CN103620376A - 用于观察样品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于观察样品的方法，所述方法包括以下步骤：a）提供基本上透明的介质形成的物体（G，V），所述介质具有第一折射率（n_int）且包括凸形、圆形或多平面的第一表面（S1）和基本上平坦的第二表面（S2），所述第一表面将所述物体与周围介质（MA）分离开，所述周围介质具有低于所述第一折射率的第二折射率（n_ext），待观察的所述样品包括在所述物体内或沉积在所述第一表面上；b）通过所述基本上平坦的第二表面观察所述样品；以及c）通过在所述步骤b）期间检测与所述物体相对应的光环，确定所述样品中的物质或对象的存在。

Description

用于观察样品的方法

技术领域

本发明涉及一种用于观察样品的方法，尤其用于生物或化学应用，例如，用于检测微生物或对微生物计数以及研究化学反应的动力学。

背景技术

根据优选实施方式的方法基于使用包含待观察样品的微滴或所述样品本身。由A B Theberge等所著的文章“Microdroplets in Microfluidics:An EvolvingPlatform for Discoveries in Chemistry and Biology”（Angew Chem Int Ed2010，49，5846–5868）综述了用于化学和生物学中的各种应用中的基于使用液态微滴的微流体技术。术语“微滴”指直径（或通常为主要尺寸）的范围为1μm至100μm的液滴。

文献US2005/0221339描述了一种用于对在微流体系统中操作的微滴中的化学成分进行光学检测的方法。

由B Rotman所著的文章“Measurement of activity of single molecules ofβ-D-Galactosidase”，美国国家科学院院刊（Proceedings of the Natl Acad SciUSA），1961，47，第1981-1991页，描述了一种用于检测酶的分离的分子的方法。在该方法中，包含酶（高度稀释的）和用于该酶的荧光基质的水溶液被喷到在两个显微镜用载玻片之间限定的小体积的硅酮油中。考虑到该硅酮油密度小于水且不与水混溶，该溶液形成置于下显微镜用载玻片的上表面上的微滴。然后，借助显微镜，通过显微荧光测定对液滴进行分析。包括该酶的至少一个分子的液滴显现为发光盘，而不包含所述分子的液滴显现为发光环的形式。

这种方法的主要限制在于由荧光发出的光的强度低。当液滴中包含的微观尺寸的对象对光的散射（弹性散射或拉曼散射）被观察到时，出现类似的问题。

发明内容

本发明的目的是通过提出一种用于观察样品的配置克服这种限制，这种配置提高了由样品发出或散射的光的收集效率。然而，本发明不限于使用液滴，而包括液滴由固体介质或凝胶形成的物体代替的情况。

因此，在一方面，本发明提供了一种用于观察样品的方法，所述方法包括以下步骤：

a）提供基本上透明的介质的物体，所述基本上透明的介质具有第一折射率n_int且具有凸形、圆形或多平面的第一表面和基本上平坦的第二表面，所述第一表面将所述物体与周围介质分离开，所述周围介质具有第二折射率n_ext，待观察的所述样品由所述物体构成或位于所述物体内或沉积在所述第一表面上；以及

b）观察所述样品；

其特征在于：

-在步骤b）期间，通过所述基本上平坦的第二表面观察所述样品；以及

-所述第二折射率低于所述第一折射率。

所述方法可以包括步骤c），所述步骤c）用于根据在步骤b）期间观察所述样品的结果来确定所述样品中的物质或对象的存在。尤其是，对象可以是生物物种，如微生物，例如，细菌、酵母、真菌、病毒等。例如，待检测的物质可以溶解或分散在透明或半透明的介质中。

样品可以是液态的，例如，生物液体、离子性液体、水溶液或凝胶。在凝胶的情况下，例如，粘度可以在1cP（厘泊）至1000cP范围内，即，在10^-3Pa·s至1Pa·s范围内。

将在下面更详细地描述，周围介质的折射率低于所述物体的折射率确保沿着凸形的所述第一表面（“光碗”）部分地导引由所述样品发射或散射的光，这提高了在平坦的第二表面这一侧上的光的检测效率。与此相反，在现有技术（尤其参见上面引用的B Rotman的文章）中，通常使用具有较高的光学折射率的油中的水溶液的“反相乳液”，和/或通过凸面观察样品。

通常，该物体的直径或主要尺寸可以在1μm至1mm范围内，优选在10μm至500μm的范围内。

根据本发明的各种实施方式：

-所述物体可以是基本上半球形的形状。这实际是使由样品发射或散射的光的收集最大化的几何形状；

-所述物体可以是液滴，所述液滴附着到透明基板上而形成所述基本上平坦的第二表面；

-所述步骤a）可以包括产生形成多个所述物体的多个液滴，所述多个液滴中的至少一些液滴包括至少一个待检测的对象或物质；以及所述步骤b）可包括同时观察多个所述液滴；

-与此相反，所述物体可以是固体，在这种情况下，所述样品可以由沉积在所述物体的第一表面上的层构成。有利地，所述层可以是对分析物敏感的官能化层，所述分析物可能包括在所述周围介质中。当所述物体是固体时，所述样品还可以是放置成与所述物体的第一表面接触的液态或粘性的样品；

-所述物体可以由对分析物敏感的材料形成，所述分析物可能包括在所述周围介质中；

-所述周围介质可以是空气；

-所述步骤b）可以包括照射所述物体的操作。优选地，所述照射可以通过所述基本上平坦的第二表面进行，以使其进而可以从上述的光导引效应受益。在不同的变型中：

-所述步骤b）可以包括检测光信号，例如，荧光信号。在这种情况下，所述步骤b）可以通过落射荧光显微术进行；

-所述步骤b）可以包括检测拉曼散射信号；

-所述步骤b）可以通过反射显微术或透射显微术进行。

附图说明

根据结合附图进行的示例性描述，本发明的其它特征、细节和优点将变得清楚，这些附图分别表示：

-图1示出在液滴和具有较低折射率的周围介质（如空气）之间的界面处传播的各种光线路径；

-图2A和图2B示出从液滴的位于所述界面附近的位置获得的光线样式；

-图3是示出在穿过光源且垂直于所述第二表面的平面中，在该液滴的边缘附近进入该液滴的光的范围的光线样式；

-图4A和图4B示出上文所引用的由B Rotman所著文章中描述的观察设置的两个光线样式；

-图5是示出本发明的优点的对比试验；

-图6示出用于实施根据本发明的方法的实验装置；

-图7A和图7B分别示出根据本发明的第一实施方式的方法的示意图和使用该方法获得的图像；

-图8A和图8B分别示出根据本发明的第二实施方式的方法的示意图和使用该方法获得的图像；

-图9A和图9B分别示出根据本发明的第三实施方式的方法的示意图、使用该方法获得的图像以及这样的图像的细节；

-图10是用于根据本发明的第四实施方式的方法的示意图；

-图11是用于根据本发明的第五实施方式的方法的示意图；以及

-图12A至图12D示出物体形状相对于半球的偏差的结果。

具体实施方式

图1示出本发明所基于的物理现象。考虑（实际）折射率为n_int的液滴G浸在（实际）折射率为n_ext<n_int的周围介质MA中。在水滴在空气中的情况下，n_int=1.33<n_ext=1。

根据表面张力效应，液滴呈现为直径为R的基本上球形或截球形的形状，如果R为约几微米，由重力引起的变形在实际中可以忽略。

图1示出在液滴G内传播的三条光线R1、R2和R3，且这三条光线分别以入射角θ₁、θ₂和θ₃触及液滴表面S1。通常，入射角被定义为光线与表面的法线之间所形成的角。

所有以大于临界角θ_c（由

给出，）的入射角触及表面S1的光线发生全反射，且保持留在液滴内部。在图1的示例中，光线R1（其中，θ₁=θ_c）和光线R2（其中，θ₂>θ_c）就是这种情况，而由于θ₃<θ_c，光线R3离开液滴。

简单的几何推理可以证明发生全反射的光线保持局限在液滴表面S1附近，且距离液滴的中心的距离不能小于距离

为了理解这种效果如何能够有助于对对象（如微生物或荧光分子）进行观察，考虑在图2中所示的情况，其示出了附着到透明支持体SS且浸在介质MA(如，空气)中的半球状液滴G。和前面的情况一样，n_ext<n_int，基板的折射率n_SS可以小于n_int或大于n_int；优选地，n_SS不会太高（例如，小于2n_int或等于2n_int），以使基板本身不封堵光线。光线由位于靠近液滴的半球形表面S1的位置处的荧光分子发出（S2表示与基板的接触面）。可以看出，这些光线相当大部分由空气-水界面导向成呈“光碗”BL的形状的层。这些光线在平坦表面S2的包括在内半径

和外半径R之间的环形形状的区域（其也可被称作圆环）中离开液滴。可以理解，这提高了光收集效率。光碗BL（其也可由术语球形包络表示）的厚度等于R-r。

为了确定导向成光碗的光束的角度范围，图2B涉及穿过位于与中心C距离为r_P的位置处的固定点P的光线。如果r_P满足条件r<r_P<R，那么，可以示出，存在两条光线RL1和RL2，光线RL1和光线RL2以入射临界角θ_c接触圆S1，且光线RL1和光线RL2的标记为RP的平分线与CP正交。在RP和RL1或RL2之间的角度θ_NA满足

即，

在光学几何方面，这表明在物体G内部，由通过P的光线所形成的光束具有主光线RP（垂直于CP）和孔径角θ_NA。θ_NA的极限值为：0（当r_P=r时）和θ_NAMax=90°-θ_c（当r_P=R时）。因此，光束在环边缘具有最大数值孔径。

图3示出相反情况，其中，光源SL通过基板SS照射液滴G。优选地，在光源SL和透明基板SS之间没有遮罩的情况下照射。此外，在“暗场”设置下基板SS和液滴G未被照射。在该图中，从平坦表面S2经由上述环形区域穿入液滴的光线保持留在“光碗”BL中。与不发生光封堵相比，位于该“碗”内部的样品或样品的一部分被更有效地照射。

限制光线的该效果取决于条件n_ext<n_int，这可在图4A和图4B中看到，图4A和图4B涉及其中n’_ext>n’_int这一相反情况（水滴G’（n_int’≈1.33）在硅酮油浴MA’（n_ext’≈1.44）中的情况）。在这些图中可以看出，在这种情况下，无论是由外部源SL发射的光线还是从液滴表面上的位置所获得的光线都不被封堵。

图5可用于将本发明的观察配置（C1）与两个其他配置进行比较，这两个配置为：液滴被挤压在下显微镜用载玻片和上盖玻片之间（C2），和液滴置于载玻片上并从液滴的凸面侧观察液滴（C3）。在所有情况下，液滴由5μM的荧光团4MU（4-甲基伞形酮）的水溶液构成。通过落射荧光显微术（即，利用激发和从顶部检测）来观察液滴。可以看出，本发明的配置C1可用于观察到非常明亮的环，而在其它配置中，荧光液滴呈现为在背景下很难看到的亮度非常低的盘。实验测量表明，与Rotman使用的“水在油中”配置相比，本发明的配置可以使收集的光量提高20倍。术语“光量”是指在整个滴（包括明亮环和暗得多的中心区域）上测量的光量。相比之下，如果仅考虑半径在和R之间的范围内的环形光线中发出的光，则增量甚至可以达到70倍。

半球状液滴是最优情况，但即使表面S1偏离该标称形状，限制效应仍然存在。为了量化可接受的偏离，首先必须考虑表面S1可能并不精确地为球体的一部分，其次考虑通常为球形的物体G可能并不恰好在中间被截断或由完全平坦的表面截断。

在图12A中可以看出，在S1的每个点P1，法线N1限定为朝向液滴的内部取向（从MA到G）。将相对于中心为C的球体的角度偏差定义为如下：θ_1，err(P1，C)，其为N1和直线（P1，C）之间的角度。最适于S1的球面中心为点C1，点C1最小化

（角度未被定向，因此其值总为正）。一旦已找到该点（被称为S1的角中心），最大角度偏差θ_1，errMax被定义为在整个表面S1上的P1的θ_1，err(P1，C)的最大值。

将光限制在本发明所应用的液滴的边缘处的效应的程度取决于“光碗”的相对厚度，相对厚度为

在球形表面的情况下：

优选地，为了保持在光学几何区域，光碗的厚度必须大于光的波长λ。换句话说，优选地，R-r≥λ。对于波长λ为500nm，且假设n_ext=1.33（水的折射率），n=1（空气的折射率），该条件导致R≥2μm。此外，在通常情况下，液滴G的直径将大于2μm，甚至大于4μm。

如图12B所示，在表面S1并不为上文所述的完全地球形的情况下，用于全反射的限制光线Rlim在角构成的最坏情况下，将与线段[P1，C1]成角度(θ_c+θ_errMax)。在该设置下，光碗的相对厚度为

使用对应于空气中水滴的数值（n_int/n_ext=4/3，即，θ_c=48.6°），将发现，θ_errMax=4.5°，对应于环宽度相对减小20％。如果能接受环宽度相对减小50%，则能够接受S1相对于球体的角度偏差达12.5°。

如图12C，标记为θ_cont的（S1和S2之间的）接触角不是90°意味着限制于光碗中的光束的主光线（RP）在通过S2时不再垂直于该表面。定义公差的标准为，观察系统的整个数值孔径（图12D中阴影所示的峰值半角锥θ_cont）被包括在引导光束的孔径角中，该孔径角由RL1和RL2限定。仅考虑折射率为n_int的介质，对于n_int/n_ext=4/3（水-空气对），引导光束的孔径角为θ_NAMax=(90°-θ_c)，即，为41.4°。对于包括在RL1和RL2之间的阴影三角形，则|90°-θ_cont|<θ_NAMax-θ_obs是必要的。对于具有典型的数值孔径NA=0.5的显微镜物镜所收集的光，在折射率为n_int的介质中，孔径角θ_obs为22°（NA=n_intsinθ_obs）。利用该可视化系统且对于n_int/n_ext=4/3，θ_cont在70°至110°的范围内。

液滴G可以由大体圆形的固体或凝胶的凸体代替。在这些情况下，表面S2可以包括小平面（数目足够大，示例性值为至少10，优选为20或更大，以能够量化作为“大体圆形”的表面）。

周围介质并不必须是空气，但是空气这种选择是有利的，这是因为空气可以用来最大化n_int-n_ext的差值。事实上，随着折射率之间的差值增大，优选地，n_int≥1.1×n_ext，光限制效应的效率增大。

图6示出用于实施本发明方法的实验装置。

基板SS为170μm厚的盖玻片，其被硅烷化以具有疏水性。包含待检测对象或物质（微生物、在溶液中的荧光分子等）的水溶液被喷到该盖玻片上，形成半径为几μm（例如2μm或4μm）至200微米（即，体积约为1pL至10nL）的液滴。由于对表面进行了疏水化处理，这些液滴的接触角的范围为92°至96°（理想的半球状情况对应于90°的接触角）。计算机模拟已经能够示出，重力不会使液滴变形，与盖玻片的取向无关。

应当注意，为了形成液滴，可以使用一些与简单的喷洒不同的技术，尤其是液滴要单分散时。可以提到的示例有：通过点样法沉积，即，通过使用微量吸移管（如，可以由自动装置控制的压电式的微量吸移管）沉积液滴（或多个液滴）；通过分散法沉积；或如文献US6391578中所描述的通过微结构化亲水/疏水区进行沉积。凝胶滴可以使用文献WO82/02562中描述的技术进行沉积，其中，悬浮液在液体状态下被分馏，然后被凝胶化。

还可以设想使用一个或多个意欲填充液体样品或凝胶化样品的半球形杯。在这种情况下，杯的折射率小于其意欲包含的样品的折射率。例如，在该配置中，样品可以是折射率通常大于1.4的离子液体。因此，构成该杯的材料可以为折射率小于1.4且以基本上半球形的杯的中空块的形式的聚合物，或实际为薄的热成型膜。在这两种情况下，杯子可以通过附接形成表面SS的透明盖而密封。

喷洒后，使盖玻片SS在借助双面胶带RDF形成的框架上翻转过来，该框架例如为“基因框架”类型（250μm厚），且其已置于另一盖玻片L上。然后，胶带在盖玻片SS和盖玻片S之间形成壁。因此，形成薄的密封腔，其防止液滴蒸发。加热装置MC用来将该腔维持在恒定温度37°下，且组件被安装在机动化的台板PM上。显微镜MS用来从上盖玻片SS这一侧观察液滴。优选地，由样品所产生的光的照射和收集从相对于盖玻片SS的同一侧进行。因此，样品的照射也可以受益于“光碗”中的限制效果，但这不是必须的。

可以使用包括物镜LO（例如：放大倍数10，数值孔径0.5）和用于图像采集的照相机CM的成像系统进行观察。在图6中，附图标记SO通常表示成像系统的其它元件（照明装置、分色镜、滤波器等），其为可变的并取决于所采用的观察技术。事实上，本发明的原理可以应用到一些不同的观察技术，将在下文结合图7A至图12更详细地描述这一点。显然地，该实施方式列表并不详尽。为简单起见，图7A至图12未示出光学系统或用于实施该方法所使用的图像学。

图7A以高度图解的方式示出本发明的方法应用至通过落射荧光显微技术检测液滴中的荧光团。波长为λ₁的激发光由光源SL（通常是配备有滤波器的汞灯或卤素灯）发出，经由液滴G的附着到基板SS的表面S2被射入液滴G中。部分被限制在“光碗”BL中的该光诱导荧光团的荧光性，荧光团发出波长为λ₂>λ₁的辐射。从图7B中可以看出，荧光辐射离开液滴和基板，部分地聚集在发光环中。应当注意，光碗外的荧光团分子对照相机CM检测到的信号起到的效用较小，这是由于其暴露在强度较低的激发光的通量中，并且其发射的光子没有被限制在发光环内。“光碗”所占据液滴体积的部分随着比率n_int/n_ext的幅度的增大而增大。

图7B的图像是通过以λ₁=360nm的波长激发荧光团4MU在MOPS缓冲液（3-(N-吗啉代)丙磺酸）中的溶液而获得的。通过以λ₂=450nm为中心的滤波器分离荧光辐射。

在变型中，可以经由表面S1照射液滴，这导致液滴在空间上更均匀的激发，从而损害将激发束限定在光碗中的效应。在这种情况下，不再可以使用术语“落射荧光”。

图7A和图7B的观察方法尤其可以应用于化学反应或生化反应的动力学研究。

图8A和图8B涉及仍然使用落射荧光显微术原理对微观尺寸的荧光对象E（如细菌，在适当的情况下，转基因的细菌）进行观察的情况。如果对象E的密度比形成液滴的液体的密度大，其将朝着液滴的底端下落，随后将其自身定位在“光碗”内。因此，将激发光限制在表面S1附近被证实是特别有利的。图8B示出其中对象E发出的光辐射通过液滴/周围介质的界面而聚集并且引导的环以及由之前不被表面S1反射而是穿过基板的“直接”辐射所形成的所述对象的图像。

在该图8B的情况下，对象E是包括MUG(4MU葡萄糖醛酸酯)的生长培养基中的转基因的大肠埃希氏杆菌细菌。在λ₁=557nm（激发波长）和λ₂=579nm（荧光波长）下进行观察。

根据图8A和图8B的观察方法可应用于对接种到溶液中的细菌进行计数，该溶液如上述喷洒以在显微镜用载玻片上形成一系列液滴，细菌以随机方式分布在液滴中。该溶液可以包括参考荧光团，例如FITC（异硫氰酸荧光素），其意味可以对液滴进行计数、估算它们的体积，以及对来自细菌的荧光信号进行归一化以消除仪器漂移。

使用大肠埃希氏杆菌ATCC11775（其为β-葡萄糖苷酸酶阳性的菌株）的菌株测试该方法。葡萄糖苷酸酶的酶活性可用于降解荧光基质MUG，这导致荧光团4MU的释放。接种有这些细菌的水溶液为包含MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）、荧光基质MUG和作为参考荧光团的FITC的缓冲液。该介质的组成如下：

-150mM的MOPS（4-吗啉代丙磺酸，钠盐）；

-2.6mM的硫酸镁；

-854μM的葡萄糖醛酸钠；

-870μM的甲基β-d-葡糖苷酸；

-113μM的MUG（4-甲基伞形酮-β-d-葡糖苷酸）；

-4.15μM的荧光素。

使用具有物镜（针对载片厚度对其进行校正，x10，NA0.5）的Zeiss的Axiolmager显微镜对液滴进行观察。MUG作为每个细菌的标记，这是由于包括至少一个细菌的液滴中产生4MU荧光团。荧光团FITC作为每个液滴的标记，这是由于每个液滴发出FITC的光，而不取决于细菌的存在。

由于荧光团4MU由细菌的新陈代谢产生，故其荧光信号随时间而增强。此外，该缓冲液包括给定浓度的荧光团FITC，其在整个测量中保持不变：因此，来自FITC的荧光信号为恒定的，且可以用作参考信号。

在观察期间：

-交替地以FITC荧光团激发波长和4MU荧光团激发波长激发样品（待完成）；

-交替地记录对应于FITC的发射波长的图像和对应于荧光团4MU的发射波长的图像；

-在每个FITC发射图像上定位全部发荧光的液滴，每个液滴在图像上产生环。每个环限定对应于每个液滴的所关注的空间区域。另一方面，可以测量给定图像的每个环的外半径Rext，使用以下表达式表示该半径与每个液滴的体积的关系：

$V(R_{\mathrm{ext}},{\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{cont}})=\frac{\mathrm{\&pi;}}{3}{\left(\frac{R_{\mathrm{ext}}}{\sin \left({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{cont}}\right)}\right)}^3(2-3\cos \left({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{cont}}\right)+{\cos }^3\left({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{cont}}\right))$

其中：

-θ_cont=液滴在盖玻片SS上的接触角；

-R_ext=发光环的外直径。

所关注的预限定的空间区域用在每个4MU荧光团发射图像上。确定来自构成每个所关注的空间区域的像素的信号的平均强度，该平均强度为每个液滴产生的信号的平均强度。可选地，在荧光团4MU的发射波长下每个液滴所产生的信号的平均强度可以通过在FITC的发射波长下对应于同一液滴的信号的平均强度归一化。通过对强度或归一化强度定阈值，确定包括至少一个细菌的液滴，定阈值允许关于液滴中存在或不存在至少一个细菌做决定。

通过应用泊松定律，可以确定最初溶液（即，以液滴形式分散的溶液）中的最可能的细菌浓度（CPP）。

可以证明：

-Vj为每个被至少一个细菌占据的液滴j的单元体积；

-Vi为通过FITC荧光观察的每个液滴i的单元体积；

-CPP为初始溶液中最可能的细菌浓度。该浓度的大小为体积的反演计算。在试验中，在不到4小时的时间里，确定值为5.7×10⁵个细菌/mL。确切的细菌浓度未知，因此，在大于24小时的培养后，实施CPS3盘计数（供应商：bioMérieux）作为参考。该计数方法提供的结果为6.5×10⁵个细菌/mL。该结果与参考方法有良好的一致性，这是由于观察差异实际上小于2倍，这是通常可以接受的。

图9A和图9B示出通过反射显微镜检查法（以相同的波长λ穿过基板SS而进行照射和检测）观察到的液滴的图像。例如，这可以用于验证微流体器件的功能，研究基板的润湿性，或研究形成液滴的液体的折射率。

在观察生物学对象或分析物时，可以利用在液滴与周围介质之间的界面处所发生的光导引，以使用光学光谱方法（例如，固有荧光和非弹性的拉曼散射）提供增强的灵敏性。对于分析物，使用与荧光相同的配置（图7A）。对于单个对象E，可以使用荧光配置（图8A）以及其中激发光限于入射到对象上的笔形光束的一种新的配置（参见图10）。

目前所描述的所有观察方法涉及通过凸表面S1或通常为优选地通过平坦表面S2照射样品。然而，当样品发光时，这种类型的照射是不必要的，一些微生物或其中发生使得发光的化学反应（由诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的酶催化的化学发光反应）的一些溶液或包括荧光素酶活性的改性的微生物（例如，在M L Eldridge等所著文章“Saccharomyces cerevisiae BLYAS，a NewBioluminescent Bioreporter for Detection of Androgenic Compounds”，APPLIEDAND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY73(19)，第6012–6018页(2007)中所述的）就是这种情况。进行模拟以在以下两种配置中比较置于离液滴有一定距离的检测器以均匀且各向同性的方式收集液滴内部产生的光信号而检测到的光信号：

-如图3A所示的半球状液滴，该液滴由包括给定浓度的化学发光分子的水

溶液形成；

-图4A所示的配置中的浸在油浴中的具有相同体积且相同组成的球状液

滴。

根据计算，对于数值孔径在0.1到0.6范围内的检测器，当液滴为半球状时，所收集的信号高出2.5倍至2.8倍。因此，半球状配置产生更强的信号。

图11涉及特定的实例，其中，在其表面S1上沉积有官能化层CF的半球状（“半珠”）的固体突起V被用作化学传感器。形成或包括在周围介质MA（液态或气态）中的化学物质与官能化层CF反应以产生可检测的光信号（如荧光信号或发光信号）或改变官能化层CF的折射率，这进而影响发光环的内半径（在图9A的设置中的观察）。在变型中，构成突起V的材料本身可能与周围介质反应。在此情况下，突起可以由液滴替换或由凝胶构成。

Claims (14)

1.一种用于观察样品的方法，所述方法包括如下步骤：

a）提供基本上透明的介质形成的物体（G，V），所述介质具有第一折射率（n_int）且具有凸形、圆形或多平面的第一表面（S1）和基本上平坦的第二表面（S2），所述第一表面将所述物体与周围介质（MA）分离开，所述周围介质具有低于所述第一折射率的第二折射率（n_ext），待观察的所述样品由所述物体构成或位于所述物体内或沉积在所述第一表面上；

b）通过所述基本上平坦的第二表面观察所述样品；以及

c）通过在所述步骤b）期间检测与所述物体相匹配的发光环，确定所述样品中的物质或对象的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述物体具有基本上半球形的形状。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述步骤c）包括确定所述样品中的微生物的存在。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述物体是液滴，所述液滴附着到透明基板（SS）上而形成所述基本上平坦的第二表面。

5.根据权利要求4所述的方法，其中：

-所述步骤a）包括产生形成多个所述物体的多个液滴，所述多个液滴中的至少一些液滴包括至少一个待检测的对象或物质；以及

-所述步骤b）包括同时观察多个所述液滴。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述物体是固体，且所述样品由沉积在所述物体的第一表面上的官能化层（CF）构成，所述官能化层对可能包括在所述周围介质中的分析物敏感。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述物体由对分析物敏感的材料形成，所述分析物可能包括在所述周围介质中。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述周围介质是空气。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述步骤b）包括用于照射所述物体的操作。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述照射从所述基本上平坦的第二表面这一侧进行。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述步骤b）包括检测荧光信号。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤b）通过落射荧光显微术进行。

13.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述步骤b）包括检测拉曼散射信号。

14.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述步骤b）利用反射显微术或透射显微术进行。

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