CN102203278B - 测定水介质中微生物含量的方法和体系 - Google Patents

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Abstract

测定水介质中总微生物含量的方法包括向水介质中加入荧光染料，测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号，通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中，测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号，从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号并使净荧光信号等同于微生物含量。还提供了测定总微生物含量的体系和测定生物膜并针对本底噪声调整的方法。

Description

测定水介质中微生物含量的方法和体系
发明领域
本发明涉及用于量化水介质中微生物含量的方法和体系，且更详细地讲，涉及用于测定总微生物含量的基于荧光的测定。
发明背景
公用水体系中微生物活性的存在会引起健康风险。此外，工业体系中微生物的检测和控制对于各种行业都是关键的，因为这类有机体的存在显著促成体系腐蚀、沉积和结垢并直接影响体系的操作成本。监测工业体系和公用水体系中的微生物浓度以及诸如通过施用杀生物剂来处理这些体系是维护这些体系的重要部分。
用于微生物检测的常规监测体系使用基于培养的方法或基于生物化学发光的方法。这两种方法均量化了微生物群；然而，这两种方法都存在与这些方法相关联的固有缺点和缺陷。基于培养的方法需要漫长的培育时间且常常由于培育基的组成而低估微生物数量。生物化学发光方法是快速的，但不精确且常得到假阳性和假阴性结果。
生物膜对于监测微生物浓度提供了额外关注。生物膜为以复杂聚集物形式生长并附着到惰性或活性表面的微生物群。生物膜中的细胞通过诸如外切多糖、脂多糖或糖蛋白的聚合物基质而彼此紧密结合。除了上述结垢、腐蚀问题和健康关注之外，生物膜可降低工业冷却水体系中的传热和液压，堵塞注水射流并阻塞滤水器，且引起微生物影响的腐蚀。生物膜受到外切聚合物层保护且对消毒剂及其他杀生物剂具有极高抵抗性。
需要用于量化水介质中微生物含量(包括量化生物膜含量)的具有高灵敏度的准确且迅速的体系和方法。
发明概述
在一个实施方案中，测定水介质中总微生物含量的方法包括向水介质中加入荧光染料，测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号，通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中，测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号，从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号并使净荧光信号等同于微生物含量。
在另一实施方案中，已经发现测定水介质中总微生物含量的体系，其通过向水介质中加入荧光染料，测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号，随后通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中来进行。所述体系随后测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号。接着，所述体系从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号并使净荧光信号等同于微生物含量。
在另一实施方案中，总微生物含量体系包括经构造以向水介质中加入荧光染料的样品制备组件和将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中的裂解组件。所述体系还包括检测组件，所述检测组件具有测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号且随后测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号的光学测定单元。所述体系还含有控制组件，所述控制组件从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号并使净荧光信号等同于水介质的微生物含量。
各种实施方案提供了用于测定水介质中总微生物含量的改进的方法和体系，其易用、价廉、准确且灵敏度高且可以在短时间内完成。
附图简述
图1描绘对于在热压处理的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)来讲LOGΔRLU相对于LOG细胞浓度(cfu/ml)的回归曲线图。
图2描绘对于在过滤的冷却塔水中稀释的荧光假单胞菌来讲LOGΔRLU相对于细胞浓度(cfu/ml)的回归曲线图。
图3描绘对于在热压处理的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的荧光假单胞菌来讲基于总微生物含量的细胞浓度(cfu/ml)和平板计数及ATP生物发光相对于细胞稀释度的测定读数的曲线。
图4描绘对于在过滤的冷却塔水中稀释的荧光假单胞菌来讲基于总细菌测定的细胞浓度(cfu/ml)和平板计数及ATP生物发光相对于细胞稀释度的测定读数的曲线。
图5描绘对于在热压处理的冷却塔水中稀释的荧光假单胞菌来讲LOGΔRLU相对于LOG细胞浓度(cfu/ml)的回归曲线图。
图6描绘对于悬浮在0.85％盐水缓冲液中的绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)生物膜来讲LOGΔRLU相对于LOG细胞浓度(cfu/ml)的回归曲线图。
图7为根据本发明的一个实施方案用于监测水介质中的总细菌含量的体系的示意图。
图8为图7的总细菌监测体系的光学测定单元。
发明详述
除非上下文明确规定相反，否则单数形式“一个/种”和“所述”包括复数个讨论对象。描述相同特征的所有范围的端点可以独立组合并将所述端点包括在内。所有参考文献都通过引用结合到本文中。
结合量使用的修饰语“约”将所说明的值包括在内且具有由上下文规定的含义(例如，包括与特定量的测定相关的公差范围)。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能出现或可能不出现，或者随后确定的物质可能不存在或者可能存在，并且该描述包括其中发生该事件或情况或其中存在该物质的情形和其中不发生该时间或情况或其中不存在该物质的情形。
在一个实施方案中，测定水介质中总微生物含量的方法包括向水介质中加入荧光染料，测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号，通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中，测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号，从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号并使净荧光信号等同于微生物含量。
所述方法测定水介质中的总微生物含量。所述微生物物质可为微生物，诸如细菌。细菌的非限定性实例包括绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭极毛杆菌(Pseudomonasputida)、去磺弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、土生丛毛单胞菌(Comamonasterrigena)、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)、普通硝化杆菌(Nitrobactervulgaris)、浮游球衣细菌(Sphaerotilusnatans)、盖氏铁柄杆菌种(Gallionellaspecies)、土壤分枝杆菌(Mycobacteriumterrae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短黄杆菌(Flavobacteriumbreve)、沙门氏杆菌(Salmonellaenterica)、伤寒沙门氏菌(EntericaserovarTyphimurium)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeusspore)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、放线共生放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、白念珠菌(Candidaalbicans)和大肠杆菌(Ecsherichiacoli)。
水介质可为可含有微生物物质的任何类型的水介质，包括生物膜微生物已经去除或分散到其中的水介质。在一个实施方案中，所述水介质为水。在一个实施方案中，所述水可为城市用水或工业用水，诸如冷却塔水。在另一实施方案中，所述水介质可为用于个人护理产品制造或食品和饮料或医药加工的水溶液。在一个实施方案中，所述水介质可为盐水溶液。在另一实施方案中，所述水介质可为磷酸盐缓冲溶液。
将荧光染料加到水介质中。所述荧光染料可为在微生物物质存在下改变其荧光信号的任何类型的染料。在一个实施方案中，所述荧光染料为荧光色素，其为与诸如核酸、蛋白质、胞质组分和膜组分的生物细胞组分结合的微生物染色染料。
荧光色素的实例包括但不限于吖啶橙、溴化乙锭(ethidiumbromide)、Hoechst33258、Hoechst33342、碘化丙锭(propidiumiodide)、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚和市售的核酸染料，诸如PicoGreen、SYTO16、SYBRGreenI、SYBRGreenII、SYBRGold、YOYOTM、TOTOTM、TO-PRO、YO-PRO、TexasRed、RedmondRed、BodipyDyes或OregonGreen。荧光色素可从MolecularProbes(Eugene，OR)、SigmaChemical(StLouis，Mo.)、Amersham(ArlingtonHeights，IL.)、Callbiochem-Novabiochem(LaJolla，CA)或SyntheticGenetics(SanDiego，CA)购得。在另一实施方案中，所述荧光色素染料可为花青染料，其可作为PicoGreen、TOTOTM、SYBRGreenI、SYBRGreenII、SYBRGold或SYBRGreenI购得。在另一实施方案中，荧光色素染料为不对称的花青染料，诸如SYBRGreenI。
所述荧光染料以适于使水介质中的微生物物质发荧光的量加到水介质中。在一个实施方案中，所述荧光染料以约0.5mg-约100mg荧光染料/L水介质的量加入。在另一实施方案中，所述荧光染料以约0.5mg-约10mg荧光染料/L水介质的量加入。在另一实施方案中，所述染料以约0.5mg-约1.0mg荧光染料/L水介质的量加入。
在一个实施方案中，移出一部分水介质用于测试。水介质部分可手动移出或者可通过在线测试装置系统地移出。将荧光染料加到水介质中并通过混合分散。在另一实施方案中，将荧光染料的溶液注入水介质样品中并共混。
当使用荧光色素时，将水介质的pH保持在合适范围内以便优化染料的荧光。在一个实施方案中，水介质的pH保持为约4.0-约9.5。在另一实施方案中，水介质的pH保持为约7.0-约8.0。
在一个实施方案中，将缓冲剂加入水介质中以将水介质的pH保持在合适范围内。所述缓冲剂可为不影响水介质中的微生物物质或荧光测定的任何类型的缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂为无机缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水或硼酸盐缓冲液。在另一实施方案中，所述缓冲剂为有机缓冲剂，诸如三(羟甲基)氨基甲烷、乙二胺四乙酸、N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸或其混合物。在一个实施方案中，所述缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷和乙二胺四乙酸的共混物。在另一实施方案中，浓度范围为约1mol/L-约30mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷和浓度范围为约100mmol/L-约3mmol/L的乙二胺四乙酸的共混物的摩尔比为约10∶1。
可以在将荧光色素加到水介质中之前或之后加入缓冲剂。在一个实施方案中，将荧光色素和缓冲剂预混合且一起加入水介质中。
在一个实施方案中，将缓冲剂以基于水介质的体积计算约1％体积-约30％体积的量加到水介质中。在另一实施方案中，将缓冲剂以基于水介质的体积计算约1％体积-约15％体积的量加到水介质中。在另一实施方案中，将缓冲剂以基于水介质的体积计算约5％体积-约10％体积的量加到水介质中。
基线荧光信号通过测定含有荧光染料的水介质的荧光来得到。如本文所用，“荧光”是指当化合物受到较短波长的光激发时发射的光。激发和发射波长取决于所选择的荧光染料。在一个实施方案中，激发波长为约350nm-约600nm，发射波长为约450nm-约650nm。
荧光可通过任何类型的荧光检测器测定。在一个实施方案中，荧光信号通过荧光光谱学、荧光显微术、荧光二极管阵列检测、微板荧光读数或流式细胞术测定。在一个实施方案中，荧光检测器为便携式基于荧光的检测装置或具有荧光分光镜的在线水状态监测仪器。在一个实施方案中，便携式基于荧光的检测装置具有LED激发光和PMT发射检测器。在一个实施方案中，便携式基于荧光的检测装置具有LED激发光和光电二极管发射检测器。
测定快速进行且可采取数次测定并取平均值。微生物物质可以低至104菌落形成单位(cfu)/ml所测试水介质的浓度检测，而不需要测试前的浓缩过程。
基线测定可手动记录或在在线监视仪器中测定并储存。
荧光染料使微生物细胞组分染色，但是其不能透过微生物细胞的完整细胞膜。为了测定总微生物含量，将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中，在此其可被荧光染料接触。在一个实施方案中，微生物物质的胞内内容物通过裂解微生物物质的细胞来释放，溶胞使细胞膜分裂开。裂解可使用机械、化学、物理、电学、超声或微波方法或这些方法的任何组合进行。
机械裂解诸如通过剪切、振动或力物理上破坏细胞障壁。机械方法的实例包括但不限于压力驱使细胞流经在流体通道中的过滤器样结构或小型条，用低离子强度水的迅速扩散混合渗透性地压迫细胞，使细胞经受剪切力同时进入具有尖锐小型结构的特定区域，用微珠搅拌器或珠磨破坏细胞障壁或对水介质中的细胞施加超声波能量。
当使用化学品破坏细胞障壁时发生化学裂解并允许胞内内容物释放。可使用可以破坏细胞障壁的任何化学品。在一个实施方案中，使用洗涤剂、酶、萃取溶剂或裂解缓冲剂。洗涤剂包括但不限于十二烷基硫酸盐、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲铵基(ammonio)]-1-丙烷磺酸盐、TWEENTM20洗涤剂、TRITONTMX系列洗涤剂、胆酸钠、脱氧胆酸钠、氯化。酶包括但不限于溶菌酶、变溶菌素、labiase、溶葡萄球菌素、溶细胞酶、蛋白酶K、内溶菌素或消色肽酶(achromopeptidase)。萃取溶剂包括但不限于聚乙烯基聚吡咯烷酮、苯酚、三氯三氟乙烷或苯酚和硫氰酸或氯化的混合物。裂解缓冲剂包括但不限于氯化铵、季铵化合物、十六烷基三甲基溴化铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、Zap-o-globinTM、可从CoulterDiagnostics购得的裂解缓冲剂或可从MolecularProbes购得的CyQUANTTM裂解缓冲剂。
所述试剂可以适合裂解微生物物质的任何量加入且可以过量加入。在一个实施方案中，所述试剂以约1mg-约10,000mg/L水介质的量加入。在另一实施方案中，所述试剂以约1mg-约1000mg/L水介质的量加入。在另一实施方案中，所述试剂以约1mg-约50mg/L水介质的量加入。
物理裂解可通过热方式或通过冻融发生。裂解可通过诸如用热块或加热板加热水介质来通过热方式实现。在一个实施方案中，将水介质加热到约40℃-约100℃的温度。在另一实施方案中，所述温度为约40℃-约60℃。在一个实施方案中，将水介质加热约1分钟-约1小时。在另一实施方案中，将水介质加热约1分钟-约30分钟，包括约1分钟-约15分钟。在另一实施方案中，将水介质加热约1分钟-约3分钟。
在冻融的一个实例中，将水介质诸如在乙醇-干冰浴中冷冻且随后使其熔融。
细胞可用一系列电脉冲、通过扩散混合或介电电泳截留或由微波辐射通过电方式裂解。也可将自由基用于裂解。所述方法包括对水介质中的金属离子、过氧化物和微生物物质的混合物施加电场以产生攻击细胞障壁的自由基。
在已经提取微生物物质的胞内内容物并将其释放到水介质中之前和之后测定水介质的荧光信号以分别提供基线荧光信号和第二荧光信号。这些荧光信号可手动记录或者可在在线监视仪器中测定并储存。
从第二荧光信号中减去基线荧光信号以得到净荧光信号。
可使净荧光信号等同于总微生物含量。可对于所选择的荧光染料根据微生物物质的已知浓度和所述浓度的荧光测定制作校准曲线。在一个实施方案中，微生物物质的浓度通过平板计数方法测定。在一个实施方案中，测定含有已知总微生物含量和所选择的荧光染料的数个样品以得到荧光信号。将这些信号的对数值绘制在图上，且可进行回归分析以得到使总微生物含量等同于荧光信号的校准曲线。
总细菌浓度可快速且根据选择用于释放生物物质的胞外含量的方法来测定，测定可在5分钟内完成。快速测定非常适合实验室使用、现场应用、在线自动分批体系或脱机监测体系。在另一实施方案中，测定可自动且连续进行。
在另一实施方案中，可得到本底荧光信号以除去本底干扰并改进水介质中微生物含量的测定准确度。本底信号可通过测定任何另外的有机或非细胞组分的荧光来得到。在一个实施方案中，将本底信号从净荧光信号中减去。在一个实施方案中，测定水介质中总微生物含量的方法包括向水介质部分中加入荧光染料，得到另外的水介质部分作为本底水介质部分，处理本底水介质部分以除去微生物物质，将荧光染料加到经处理的本底水介质部分中，测定水介质部分中的荧光信号以得到基线荧光信号，测定经处理的本底水介质部分中的荧光信号以得到本底基线荧光信号，通过裂解微生物物质将水介质部分中的微生物物质的胞内内容物释放到水介质中，模拟本底水介质部分中的裂解过程，测定含有所释放的微生物胞内内容物的水介质部分中的荧光信号以得到第二荧光信号，测定经模拟后的本底水介质部分中的荧光信号以得到第二本底荧光信号，从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号，从第二本底荧光信号中减去本底基线荧光信号以得到净本底信号，根据净本底信号调整净荧光信号并使经调整的净荧光信号等同于微生物含量。
水介质如上所述。对于任何类型的水介质可得到本底信号，但是对于具有大量在荧光染料存在下发荧光的有机或非细胞组分的水介质(诸如来自原油处理的工艺水)最有帮助。在一个实施方案中，水介质部分和本底水介质部分具有相同的体积。
加入荧光染料和得到基线荧光信号的步骤、释放微生物物质的胞内内容物、得到第二荧光信号和得到净荧光信号如上所述。
可对水介质进行处理以除去微生物物质。可通过加热水介质或通过用诸如漂白剂、氯气、其他商业杀生物剂或其组合的杀生物剂处理水介质而从水介质中除去微生物物质以便得到本底信号。在一个实施方案中，氯气的使用量为约0.1ppm-约30ppm。在另一实施方案中，氯气的使用量为约0.1ppm-约20ppm，包括约0.1ppm-约10ppm。杀生物剂的使用量可为约1ppm-约200ppm。在另一实施方案中，杀生物剂的使用量为约1ppm-约100ppm，包括约1ppm-约50ppm。当使用氯气时，可能必需在使本底微生物效应减至最小后中和氯气。在一个实施方案中，使用焦亚硫酸钠来中和氯气。在一个实施方案中，将焦亚硫酸钠以约1ppm-约500ppm的量加到水介质中。在另一实施方案中，将焦亚硫酸钠以约1ppm-约300ppm、包括约1ppm-约200ppm的量加到水介质中。
在另一实施方案中，微生物物质组分可通过诸如用热块或加热板加热水介质来除去。在一个实施方案中，将水介质加热到约40℃-约100℃的温度。在另一实施方案中，所述温度为约40℃-约70℃。在另一实施方案中，所述温度为约40℃-约60℃。在一个实施方案中，将水介质加热约1分钟-约1小时。在另一实施方案中，将水介质加热约1分钟-约30分钟，包括约1分钟-约15分钟。在另一实施方案中，将水介质加热约1分钟-约3分钟。
本底基线荧光信号可通过测定经处理以除去微生物物质的水介质部分的荧光来得到。激发和发射波长取决于所选择的荧光染料。在一个实施方案中，激发波长为约350nm-约600nm，发射波长为约450nm-约650nm。荧光可通过如上所述的荧光检测器测定。本底基线信号可手动记录或在在线监视仪器中测定并储存。
裂解过程可在经处理的本底水介质部分中模拟。在一个实施方案中，使将胞内微生物内容物释放到水介质部分中的过程在已经除去微生物物质的本底水介质部分中重复。如上所述，裂解可使用机械、化学、物理、电学、超声或微波方法或这些方法的任何组合进行。
第二本底荧光信号可通过测定模拟后的本底水介质的荧光来得到。激发和发射波长取决于所选择的荧光染料。在一个实施方案中，激发波长为约350nm-约600nm，发射波长为约450nm-约650nm。荧光可通过如上所述的荧光检测器测定。第二本底荧光信号可手动记录或在在线监视仪器中测定并储存。
可将本底基线荧光信号从第二本底荧光信号中减去以得到净本底信号。净荧光信号可通过从净荧光信号中减去净本底信号来调整以得到经调整的净荧光信号。
可使经调整的净荧光信号等同于总微生物含量。可对于所选择的荧光染料根据微生物物质的已知浓度和荧光测定制作校准曲线。在一个实施方案中，测定含有已知总微生物含量和所选择的荧光染料的数个样品以得到荧光信号。将这些信号的对数值绘制在图上，且进行回归分析以得到使总微生物含量等同于荧光信号的校准曲线。
水介质部分可手动移出或者可通过在线测试装置系统地移出。
在另一实施方案中，生物膜的浓度可被量化。生物膜附于包括但不限于玻璃、塑料、金属或涂料的表面且可将其从表面去除并分散在水介质中以测定生物膜的总微生物含量。在一个实施方案中，测定水介质中生物膜含量的方法包括将生物膜分散到水介质中，向水介质中加入荧光染料，测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号，通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中，测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号，从第二荧光信号中减去基线荧光信号以得到净荧光信号并使净荧光信号等同于微生物含量。
必须将生物膜或固着微生物从表面处分开并将其分散在水介质中以量化生物膜的微生物浓度。水介质可为已经去除或分散有生物膜微生物于其中的任何类型的水介质。在一个实施方案中，生物膜分散在盐水溶液。在另一实施方案中，生物膜分散在缓冲盐水溶液。在另一实施方案中，所述水介质可为磷酸盐缓冲溶液。在另一实施方案中，所述水介质为水。在另一实施方案中，所述水可为城市用水或工业用水，诸如冷却塔水。
可通过不破坏单个细胞结构并可通过物理方法、机械方法、化学方法或这些方法的组合实现的任何合适方式将微生物细胞从生长表面剥离或去除并将其分散在水介质中。分开和分散生物膜细胞的物理方法的实例包括但不限于用强剪切应力搅动、涡流、振荡和洗涤。在一个实施方案中，生物膜用涡流分散。在一个实施方案中，将生物膜试样浸在液体中且通过产生围绕其快速涡流或旋流(如在旋风分离器中)的流体流历时合适时间以从聚集体释放细胞而从试样去除细胞。在一个实施方案中，将生物膜涡流约5秒-约5分钟。在另一实施方案中，将生物膜涡流约10秒-约3分钟。在另一实施方案中，将生物膜涡流约15秒-约1分钟。在另一实施方案中，将生物膜涡流约30秒。
用于分开并分散生物膜细胞的机械方法的实例包括但不限于使用超声处理浴或电流。
用于分开并分散生物膜细胞的化学方法的实例包括但不限于加入表面活性剂、分散剂或消化酶。表面活性剂的实例包括但不限于环氧乙烷和/或环氧丙烷(EO/PO)共聚物、二甲基酰胺聚合物、Ultra-KleenTM杀生物剂(从Sterilex(OwingsMills，MD)购得)、辛磺酸钠或烷基多糖苷。酶的实例包括但不限于纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶的共混物。在一个实施方案中，所述分散剂可为聚乙烯亚胺。
在已将生物膜去除并分散在水介质中之后，进行总微生物测定。向水介质中加入荧光染料、测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号、将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中、测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号、得到净荧光信号和使净荧光信号等同于微生物含量的步骤如上所述。
在另一实施方案中，微生物总量(cfu)可通过浓度乘以去除的生物膜已进入其中的水介质的已知体积来得到。在另一实施方案中，每单位表面积的微生物的量(cfu/cm2)可通过将微生物的量除以生物膜所附着表面的单位面积得到。
生物膜可通过从已知尺寸的所选择体系表面取生物膜样品来直接测定。或者，可将试样用于生长并测定体系使生物膜生长的倾向。水体系的一些区域难以接近来实际取样，试样测试提供体系生长生物膜的倾向的测定。该方法也可以提供处理程序已成功地降低了经处理的体系生长生物膜的倾向的证据。
在另一实施方案中，可得到本底荧光信号以去除本底干扰并改进水介质中生物膜含量的测定准确度。
为了使本领域技术人员能够很好地实践本发明，以说明而不是限制的方式提供了以下实施例。
实施例
实施例1
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的校准曲线：
使荧光假单胞菌细胞在液体培养基中生长过夜并将其加到10mlPBS中以形成初始样品。从初始样品进行连续稀释。将0.1ml初始样品加到9.9mlPBS中以制得1％(10-2)溶液。将1ml的1％溶液加到9mlPBS中以制得0.1％(10-3)溶液。将1ml的0.1％溶液加到9mlPBS中以制得0.01％(10-4)溶液。将1ml的0.01％溶液加到9mlPBS中以制得0.001％(10-5)溶液。将10mlPBS用作无细胞的空白样。
从各稀释的样品和无细胞的空白样中取170μl样品并将各样品与20μl10XSYBRGreenI染料和10μl20XCyQUANTTM裂解缓冲液(可从MolecularProbes购得)混合。通过LS55发光光谱仪(PerkinElmer)在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品(无细胞的空白样、10-2、10-3、10-4和10-5)的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光强度I信号。
将样品在60℃下加热2分钟，随后冷却到室温。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各稀释的样品(10-2、10-3、10-4和10-5)的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光强度II信号。
Δ荧光强度(Δ)通过从荧光强度II信号中减去荧光强度I信号得到。
使用标准平板计数法得到各样品(无细胞的空白样、10-2、10-3、10-4和10-5)的总荧光假单胞菌的浓度。
在Δ荧光强度(相对荧光单位(RLU))的对数值和平板计数(cfu/ml)的对数值之间进行回归分析以得到如图1所示的校准曲线。回归方程为y＝-1.37+0.855x(R-Sq＝97.6％)。
实施例2
校准曲线：
如实施例1中制作校准曲线，不同之处在于使用来自冷却塔的过滤水替代PBS。
将约50ml来自冷却塔的水经PVDF过滤器(MilliporeSLGV033RB)过滤以除去残留微生物。将10ml经过滤的水用作无细胞的空白样。
通过平板计数法得到各样品(无细胞的空白样、10-2、10-3、10-4和10-5)的总荧光假单胞菌的浓度。
在Δ荧光强度(RLU)的对数值和平板计数(cfu/ml)的对数值之间进行回归分析以得到如图2所示的校准曲线。回归方程为y＝0.383+0.576x(R-Sq＝90.7％)。
实施例3
使荧光假单胞菌细胞在培养平板上生长过夜且将其加到数个170μl的磷酸盐缓冲盐水样品中。将各样品与20μl10XSYBRGreenI染料(得自MolecularProbes)和10μl20XCyQUANTTM裂解缓冲液混合。
在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光基线信号。
将样品在60℃下加热2分钟，随后冷却到室温。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到第二荧光信号。
Δ荧光强度(Δ)通过从第二荧光信号中减去荧光基线信号得到。根据实施例1中制作并在图3中示为样品1的校准曲线使Δ荧光强度测定的对数值等同于细胞浓度(cfu/ml)。图3图示了对于在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的荧光假单胞菌的细胞浓度(cfu/ml)和ATP生物发光的测定读数与细胞稀释度的关系。
对比测试也通过平板计数和BioscanTMATP对各样品进行。对各测试进行四次测定且取平均值并示于图3中。平板计数和样品1结果以对数浓度记录且ATP结果以原始浓度记录。ATP结果对于相同标准具有1-log变化且结果对于用于定量比较来太嘈杂。
样品1进行5分钟或更短时间且可以良好准确度测定低至104cfu/ml的浓度。其与传统基于培养基的方法具有类似变化(标准偏差/平均值)和良好相关性，且与工业BioscanTMATP方法相比具有好得多的检测极限和较小变化。
实施例4
使荧光假单胞菌细胞在培养平板上生长过夜且将其加到数个170μl经热压处理以除去残留微生物的油田水(fieldwater)样品中。
将各样品与20μl10XSYBRGreenI染料(得自MolecularProbes)和10μl20XCyQUANTTM裂解缓冲液混合。
在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光基线信号。
将样品在60℃下加热2分钟，随后冷却到室温。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到第二荧光信号。
Δ荧光强度(Δ)通过从第二荧光信号中减去荧光基线信号得到。根据实施例2中制作的校准曲线使Δ荧光强度测定的对数值等同于细胞浓度(cfu/ml)且在图4中示为样品2。图4图示了对于在油田水中稀释的荧光假单胞菌的细胞浓度(cfu/ml)和ATP生物发光的测定读数与细胞稀释度的曲线。
对比测试也通过平板计数和BioscanTMATP对各样品进行。对各测试进行四次测定且取平均值并示于图4中。平板计数和样品2结果以对数浓度记录且ATP结果以原始浓度记录。ATP结果对于相同标准具有1-log变化且结果对于用于定量比较来说太嘈杂。
样品2进行5分钟或更短时间且可以良好准确度测定低至104cfu/ml的浓度。其与传统基于培养基的方法具有类似变化(标准偏差/平均值)和良好相关性，且与工业BioscanTMATP方法相比具有好得多的检测极限和较小变化。
实施例5
对于冷却塔水中的荧光假单胞菌和在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的荧光假单胞菌制作校准曲线。将约50ml来自冷却塔的水热压处理以除去残留的微生物。
使荧光假单胞菌细胞在液体培养基中生长过夜并将其加到10ml热压处理的冷却塔水中以形成初始样品。从初始样品进行连续稀释。将0.1ml初始样品加到9.9ml热压处理的冷却塔水中以制得1％(10-2)溶液。将1ml的1％溶液加到9ml热压处理的冷却水中以制得0.1％(10-3)溶液。将1ml的0.1％溶液加到9ml热压处理的冷却水中以制得0.01％(10-4)溶液。将1ml的0.01％溶液加到9ml热压处理的冷却塔水中以制得0.001％(10-5)溶液。将10ml的热压处理的冷却塔水用作空白样。
将荧光假单胞菌细胞加到10mlPBS中以形成初始样品。如对于冷却塔水一样从初始样品进行连续稀释以制得10-2、10-3、10-4和10-5的PBS溶液。将10mlPBS用作空白样。
留出来自各水和PBS连续稀释的样品用于测定水样品中的本底噪声。将各本底样品用由1ppm氯气和20ppmBellacide350组成的杀生物剂处理30分钟。加入200ppm亚硫酸氢钠以中和残留氯。
从各稀释的冷却塔水PBS样品和本底样品取得170μl样品。将各样品与20μl10XSYBRGreenI染料(得自MolecularProbes)和10μl20XCyQUANTTM裂解缓冲液混合。
在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各冷却塔水和PBS样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光I信号。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各本底冷却塔水的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到本底荧光I信号。
将样品在60℃下加热2分钟，随后冷却到室温。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下再次测定各冷却塔水和PBS样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光II信号。对于各本底冷却塔水样品在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到本底荧光II信号。净荧光强度通过从荧光II信号减去荧光I信号得到。对于各冷却塔水和PBS样品得到净荧光测定值。
净本底荧光强度通过从本底荧光强度II信号减去本底荧光强度I信号得到。对于各本底样品得到净本底荧光测定值。
对于各样品，经调整的净荧光信号通过从净荧光信号中减去净本底荧光信号得到。
对于各冷却塔水和PBS样品，使用标准平板计数法得到总荧光假单胞菌的浓度。
对于冷却塔水和PBS，在经调整的净荧光信号(RLU)的对数值和平板计数(cfu/ml)的对数值之间进行回归分析以得到校准曲线，如图5所示。PBS校准曲线的回归方程为y＝-1.47+0.847x(R-Sq＝92.2％)。对于冷却塔水的回归方程为y＝-1.29+0.741x(R-Sq＝73.7％)。从165个数据点中删除3个异常值。
实施例6
如实施例1中制作校准曲线，不同之处在于细菌为绿脓假单胞菌细胞并使其在胰酶大豆肉汤(trypicsoybroth；TSB)液体培养基中生长过夜并将其加到10ml0.85％盐水缓冲液中以形成初始样品。
从初始样品进行连续稀释。将0.1ml初始样品加到9.9ml0.85％盐水缓冲液中以制得1％(10-2)溶液。将1ml的1％溶液加到9ml0.85％盐水缓冲液中以制得0.1％(10-3)溶液。将1ml的0.1％溶液加到9ml0.85％盐水缓冲液中以制得0.01％(10-4)溶液。将1ml的0.1％溶液加到9ml0.85％盐水缓冲液中以制得0.001％(10-5)溶液。将10ml0.85％盐水缓冲液用作无细胞的空白样。
从稀释的样品和无细胞的空白样中各自取得180μl且将各样品与20μl10XSYBRGreenI染料混合。通过LS55发光光谱仪(PerkinElmer)在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品(无细胞的空白样、10-2、10-3、10-4和10-5)的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到基线荧光测定值。
将样品加热到90℃历时2分钟，随后冷却到室温。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定荧光强度以得到荧光强度II测定值。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光强度II测定值。
Δ荧光强度通过从荧光强度II信号减去基线荧光信号计算。
对于各样品(无细胞的空白样、10-2、10-3、10-4和10-5)使用标准平板计数法得到总绿脓假单胞菌细胞的浓度。
在Δ荧光强度(RLU)的对数值和平板计数(cfu/ml)的对数值之间进行回归分析以得到如图6所示的校准曲线。回归方程为y＝-1.0185+0.7381x(R-Sq＝98.97％)。
绿脓假单胞菌生物膜细胞通过提供液体生长介质、具有1％细菌接种体的30％TSB介质(过夜培养)的再循环流以135ml/min流速经过循环线路中的管道而在316不锈钢管道内表面上生长过夜。
在所需时间间隔之后，将316不锈钢管段从流动体系中除去。生物膜累积物通过将316不锈钢管段浸入10ml0.85％盐水缓冲液中并以最大速度涡旋2分钟而去除。
将数个180μl涡旋样品的等分样品与20μl10XSYBRGreenI染料混合。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到基线荧光测定值。
将样品加热到90℃历时2分钟，随后冷却到室温。在497nm的激发波长和520nm的发射波长下测定各样品的荧光强度。对于各样品测定荧光四次并取平均值以得到荧光强度II测定值。
Δ荧光强度通过从荧光强度II信号中减去荧光基线信号来计算。将Δ荧光强度测定(RLU)的对数值沿图6中的校准曲线作为样品3的数据点绘制。根据图6中的校准曲线使各样品的Δ荧光强度测定的对数值等同于细胞浓度(cfu/ml)。
根据图6，可以看出来自绿脓假单胞菌生物膜细胞(样品3)的所有数据点与从浮游的绿脓假单胞菌细胞悬浮液得到的校准曲线完全对准，这表明该测定适合在从固体表面分散生物膜之后进行生物膜量化。
现参看图7，图示了根据上述方法用于监测水体系的水介质中总细菌含量的体系且通常以参考数字100提到。图7中所示的实施方案图示具有流经循环回路104的水介质的常规开放式再循环冷却塔水体系102。水介质流经循环回路104可通过本领域已知的循环泵106加速。阀门108容许水介质从循环回路104进料到总细菌监测体系100。总细菌监测体系100充当在线分析器以监测水体系102的水介质中的细菌浓度。本领域技术人员将理解总细菌监测体系100可用来通过测定任何城市或工业用水或工艺体系102中的总细菌提供总活细菌的快速检测。因此，本文中不必提供水体系102的更多细节。
进入总细菌监测体系100的水介质首先通过过滤器组件110。理想地，过滤器组件110包括过滤器112，其具有约5-约50微米的孔径，使得较大杂质从水介质中除去，但细菌内容物通过留在滤液中。在一个实施方案中，过滤器组件110为触发器(flip/flop)型过滤体系，诸如2008年8月18日提交的题为“In-LineFiltrationSystems(在线过滤体系)”的共同受让的美国专利申请第12/193,198号中公开的过滤体系，过滤器孔径为10微米。然而，在不偏离本发明的范围的情况下，过滤器组件110可包括其他过滤器布局。
总细菌监测体系100包括控制组件120、样品制备组件130、裂解组件140和检测组件150。控制组件120含有可编程的逻辑控制器122或类似装置和用于控制其他组件130、140、150的功能的电子单元124，且另外如下所述计算总细菌浓度。
样品制备组件130由液位开关样品杯132和用以控制过滤后的水介质流进样品杯132的电磁阀133构成。在一个实施方案中，液位开关样品杯132包含一对导线。当样品杯132充满时或处于指定高液位时，两根线电连接，这触发电磁阀133关闭。当样品杯132变空或处于指定低液位时，两根线断开，这触发电磁阀133开启。这两种状态之间的死区(deadband)理想地为约1.5ml。样品制备组件130使水介质的压力从循环回路104中的集管压力下降到大气压力。理想地，样品杯132对大气开放，以使得水介质中的所有气泡经排气口134从样品中逸出。如本领域技术人员将理解，水介质中的气泡将从检测组件150中使用的光学测定装置中引起不必要的刺突(spike)。
诸如微正排量泵的样品泵135从样品杯132中取出水介质。通过降低压力，保护样品泵135，因为样品泵仅可定速为约5psig。水介质经样品制备组件130的进料速率使用样品泵135控制。可编程的逻辑控制器122设定样品泵135的振动频率以准确控制流量。水介质的流量理想地为约100μL-约250μL，更理想地为150μL-约200μL。在一个实施方案中，样品泵137为由BeionMedicalTechnologyCo制造的150SP-S2型。然而，可使用能够准确泵送小体积水介质的任何已知泵。
在所说明的实施方案中，将荧光色素试剂与缓冲剂预混合并将其从试剂供应136一起加到水介质中。或者，本领域技术人员将理解可在将荧光色素加到水介质中之前或之后加入缓冲剂。试剂供应136借助于试剂进料泵137进料荧光色素和缓冲剂。试剂进料泵137还理想地为微正排量泵且可编程的逻辑控制器122设定其振动频率以准确控制流量。理想地，试剂进料泵137以约0.5mg-约100mg荧光色素/L水介质的量加入荧光色素。将缓冲剂加到水介质中以将水介质的pH保持为约2-约10。在一个实施方案中，试剂泵为由BeionMedicalTechnologyCo制造的120SP-S2型。
通过样品泵135泵送的水介质和通过试剂进料泵137泵送的试剂使用提供促进水介质、荧光色素试剂和缓冲剂混合的湍流路径的混合丁字接头138(泛称：混合装置)组合。在不偏离本发明的范围的情况下，也可以使用其他混合装置，诸如混合十字管或叶轮。
在所说明的实施方案中，裂解组件140通过加热水介质实现了裂解。水介质样品制备组件130通到裂解组件140或使用受控制组件120控制的三通阀141直接通到检测组件150，因此绕过裂解组件140。在一个实施方案中，裂解组件140包括使水介质的温度升高和降低以裂解细胞并释放微生物物质的胞内内容物的温度控制单元142。温度控制组件142包括用以加热水介质的加热装置144，诸如半导体板或其他已知加热元件。在细胞已经裂解之后使用风扇或其他辐射器146促进样品快速冷却。在加热和冷却期间，热电偶148测定水介质的温度。控制组件120控制并供应动力到温度控制单元142以将样品加热到所要温度使细胞裂解，随后使用预定控制程序冷却样品，直到达到所要温度。理想地，温度控制单元142将水介质加热到约40℃-约100℃、更理想地约40℃-约60℃的温度。温度控制单元142理想地在约1分钟-约1小时、更理想地约1分钟-约3分钟的时间内将水介质加热到所要温度，以裂解细胞。本领域技术人员将理解温度控制单元142根据需要可含有用以加热和冷却水介质的其他已知设备。另外，如上所述，在不偏离本发明的范围的情况下，裂解组件140可使用诸如机械、化学、物理、电力、超声或微波方法的其他已知裂解方法来裂解细胞。
随后将含有裂解的生物内容物的水介质经三通阀149引导到检测组件150。检测组件150包括光学测定单元152。使用多于一个光学测定单元可加强测定准确度。光学测定单元152包括硅玻璃流动池154和单波长荧光计156。硅玻璃流动池154具有分别安装在流动池底部和顶部的入口流管158和出口流管159。如图8中图示的示意性实施方案最佳地所见到的，荧光计156包括经构造围绕反应管163的至少一对发光二极管(LED)160和光电二极管发射检测器162。理想地，荧光信号用具有约350nm-约600nm的激发波长和约450nm-约650nm的发射波长的荧光计测定。另外，荧光计156包括在密封的光学管中用以控制光程和强度的光学透镜164和滤光器165。在一个实施方案中，荧光计156为PerkinElmer制造的LS55发光光谱仪。
在包含三对光学组件的一个实施方案中，三个LED和3个光电二极管安装在垂直于中心通孔的六个径向通道中。三个LED产生不同波长的入射光，且三个相应光电二极管在相对侧检测相应透射率。所使用的LED包括具有467nm(蓝色)、530nm(绿色)和634nm(红色)光的三原色、具有610nm最大发射的橙色LED和具有586nm最大发射的浅绿LED。该构造简化了光学组件的设计和维修。三对照相光学组件提供了一次测定三种功能的能力。不存在可包括的照相光学组件对的最大数目；然而，该数目将受到基于监测体系的预定用途的大小限制的影响。
根据各成套设备的容许需求，来自光学测定单元152的包含混合的样品水和试剂的排出物离开检测器组件150并连接到排出或收集罐。因为排出物为无危险的废水，所以通常将其排放到自重排水。
对控制组件120编程，使得在于裂解组件140中已提取微生物物质的胞内内容物并将其释放到水介质中之前和之后通过检测组件150测定水介质的荧光信号，以分别提供基线荧光信号和第二荧光信号。这些荧光信号通过检测组件150测定并储存在可编程的逻辑控制器122中。将基线荧光信号从第二荧光信号中减去以得到作为裂解细胞的微生物含量结果的净荧光信号。如上所述使用校准曲线以得到总微生物含量。如上说明，校准曲线通过测定具有荧光色素的水介质中已知浓度的微生物物质荧光信号、确定各浓度的净荧光信号、绘制浓度量与净荧光信号的对数值的关系曲线并进行回归分析以得到校准曲线来制作。上述特点使得所述体系可以在线方式监测总细菌。
虽然已经出于说明目的陈述了典型实施方案，但是不应将上述描述视为对本文中范围的限制。因此，本领域技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下想到改变、改进和替代。

Claims (53)

1.测定含有有机或非细胞组分的水介质中总微生物含量的方法，其包括：
向水介质中加入荧光染料；
测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号；
通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中；
测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号；
从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号；和
使净荧光信号等同于微生物含量，
其中所述荧光染料为不对称的花青染料。
2.权利要求1的方法，其中所述含有有机或非细胞组分的水介质为含有有机或非细胞组分的水。
3.权利要求1的方法，其中所述含有有机或非细胞组分的水介质为含有有机或非细胞组分的盐水溶液。
4.权利要求1的方法，其中所述含有有机或非细胞组分的水介质为含有有机或非细胞组分的磷酸盐缓冲溶液。
5.权利要求1的方法，其中所述荧光染料的存在量为0.5mg-100mg荧光染料/升水介质。
6.权利要求1的方法，其中所述水介质的pH保持为2-10。
7.权利要求6的方法，其中将缓冲剂加到所述水介质中以保持所述pH。
8.权利要求7的方法，其中所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲盐水、硼酸盐缓冲剂、三(羟甲基)氨基甲烷、乙二胺四乙酸、N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸及其混合物。
9.权利要求1的方法，其中所述荧光信号用荧光光谱仪在350nm-600nm的激发波长和450nm-650nm的发射波长下测定。
10.权利要求1的方法，其中所述微生物物质用裂解试剂化学裂解以释放胞内物质。
11.权利要求10的方法，其中所述微生物物质用包括洗涤剂、酶、萃取溶剂或裂解缓冲剂的裂解试剂裂解。
12.权利要求10的方法，其中所述裂解试剂以1mg-10,000mg/升水介质的量加入。
13.权利要求1的方法，其中将所述微生物物质物理、机械或电学裂解以释放胞内物质。
14.权利要求13的方法，其中将所述水介质加热到40℃-100℃的温度历时1分钟-1小时以裂解微生物物质的细胞。
15.权利要求1的方法，其中根据校准曲线使所述净荧光信号等同于微生物浓度。
16.权利要求15的方法，其中所述校准曲线通过测定含有荧光染料的水介质中已知浓度的微生物物质的荧光信号、确定各浓度的净荧光信号、将浓度量与净荧光信号的对数值的关系绘制在图上并进行回归分析以得到校准曲线来制作。
17.权利要求16的方法，其中微生物物质的所述已知浓度通过平板计数方法测定。
18.权利要求1的方法，其还包括根据本底信号调整净荧光信号。
19.权利要求18的方法，其中所述方法还包括根据本底信号调整净荧光信号，所述方法还包括得到另外的水介质部分作为本底水介质部分，处理本底水介质部分以除去微生物物质，将荧光染料加到经处理的本底水介质部分中，测定经处理的本底水介质部分中的荧光信号以得到本底基线荧光信号，在本底水介质部分中模拟裂解过程，测定经模拟后的本底水介质部分中的荧光信号以得到第二本底荧光信号，从第二本底荧光信号中减去本底基线荧光信号以得到净本底信号，根据净本底信号调整净荧光信号并使经调整的净荧光信号等同于微生物含量。
20.权利要求19的方法，其中将所述本底水介质部分经物理或化学处理。
21.权利要求20的方法，其中所述本底水介质部分通过在40℃-100℃的温度下加热本底水介质1分钟-1小时来处理。
22.权利要求20的方法，其还包括将杀生物剂加到本底水介质中。
23.测定含有有机或非细胞组分的水介质中总微生物含量的方法，所述方法包括：
向水介质部分中加入荧光染料；
得到另外的水介质部分作为本底水介质部分；
处理本底水介质部分以除去微生物物质；
将荧光染料加到经处理的本底水介质部分中；
测定水介质部分中的荧光信号以得到基线荧光信号；
测定经处理的本底水介质部分中的荧光信号以得到本底基线荧光信号；
通过裂解微生物物质将微生物物质的胞内内容物释放到水介质部分中；
在本底水介质部分中模拟裂解过程;
测定含有所释放的微生物胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号；
测定经模拟后的本底水介质部分中的荧光信号以得到第二本底荧光信号；
从第二荧光信号中减去基线信号以得到净荧光信号；
从第二本底荧光信号中减去本底基线荧光信号以得到净本底信号；
根据净本底信号调整净荧光信号；和
使经调整的净荧光信号等同于微生物含量，
其中所述荧光染料为不对称的花青染料。
24.权利要求1的方法，其中所述微生物含量包括生物膜的含量且其中所述方法还包括去除和分散在水介质中的生物膜。
25.权利要求24的方法，其中所述生物膜通过搅动或涡旋水介质物理去除。
26.权利要求24的方法，其中所述生物膜通过在水介质中使用超声处理探针振动而机械去除。
27.权利要求24的方法，其中所述生物膜是在暴露于电场时从表面去除。
28.权利要求24的方法，其中所述生物膜通过使用表面活性剂、生物分散剂或其混合物化学去除。
29.权利要求24的方法，其还包括计算生物膜所附着的每单位表面积的微生物量。
30.权利要求24的方法，其还包括根据本底荧光信号调整净荧光信号。
31.测定含有有机或非细胞组分的水介质中生物膜含量的方法，所述方法包括：
将生物膜分散到水介质中；
向水介质中加入荧光染料；
测定水介质中的荧光信号以得到基线荧光信号；
将微生物物质的胞内内容物释放到水介质中；
测定含有所释放的微生物物质的胞内内容物的水介质中的荧光信号以得到第二荧光信号；
从第二荧光信号中减去基线荧光信号以得到净荧光信号；和
使净荧光信号等同于微生物含量，
其中所述荧光染料为不对称的花青染料。
32.测定流经其中具有细胞微生物组分且其中具有非细胞有机组分的循环回路的水介质中总微生物含量的体系，所述体系包括：
过滤器组件，其包括具有5-50微米的孔径的过滤器，用于从进入所述体系的水介质中除去杂质；
样品制备组件，其经构造以向水介质中加入荧光染料，其中所述荧光染料为不对称的花青染料；
裂解组件，其经构造以接触所述水介质的至少一部分并将所述细胞微生物组分的胞内内容物释放到水介质中；
检测组件，其中具有光学测定单元，所述光学测定单元经构造以测定来自水介质样品中的所述非细胞有机组分的荧光信号以得到基线荧光信号，并且以测定来自与裂解组件接触的所述部分的水介质中的所述非细胞组分和所述胞内内容物的荧光信号以得到第二荧光信号；
导向组件，其有效地连接至所述循环回路、至所述样品制备组件、至所述裂解组件、并连接至所述检测组件，所述导向组件经构造以将所述水介质的至少一部分通向与所述裂解组件接触；和
控制组件，其有效地连接至所述导向组件并连接至所述检测组件并构造成从第二荧光信号中减去基线荧光信号以得到净荧光信号并使所述净荧光信号等同于水介质的微生物含量。
33.权利要求32的体系，其中所述荧光染料使用试剂加料泵加到水介质中并用混合装置混合。
34.权利要求32的体系，其中所述检测组件包括荧光计，所述荧光计包括构造成围绕反应管的具有350nm-600nm的激发波长和450nm-650nm的发射波长的至少一对发光二极管(LED)和光电二极管发射检测器。
35.权利要求32的体系，其中所述裂解组件包括使水介质的温度升高的温度控制单元。
36.权利要求35的体系，其中所述温度控制单元使水介质的温度升高到40℃-100℃的温度以裂解细胞。
37.权利要求32的体系，其中所述控制组件使用校准曲线使净荧光信号等同于微生物浓度。
38.测定流经其中具有细胞微生物组分且其中具有非细胞有机组分的循环回路的水介质中总微生物含量的体系，所述体系包括：
用于从进入所述体系的水介质中除去杂质、包括具有5-50微米的孔径的过滤器的过滤器组件；
经构造以向水介质中加入荧光染料的样品制备组件，其中所述荧光染料为不对称的花青染料；
测定来自水介质中的所述非细胞有机组分的荧光信号以得到基线荧光信号的设备；
通过裂解微生物组分将微生物组分的胞内内容物释放到水介质中的设备；
测定来自含有裂解的微生物组分的水介质中的所述非细胞有机组分和所述胞内内容物的荧光信号以得到第二荧光信号的设备；和
将来自所述循环回路的所述水介质的至少一部分通向所述样品制备组件、至所述测定设备且在使所述水介质通向所述测定设备之前将来自所述样品制备组件的所述水介质的至少一部分通向所述释放设备的设备；和
有效地连接至所述导向设备并连接至所述检测设备并构造成从第二荧光信号中减去基线荧光信号以得到净荧光信号并使所述净荧光信号等同于水介质的微生物含量的控制组件。
39.权利要求38的体系，其中所述荧光染料使用试剂加料泵加到水介质中并用混合装置混合。
40.权利要求38的体系，其中测定荧光信号的设备包括荧光计，所述荧光计包括构造成围绕反应管的具有350nm-600nm的激发波长和450nm-650nm的发射波长的至少一对发光二极管(LED)和光电二极管发射检测器。
41.权利要求38的体系，其中裂解微生物物质的设备包括使水介质的温度升高的温度控制单元。
42.权利要求41的体系，其中所述温度控制单元使水介质的温度升高到40℃-100℃的温度以裂解细胞。
43.权利要求38的体系，其中所述控制组件使用校准曲线使净荧光信号等同于微生物浓度。
44.测定流经其中具有细胞微生物组分且其中具有非细胞有机组分的循环回路的水介质中总微生物含量的体系，所述体系包括：
过滤器组件，其包括具有5-50微米的孔径的过滤器，用于从进入所述体系的水介质中除去杂质；
样品制备组件，其经构造以向水介质中加入荧光染料，其中所述荧光染料为不对称的花青染料；
裂解组件温度控制单元，其经构造以加热水介质的至少一部分到40℃-100℃的温度以将微生物成分的胞内内容物释放到水介质中；
检测组件，其中具有荧光计，所述荧光计经构造以测定来自水介质样品中的所述非细胞有机组分的荧光信号以得到基线荧光信号并且测定来自与所述裂解组件接触的所述部分的水介质中的所述非细胞组分和所述胞内内容物的荧光信号以得到第二荧光信号，其中所述荧光计包括构造成围绕反应管的具有350nm-600nm的激发波长和450nm-650nm的发射波长的至少一对发光二极管(LED)和光电二极管发射检测器；
导向组件，其有效地连接至所述循环回路、至所述样品制备组件、至所述裂解组件、并连接至所述检测组件，所述导向组件经构造以将所述水介质的至少一部分通向与所述裂解组件接触；和
控制组件，其有效地连接至所述导向组件、连接至所述温度控制单元并连接至所述检测组件，且构造成从第二荧光信号中减去基线荧光信号以得到净荧光信号并使所述净荧光信号等同于水介质的微生物含量。
45.权利要求44的体系，其中所述荧光染料的存在量为0.5mg-100mg荧光染料/升水介质。
46.权利要求44的体系，其中所述总微生物物质以低于104菌落形成单位/ml所述水介质的浓度测定，且其中所述总微生物含量在小于5分钟的时间内测定。
47.权利要求44的体系，其中所述循环回路为冷却塔水体系的一部分。
48.权利要求32的体系，其中所述荧光染料的存在量为0.5mg-100mg荧光染料/升水介质。
49.权利要求32的体系，其中所述总微生物物质以低于104菌落形成单位/ml所述水介质的浓度测定，且其中所述总微生物含量在小于5分钟的时间内测定。
50.权利要求32的体系，其中所述循环回路为冷却塔水体系的一部分。
51.权利要求38的体系，其中所述荧光染料的存在量为0.5mg-100mg荧光染料/升水介质。
52.权利要求38的体系，其中所述总微生物物质以低于104菌落形成单位/ml所述水介质的浓度测定，且其中所述总微生物含量在小于5分钟的时间内测定。
53.权利要求38的体系，其中所述循环回路为冷却塔水体系的一部分。
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