙胺衍生物、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、聚噁唑啉、聚噁唑啉衍生物、多胺、多胺衍生物及其混合物。例如，这些有益试剂可与外涂层中的高支化聚合物分子共价结合。

当装置具有多个表面时，可将有益试剂结合到任何适于实现有益效果的表面。例如，可将有益试剂结合到管装置表面的内腔面和/或外腔面。当结合多于一种有益试剂时，可在相同表面或部分相同表面，或者不同表面或部分不同表面结合不同的有益试剂。

本发明所述装置在至少一些实施方式中具有一个或多个下列优点：

-可控制与最外层偶联的实体量；

-可实现实体(如肝素)的端点(单点)结合和多点结合，不过优选端点(尤其是还原端点)结合；

-可控制实体和高支化聚合物间的共价连接长度(连接子和间隔子)；

-可使用全长肝素，因此避免了肝素的切割从而优化了肝素原料的应用；

-使用全长肝素或通过间隔子连接的肝素可改善结合肝素的生物活性；

-可获得实体在外涂层上的均匀分布；

-可得到均匀涂层来掩蔽其本质特性，例如在不考虑制造材料的情况下降低装置的凝血特性；

-可得到相对光滑和/或润滑的涂层；

-可控制和改善抗凝血实体的生物可利用度；

-无血栓形成涂层不会沥滤肝素并因此具有很长的使用寿命；

-可得到老化时特性依然保持的涂层；

-可得到灭菌(例如用EO)时特性依然保持的涂层；

-由于能可逆形成各层间的离子相互作用，从而得到自修复性涂层；

-可通过用预先制备的组分来最大程度减少制备涂层的步骤数。

-可得到一种通过使用预先制备的组分的可靠制造方法；

-可在涂层形成方法中使用带有共价连接的肝素的预制备偶联物来制备涂层；

-可增强所制备涂层的生物相容性；

-本发明所述涂层可减少对全身肝素的需要，并降低接触活化的可能性；

-可得到同时具有润滑性和抗血栓性的医疗装置，这可有助于特定应用，例如神经血管的应用；

-可得到同时具有药物洗脱特性和抗血栓性的医疗装置，这可有助于特定应用，例如药物洗脱支架和药物洗脱气囊；

-可得到同时具有抗炎症特性和抗血栓性的医疗装置，这可有助于特定应用，例如心血管的应用；

-可得到具有改善的生物分子结合能力的分析或分离装置；且

-可得到具有延长的肝素活性寿命的分析或分离装置。

以下实施例示例性说明但不限制本方明。

实施例

所有Lupasol样品购自巴斯夫(BASF)。根据光散射测定WF(乙二胺核心)的平均分子量为25kDa。硫酸葡聚糖购自pK化学公司A/S(PKC)，PAMAM枝状聚合物(乙二胺核心)购自西格玛-艾尔德里奇公司和树突技术公司。PAMAM-G6.0-NH₂是PAMAM枝状聚合物(第6代)，分子量约为60kDa。PAMAM-G8.0-NH₂是PAMAM枝状聚合物(第8代)，分子量约为230kDa。PPIG5枝状聚合物(丁烷-1,4-二胺核心)购自阿尔得里奇公司(Aldrich)。PPIG5是分子量约为7kDa的枝状聚合物(第5代)。多胺EpominP-1050(乙二胺核心)购自日本触媒公司(NipponShokubai)，平均分子量为70kDa。多胺G-35购自武汉光明化学公司(WuhanBrightChemical)，平均分子量为70kDa。所有多胺母液为5wt％的水溶液。硫酸葡聚糖母液为6wt％的水溶液。然后可在使用前按需稀释该溶液。各方法步骤之间适当地用水清洗。

实施例标题

1.底层的制备

2.无血栓形成的涂层的制备，该涂层在外涂层中含有高支化聚合物

3.无血栓形成的涂层的制备，该涂层在外涂层中含有预制的肝素官能化高支化聚合物

4.衍生化的肝素实体

5.衍生化的高支化聚合物

6.肝素密度和血液血小板损失的评价

7.中间体的制备

8.亲水和润滑涂层的制备

9.药物洗脱涂层的制备

10.生物相容性的研究

经EO灭菌的含高支化聚合物的涂层的血液相容性

实施例1底层的制备

实施例1.1：含SN的底层的制备

用Larm等在EP-B-0086186和EP-495820中描述的方法(逐层进行；聚电解质电荷相互作用)预处理PVC表面，到硫酸化多糖层结束。

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SN，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以硫酸化多糖结束。

实施例1.2：含WF的底层的制备

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(WF，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以硫酸化多糖结束。

实施例1.3：含PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的底层的制备

根据实施例1.1，使用在MeOH中5wt％的PAMAM-G6.0-NH₂(1mL/L)涂覆已覆有金(QSX301,Q-Sense)的石英晶体微量天平(QuartzCrystalMicrobalance)(QCM)晶体，以获得由PAMAM-G6.0-NH₂和硫酸化多糖(6wt％在水中)的交替层组成的3个双层涂层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。金表面最初形成3个双层，以硫酸化多糖结束。

实施例1.4：含SK和用肝素官能化的PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的底层的制备

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SK，5wt％在水中，10分钟)和带负电荷的PAMAM-肝素偶联物(400mg/L，来自实施例5.2，20分钟)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和PAMAM-肝素偶联物称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以来自实施例5.2的PAMAM-肝素偶联物结束。

实施例1.5：使用WF和用肝素官能化的PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的底层的制备

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(WF，5wt％在水中，10分钟)和带负电荷的PAMAM-肝素偶联物(400mg/L，来自实施例5.2，20分钟)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和PAMAM-肝素偶联物称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以来自实施例5.2的PAMAM-肝素偶联物结束。

实施例1.6：含G-35的底层的制备

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(G-35，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以硫酸化多糖结束。

实施例1.7：使用SK的底层的制备

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SK，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以硫酸化多糖结束。

实施例1.8：使用EpominP-1050的底层的制备

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(EpominP-1050，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层，以硫酸化多糖结束。

实施例2无血栓形成的涂层的制备，该涂层在外涂层中含有高支化聚合物

实施例2.1：在含SN的底层上制备含WF的外涂层

用WF溶液(5wt％)在实施例1.1中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.2：在含WF的底层上制备含WF的外涂层

用WF溶液(5wt％)在实施例1.2中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.3：在含SN的底层上制备含PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用PAMAM-G6.0-NH₂溶液(5wt％)在实施例1.1中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.4：在含PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的底层上制备含PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用PAMAM-G6.0-NH₂溶液(5wt％)在实施例1.3中预先制备的涂层表面上吸附30分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.5：在含SN的底层上制备含G-35的外涂层

用G-35溶液(5wt％)在实施例1.1中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.6：在含G-35的底层上制备含G-35的外涂层

用G-35溶液(5wt％)在实施例1.6中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.7：在含SN的底层上制备含10wt％WF和90wt％SN的外涂层

用10wt％WF(5wt％溶液)和90wt％SN(5wt％溶液)的混合物在实施例1.1中预先制备的表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.8：在含SK的底层上制备含10wt％WF和90wt％SK的外涂层

用10wt％WF(5wt％溶液)和90wt％SK(5wt％溶液)的混合物在实施例1.7中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.9：在含SK的底层上制备含WF的外涂层

用WF溶液(5wt％)在实施例1.7中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.10：在含SN的底层上制备含EpominP-1050的外涂层

用EpominP-1050溶液(5wt％)在实施例1.1中预先制备的涂层表面上吸附10分钟，然后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的无血栓形成涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后评价其无血栓形成特性。

实施例2.11：在含SN的底层上制备含肝素化WF的外涂层

将WF(5wt％在水中)吸附到实施例1.1中基本描述的底层上，产生带正电荷的表面。随后利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(23.35mg/L)将肝素钠(325mg/L)偶联到带正电荷的层上，该反应在室温下持续60分钟后进行硼酸盐/磷酸盐冲洗以除去任何松散结合的肝素，然后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例2.12：在含SN的底层上制备含腺苷三磷酸双磷酸酶官能化的WF的外涂层

来自土豆的≥200单元/mg蛋白的腺苷三磷酸双磷酸酶购自西格玛-奥德里奇公司。通过用瑞典的Aminosyraanalyscentralen进行氨基酸分析来计算腺苷三磷酸双磷酸酶中的羧酸含量大约为每1摩尔腺苷三磷酸双磷酸酶有90摩尔COOH。无血栓形成试剂(例如腺苷三磷酸双磷酸酶)中的羧基可用于利用基本如实施例2.11所述的EDC或EDC样试剂将其与含胺的高支化聚合物连接。

实施例3无血栓形成的涂层的制备，该涂层在外涂层中含有预制的肝素官能化高支化聚合物

实施例3.1：在含SN的底层上制备含肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SN，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层和一层SN。将来自实施例5.2的肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物(150mg/L)在带正电荷的SN涂层上沉积1小时，然后实施硼酸盐/磷酸盐冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例3.2：在含SK,WF和肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的底层上制备含肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SK，5wt％在水中)和带负电荷的PAMAM-肝素偶联物(400mg/L，来自实施例5.2)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和PAMAM-肝素偶联物称为一个双层。PVC表面最初形成3个刚才所述的双层(见实施例1.4)，之后再加一层WF。将来自实施例5.2的肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物(400mg/L)在带正电荷的WF涂层上沉积20分钟，然后实施水冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例3.3：在含WF和肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的底层上制备含肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(WF，5wt％在水中)和带负电荷的PAMAM-肝素偶联物(400mg/L，来自实施例5.2)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和PAMAM-肝素偶联物称为一个双层。PVC表面最初形成3个刚才所述的双层(见实施例1.5)，之后再加一层WF。将来自实施例5.2的肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物(400mg/L)在带正电荷的WF涂层上沉积20分钟，然后实施水冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例3.4：在含SN的底层上制备含肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SN，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层和一层SN。将来自实施例5.2的肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物(425mg/L)在带正电荷的SN涂层上沉积1小时，然后实施硼酸盐/磷酸盐冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例3.5：在含SN的底层上制备含肝素官能化的WF的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SN，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层和一层SN。将来自实施例5.3的肝素官能化WF(425mg/L)在带正电荷的SN涂层上沉积1小时，然后实施硼酸盐/磷酸盐冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例3.6：在含SN的底层上制备含肝素官能化PAMAM-G8.0-NH₂枝状聚合物的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SN，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层和一层SN。将来自实施例5.6的肝素官能化PAMAM-G8.0-NH₂枝状聚合物(425mg/L)在带正电荷的SN涂层上沉积1小时，然后实施硼酸盐/磷酸盐冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例3.7：在含SN的底层上制备含肝素官能化PPIG5枝状聚合物的外涂层

用异丙醇和氧化剂清洗PVC管(I.D.3mm)的内腔表面。通过交替吸附带正电荷的多胺(SN，5wt％在水中)和带负电荷的硫酸化多糖(硫酸葡聚糖，6wt％在水中)形成最初层。用双官能醛(巴豆醛)对多胺进行交联。每对多胺和硫酸化多糖称为一个双层。PVC表面最初形成3个双层和一层SN。将来自实施例5.7的肝素官能化PPIG5枝状聚合物(425mg/L)在带正电荷的SN涂层上沉积1小时，然后实施硼酸盐/磷酸盐冲洗以除去任何松散结合的肝素偶联物，之后评价涂层的无血栓形成作用。

实施例4衍生化的肝素实体

实施例4.1：醛末端官能化肝素的制备

基本根据美国专利4,613,665实施例2制备醛官能化肝素。

实施例4.2：巯基末端官能化肝素的制备

将带醛基的亚硝酸降解肝素(基本按照US4,613,665实施例2制备)(5.00g,1.0mmol)、盐酸半胱胺(0.57g,5.0mmol)和氯化钠(0.6g)溶于纯水中。用1MNaOH(aq)和1MHCl(aq)将pH调节至6.0。向溶液中加入3.1ml的5％(aq)NaCNBH₃(0.16g,2.5mmol)，该反应在室温下搅拌过夜。用1MNaOH(aq)调节pH到11.0，采用SpectraPor透析膜(MWCO1kD,平面宽45mm)利用纯水对所得产物透析三天。然后浓缩该反应混合物并冷冻干燥，得到2.6g白色蓬松粉末。

实施例4.3：炔末端官能化肝素的制备

基本按照WO2010/029189的实施例3a制备炔官能化的经亚硝酸降解的肝素。

实施例4.4：炔末端官能化的天然肝素的制备

基本按照WO2010/029189的实施例3b制备炔官能化的天然肝素。

实施例4.5：叠氮末端官能化肝素和叠氮官能化天然肝素的制备

基本按照WO2010/029189的实施例4制备叠氮官能化的经亚硝酸降解的肝素和叠氮官能化的天然肝素。

实施例5衍生化的高支化聚合物

实施例5.1：炔官能化的PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的制备

制备3.75mgNHS活化的5-己烯酸/mLMeOH母液。见实施例7.1中NHS活化的烯的制备。

将2mL在MeOH中的5wt％PAMAM-G6.0-NH₂溶液加到1mL母液(3.75mgNHS活化的5-己烯酸)和9mLMeOH(0℃)中。让反应进行过夜。用旋转蒸发仪和真空烘箱蒸发该溶剂。用¹H和¹³CNMR测定所得材料的高纯度。得到2％的官能化程度(5-6烯/枝状聚合物)。

实施例5.2：保持特异活性的肝素官能化PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物的制备

将来自实施例4.1的醛末端官能化肝素(5.0g,0.56mmol)在剧烈搅拌下溶于15mL醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)中。向肝素溶液中加入2mL溶于MeOH中的5wt％PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物(乙二胺核心)(80.6mg,1.39μmol)溶液，然后加入10mL氰基硼氢化钠(2.5wt％在H₂O中)。将该溶液在室温下置于通风橱中搅拌过夜。将该溶液转移至透析袋(MWCO50,000Da)并充分透析。之后将透析袋内含物转移至圆底烧瓶并冻干过夜。烧瓶内含物干重830mg(大约60个肝素链/PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物或PAMAM-G6.0-NH₂中伯胺的23％官能化)。偶联物中结合PAMAM的肝素的特异活性经测定>100IU/mg。制备所用的肝素在偶联前的特异活性约为100IU/mg。

实施例5.3：保持特异活性的肝素官能化WF的制备

基本按照实施例5.2所述制备肝素官能化WF。

实施例5.4：叠氮官能化WF的制备

可基本根据WO2010/029189中实施例2a所述的SN制备方法来制备叠氮官能化WF。

实施例5.5：炔官能化WF的制备

可基本根据WO2010/029189中实施例2b所述的SN制备方法来制备炔官能化WF。

实施例5.6：保持特异活性的肝素官能化PAMAM-G8.0-NH₂枝状聚合物的制备

基本按照实施例5.2所述内容制备肝素官能化PAMAM-G8.0-NH₂。

实施例5.7：保持特异活性的肝素官能化PPIG5枝状聚合物的制备

基本按照实施例5.2所述内容制备肝素官能化PPIG5枝状聚合物。

实施例5.8：官能化高支化聚合物的制备

本领域技术人员可制备具有选自表3的化学基团或官能团(官能团1和官能团2)的高支化聚合物。

本领域技术人员可制备具有选自表3的化学基团或官能团(官能团1和官能团2)的无血栓形成实体(如肝素)。

本领域技术人员可将官能化的高支化聚合物与官能化的无血栓形成实体(如肝素)反应以得到用无血栓形成实体(如肝素)衍生化的高支化聚合物。

实施例6肝素密度和血液血小板损失的评价

肝素密度测试(用于测定涂层中的肝素含量)

基本按照SmithR.L.和GilkersonE(1979),Anal.Biochem.,98,478-480中描述的方法进行表面固定肝素的定量分析。

甲苯胺蓝染色测试(用于评价肝素分布)

用甲苯胺蓝染色溶液评价肝素分布。通过在1L水中溶解200mg甲苯胺蓝来制备该溶液。用染色溶液对样品处理2分钟后用大量水冲洗。蓝/紫色的染色表明带负电荷的肝素分子均匀分布在如图9平板B中举例的外涂层中。

血液循环评价测试(用于测定血小板损失)

在刚涂覆的样品中进行血液循环评价以显示无血栓形成表面上保持的肝素生物活性。首先用0.15MNaCl以1mL/分钟的流速对涂层管的内腔面清洗15小时，以确保所有松散结合的肝素被冲洗下来而留下稳定的表面。然后基本根据Andersson等(Andersson,J.；Sanchez,J.；Ekdahl,K.N.；Elgue,G.；Nilsson,B.；Larsson,R.JBiomedMaterResA2003,67(2),458-466)在Chandler血液循环模型中以20rpm孵育清洗的管子。在细胞计数器中对来自新鲜血液和来自从循环中采集的血液的血小板计数，以测定表明血栓形成的血小板损失。

实施例6.1：用肝素密度和血小板损失表示接触血液后无血栓形成表面的涂层特性

^a2个数值的平均值

^b是表示蓝/紫色染色，否表示根本未染色

^c预制备的肝素高支化偶联物的沉积

*PS＝多糖

**N/A＝不适用

***N/T＝未测试

将血液接触无血栓形成的表面涂层后存在的血小板数计算成血液接触无血栓形成的表面涂层前存在的血小板数的百分比，各样品的图示于附图8中。

如上述表格和图8所示，在所测的含肝素涂层中未实际观察到血小板损失(血小板损失表示血栓形成)。在这次实验中，无涂层PVC管和具有硫酸化多糖外层的表面(“凝血对照”)表明显著的血栓形成。

实施例6.2：使用甲苯胺蓝对无血栓形成表面染色

用甲苯胺蓝染色溶液(200mg/L在水中)对来自实施例2.2的管子进行处理，在该溶液中浸没2分钟后用大量水冲洗。在管子的内腔面表面观察到蓝/紫色，这表明了末端官能化的肝素的共价结合。

实施例6.3：使用甲苯胺蓝对无血栓形成表面染色

用甲苯胺蓝染色溶液(200mg/L在水中)对来自实施例3.2的管子进行处理，在该溶液中浸没2分钟后用大量水冲洗。在管子的内腔面表面观察到蓝/紫色，这表明了PAMAM-肝素偶联物中末端官能化的肝素的共价结合。PVC管的内腔表面染色可参见图9。

实施例6.4：使用甲苯胺蓝对无血栓形成表面染色

用甲苯胺蓝染色溶液(200mg/L在水中)对来自实施例3.3的管子进行处理，在该溶液中浸没2分钟后用大量水冲洗。在管子的内腔面表面观察到蓝/紫色，这表明了PAMAM-肝素偶联物中末端官能化的肝素的共价结合。

实施例7中间体的制备

实施例7.1：NHS活化的5-己烯酸的合成

将己烯酸(1.00g,8.76mmol)和羟基琥珀酰亚胺(1.01g,8.76mmol)溶于10mL的DCM中并在0℃下搅拌。在0℃下将DCM中的DCC(1.81g,8.76mmol)溶液(3mL)缓慢逐滴加入反应混合物。搅拌过夜进行该反应，之后滤除副产物，用旋转蒸发器浓缩剩余溶液并在烘箱中真空干燥。用¹H和¹³CNMR测定所得材料的高纯度。

实施例8亲水和润滑涂层的制备

实施例8.1：含有 SK和 WF的亲水和润滑涂层

根据实施例1.7用SK涂覆QCM晶体以获得3个交替地由SK和硫酸化多糖层组成的双涂层。然后将WF层吸附到硫酸化多糖上以获得具有作为最外层的阳离子高支化聚合物的涂层。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用接触角(CA)测定试验分析这些涂层。53.0°的静态接触角(两个样品的均值)表示得到了亲水和润滑涂层。

实施例8.2：含有SK、WF和肝素的亲水和润滑涂层

根据实施例1.7用SK涂覆QCM晶体以获得3个交替地由SK和硫酸化多糖层组成的双涂层。然后将WF层吸附到硫酸化多糖上，之后利用还原剂(氰基硼氢化钠，2.5wt％在水中)对实施例4.1中经亚硝酸降解的肝素(325mg/L)实施1小时的偶联步骤。在各吸附步骤间用水冲洗2分钟。用硼酸盐/磷酸盐溶液处理制备的润滑涂层以除去任何可能离子结合的肝素，然后用接触角(CA)测定评价。23.5°的静态接触角(两个样品的均值)表示得到了亲水和润滑涂层。

实施例9药物洗脱涂层的制备

实施例9.1：将多柔比星引入肝素化涂层

将多柔比星结合到QCM晶体上的涂层中，基本根据实施例2.3所述内容通过将QCM晶体放置在多柔比星的水溶液(1mg/25mL的水)中制备。加载步骤后用水仔细冲洗药物加载涂层，之后对该涂层进行荧光评价。荧光评价前先在真空烘箱中干燥该晶体。可检测到强烈的红色荧光，这表示已经将多柔比星成功结合到该涂层中。

实施例9.2：向含有肝素化的PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物、SK和WF的涂层中结合多柔比星然后释放

将多柔比星结合到QCM晶体上的涂层中，基本根据实施例3.2所述内容通过将QCM晶体放置在多柔比星的水溶液(1mg/25mL的水)中制备。加载步骤后用水仔细冲洗药物加载涂层，之后对该涂层进行荧光评价。荧光评价前先在真空烘箱中干燥该晶体。可检测到强烈的红色荧光，这表示已经将多柔比星成功结合到该涂层中。用2MNaCl溶液处理加载有药物的涂层，最后用水冲洗，接着在真空烘箱中干燥，之后进行额外的荧光显微评价。无红色荧光表示多柔比星已从涂层上洗脱。

实施例9.3：向含有肝素化的PAMAM-G6.0-NH₂枝状聚合物和WF的涂层中结合多柔比星然后释放

可将多柔比星结合到QCM晶体中，基本上根据实施例3.3通过将QCM晶体放置在多柔比星的水溶液(1mg/25mL的水)中制备，接着用水仔细冲洗加载有药物的涂层，之后对该涂层做荧光评价。强烈的红色荧光表示已经将多柔比星成功结合到该涂层中。用2MNaCl溶液处理加载有药物的涂层，接着在真空烘箱中干燥，之后进行额外的荧光显微评价。无红色荧光表示多柔比星已从涂层上洗脱。

实施例10：生物相容性研究

HDPE(高密度聚乙烯)上的生物相容性表面的制备

用异丙醇和氧化方法清洗HDPE片(30cm²,USP参比标准)。然后根据实施例1在该片材上初始涂覆3个双层，以硫酸化多糖结束。初始层根据实施例2与高支化多胺反应，在之后的偶联步骤中与官能化肝素结合或根据实施例3先与多胺层结合再与带净负电荷的肝素官能化高支化聚合物结合。通过将该材料浸没在涂覆溶液中进行涂覆。利用ISO10993所述的极限必需培养基(MEM)洗脱测试发现该涂层在细胞毒性测试中为无毒性(见实施例10.1)。

这些结果证实所评价的表面具有无毒性的生物相容特性。

实施例10.1：生物相容性表

*PS＝多糖

^a预制备的肝素高支化偶联物的沉积

实施例11：经EO灭菌的含高支化聚合物的涂层的血液相容性

EO灭菌

根据实施例2或3所述制备的在外涂层中含有肝素官能化高支化聚合物的不同涂层基材通过与环氧乙烯(EO)接触来灭菌。通过用于医疗装置的标准灭菌方法来进行EO灭菌。

血液循环评价测试(用于测定血小板损失)

基本根据Andersson等(Andersson,J.；Sanchez,J.；Ekdahl,K.N.；Elgue,G.；Nilsson,B.；Larsson,R.JBiomedMaterResA2003,67(2),458-466)在Chandler血液循环模型中对经过EO灭菌和清洗的管子进行孵育，参见实施例6。

如下表所示，在用根据实施例2和3制备的高支化肝素偶联物制备的EO灭菌的肝素涂层中，并未实际发现血小板损失(血小板损失表示血栓形成)。在这次实验中，无涂层PVC管和凝血对照(外层硫酸化多糖未结合抗凝血酶的表面)显示显著的血栓形成。

实施例11.1EO灭菌后用血液血小板损失表示的涂层稳定性的呈现

*PS＝多糖**N/T＝未测试***N/A＝不适用

^a预制备的肝素高支化偶联物的沉积

这些结果证实根据本发明制备的稳定表面即使暴露在严苛灭菌条件下也能保持无血栓形成特性。

除非上下文另有要求，否则，在本说明书和所附权利要求书中，词语"包括"和其变体如"包含"和"含有"应理解为包括所指的整数、步骤、多个整数的组或多个步骤的组的意思，但并不表示排除任何其他整数、步骤、多个整数的组或多个步骤的组。

本发明说明书中提及的所有专利和专利申请通过引用全部纳入本文。

本发明包含所有上述优选和更优选的各组、适合和更适合的各组、以及各组实施方式的组合。

Claims

1.一种具有以下特征的阳离子高支化聚合物分子：(i)具有分子量为14-1,000Da的核心部分，(ii)总分子量为1,500-1,000,000Da，(iii)总分子量与核心部分分子量的比例至少为80:1，并且(iv)具有官能端基，从而一个或多个所述官能端基与抗凝血实体共价结合。

2.如权利要求1所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述抗凝血实体是肝素部分。

3.如权利要求2所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述肝素部分是全长(天然)肝素。

4.如权利要求2所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述肝素部分是经亚硝酸降解的肝素。

5.如权利要求1-4中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述肝素部分与所述高支化聚合物分子单点结合。

6.如权利要求1-5中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述肝素部分与高支化聚合物分子通过所述肝素部分的还原端结合。

7.如权利要求1-6中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述官能端基是伯胺基团。

8.如权利要求1-7中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述高支化聚合物具有作为核心部分的乙二胺。

9.如权利要求1-8中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述高支化聚合物是枝状聚合物。

10.权利要求9所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述枝状聚合物是PAMAM枝状聚合物。

11.如权利要求1-10中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述高支化聚合物的分子量为25,000-200,000Da。

12.如权利要求1-11中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述高支化聚合物的总分子量与核心部分分子量的比例在200:1-5000:1之间，例如200:1-1600:1之间。

13.如权利要求1-12中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述高支化聚合物分子带净正电荷。

14.如权利要求1-13中任一项所述的阳离子高支化聚合物分子，其特征在于，所述高支化聚合物分子带净负电荷。