CN102174536A

CN102174536A - 用于重组腺病毒的包装细胞

Info

Publication number: CN102174536A
Application number: CN2011100542020A
Authority: CN
Inventors: 罗纳德·福格尔斯; 门佐·扬斯·埃姆科·哈文戈; 戴维·A·T·M.·祖伊德格斯特
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2004-10-04
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2024-10-04
Also published as: NZ545501A; BRPI0414670A; US20060183232A1; EP1670925B1; CN1863918A; EA010924B1; IL174489A; IL174489A0; KR101203817B1; AU2004278517A1; JP2007507216A; CA2538025C; US8114637B2; CN1863918B; EA200600693A1; IL227543A; JP4749334B2; CN102174536B; US20100311172A1; AU2004278517B2

Abstract

在重组腺病毒载体与包装细胞的基因组之间没有实质上的序列重叠的情况中，辅助病毒依赖性含E1颗粒(helper dependent E1-containing particles，HDEP)可以以低频率形成。本发明提供了降低或防止HDEP产生的方式和方法。为此，本发明提供了新的包装细胞和产生它们的方法。

Description

用于重组腺病毒的包装细胞

本申请为申请日为2004年10月4日、申请号为200480028695.9、发明名称为“用于重组腺病毒的包装细胞”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及分子和细胞生物学领域，更特别涉及包装细胞及其在产生成批的重组腺病毒中的应用。

发明背景

复制缺陷的重组腺病毒在例如基因治疗及免疫接种目的中是有用的。它们通常缺少腺病毒的E1区域，并因此在提供E1序列的互补细胞上增殖。所述包装细胞(packaging cell)提供了被包装在细胞内以形成重组病毒颗粒的载体复制需要的所有信息。包装细胞例如是293细胞，其包含腺病毒5基因组的第1-4344位核苷酸(Louis et al，1997)，所述核苷酸包括5’反向末端重复(ITR)、包装信号、E1A和E1B编码序列及pIX编码序列。包装细胞和载体中腺病毒序列之间的重叠可引起这些序列之间的同源重组，导致有复制能力的腺病毒(RCA)产生(Lochmuller et al.，1994)。这个问题已经通过使用由通过缺少这种重叠序列而彼此匹配的细胞系和载体组成的包装系统解决(Fallaux et al，1998；美国专利5,994,128)。这种应用中特别有用的细胞系例如是PER.C6细胞系(美国专利5,994,128；Nichols et al，2002)。

最近报道了基于PER.C6细胞和包含与PER.C6

基因组中E1序列仍具有177bp序列同源性的载体的联合应用，一个单交换事件可导致辅助病毒依赖性有复制能力的病毒以低频率产生(Murakami et al，2002)。产生的非典型RCA称为辅助病毒依赖性含E1颗粒(helper-dependent E1 containing particle，HDEP)。正如所期望的，当使用缺少与PER.C6

细胞基因组中E1序列重叠的序列的载体时，避免了这种类型颗粒的出现(Murakami et al，2002)。

然而，当前出乎意料地出现当使用匹配的载体和PER.C6

细胞的系统时，一些批次的重组腺病毒以极低频率被可在缺少E1序列的细胞中导致致细胞病变(CPE)的颗粒污染。这种颗粒是辅助病毒依赖性的并且包含E1序列，并且因此也是HDEP。这个HDEP是在载体与包装细胞之间没有实质同源性的情况中产生的(见Murakami et al，2004)。虽然RCA作为潜在问题而由管理机构所公认并且各批次用于临床的RCA的检测是强制性的(USDHHS，FDA，CBER.Guidance for Industry，Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy，March 1998)，但HDEP安全性还不清楚。HDEP不能复制，因为其缺少自主复制必需的病毒基因并因此HDEP在宿主中不传播。然而在同一细胞中存在重组载体或野生型腺病毒可导致HDEP的拯救和传播的理论可能性不能被完全排除。因此，至少潜在地需要在重组腺病毒颗粒批量生产期间防止产生包含E1的颗粒的方式和方法。为此，本发明提供了制备新的细胞系的方法、新的细胞系及其在批量生产无RCA和无HDEP的重组腺病毒载体中的应用。

附图简述

图1：pIG.E1A的图谱。

图2：pIG.E1AB21的图谱。

图3：pE1B的图谱。

图4：pCC.E1A的图谱。

图5：pCC.E1AB21的图谱。

图6：pCC101的图谱。

图7：pCC105的图谱。

图8：pCC.55Kcol的图谱。

图9：pIG.E1B的图谱。

图10：pCC.E1Bcol的图谱。

图11：pEC.E1B的图谱。

图12：pSC.55K的图谱。

图13：适于转化原代细胞的大分子的设计实例。

I：具有侧翼为间隔DNA(spacer DNA)的E1A和E1B蛋白编码区(分别为A和B)的单粘粒载体的示意图。RE＝在所述间隔DNA或E1序列中不存在的限制酶识别位点。

II：具有侧翼为间隔DNA的E1A(A)或E1B(B)编码区的两个单独核酸(例如质粒或粘粒载体)的示意图。

III：在用I的分子或者II的两种分子转化并整合进原代细胞的宿主细胞基因组后可能发生的情况。在所述宿主基因组中，插入体由通过间隔DNA分隔的E1A区域和E1B区域及反向的该片段/这些片段的第二个拷贝组成。J：反向重复之间的连接处。如果这些序列的一部分(箭头所指)重组在重组腺病毒中，则基因组变得太大而不能被包装。ITR：反向末端重复，Φ：包装信号，FI：插入重组病毒中的片段，在此包括反向重复序列。尽管反向重复的存在可协助从病毒基因组中删除其它序列的后续必需步骤，但是反向重复序列的存在导致在病毒基因组复制期间重组病毒的左端镜像复制，并且产生还是由于间隔DNA的存在而太大以至不能被包装的基因组(复制的片段，DF)。

图14：pIG.E1A.E1B的图谱。

图15：pCC200的图谱。

图16：pCC205的图谱。

图17：pdys44的图谱。

图18：p44-l.ccE1A的图谱。

图19：来自产生的细胞系的蛋白质裂解物的Western印迹。泳道1：HER01-B-71，泳道2：HER01-H-86，泳道3：HER01-H-87，泳道4：HER01-H-88，泳道5：HER01-H-89，泳道6：HER01-B-90，泳道 7：HER01pn06细胞，泳道8：PER.C6细胞。

图20：E1缺失的腺病毒载体与转化的细胞克隆互补的实证。-：阴性对照；MOF：平均荧光；B-71、B-90、H-86、H-87、H-88、H-89：所产生的转化的细胞克隆。

图21：用于实施例3中的转染的Ad5.E1构建体的示意图。图中标示了用于消化基因组DNA及用于产生探针片段的限制位点。假定E1A和E1B DNA片段与在包含E1的片段的5’末端开始编号的核苷酸连接。

图22：本发明的一些实施方案的示意图(不按比例)。调节序列(如启动子和polyA信号)未描述。

A.腺病毒基因组的E1区域的天然构型：E1A后接E1B，E1B由E1B-19K和E1B-55K组成。在E1A和E1B之间不存在间隔序列。通过在这种构型中导入DNA构建了现有技术的包装细胞，并因此在所述包装细胞基因组中也具有这种构型的E1区域。

B.本发明的两个最简单的可能构型，其中E1区域中存在间隔(或填充片段)。1.在E1A与E1B-19K之间导入的填充片段。2.在E1B-19K与E1B-55K之间导入的填充片段。这是为了与天然情况相对比增加E1A、E1B-19K和E1B-55K之间的距离，从而降低这三个开放读框同时被摄取到一个腺病毒颗粒中的可能性或完全防止这种摄取(防止RCA和HDEP)。所述填充片段应该是至少4kb以获得本发明的细胞系，所述细胞在其基因组中包含腺病毒E1A及E1B-55K和E1B-19K编码序列，特征在于所述细胞基因组中缺少E1A和两个E1B编码序列间隔少于4kb的核苷酸序列节段。所述开放读框的顺序无关紧要，只要它们均以存在E1A、E1B-19K和E1B-55K表达的方式存在于基因组中即可。因此，所述顺序可以是E1A-E1B/19k-E1B/55k、E1B/19k-E1B/55k-E1A、E1B/55k-E1B/19k-E1A、E1B/55k-E1A-E1B/19k或E1B19k-E1A-E1B55k。当E1B/19k与 E1B/55k相邻时，它们可以作为一个单一转录单位或者作为分开的转录单位而存在，这对于本发明无关紧要。这两个构型(1和2)都能产生满足本发明这个间隔标准的细胞系。至少为6、8、10、15或34.5kb的填充片段长度可以产生本发明的在基因组中具有所有三个开放读框但缺少其中所述E1A和两个E1B编码序列间隔少于6、8、10、15或34.5kb的核酸序列节段的细胞。这意味着与A中的情况相反，当包含E1A+E1B-19K+E1B-55K的一个片段来自所产生的细胞的基因组时，这个片段应至少为7kb(填充片段4kb)、9kb(填充片段6kb)等，直至至少37.5kb(填充片段34.5kb)，而在A的情况中，这些序列可见于用这种构建体产生的包装细胞的基因组中仅3kb的片段中(E1A+E1B-19K+E1B-55K开放读框包含大约3kb)。

C.B的原理的延伸：由于B所示片段可以彼此相邻整合，因此在本发明的优选实施方案中填充片段也可置于E1A之前和/或E1B之后(防止第一个重复的E1B与第二个重复的E1A紧密相近)。图中示出了所得包装细胞的基因组，其中当在串联重复中彼此相邻整合时E1区域的两个拷贝之间有填充片段DNA。本发明的这些包装细胞在其基因组中整合进了E1A和E1B-19K及E1B-55K，但基因组中不包含其中所述E1A和两个E1B编码序列之间间隔少于4kb等的核酸节段，这取决于填充片段的长度(在这个实施例中E1A与E1B-19K之间(no.1)或者E1B-19K与E1B-55K之间(no.2)应为至少4kb，并且位于E1A上游至少2kb及E1B-55K下游2kb(当直接相邻整合时为4kb))。

发明描述

本发明描述了产生包含腺病毒E1A和E1B序列的包装细胞的方法，其中E1A与至少一个E1B编码区域在所述细胞的基因组中是彼此分隔的。为此，本发明提供了至少三个实施方案。在第一个实施方案中，E1A和E1B可以在不同时间导入前体细胞中，减少E1A和E1B 共同整合在相同染色体位置上的机会。在第二个实施方案中，通过将E1A和E1B编码序列在缺少可导致这些序列之间同源重组的重叠序列的两个不同分子上导入前体细胞中而减少共同整合在相同基因座上的机会。在第三个实施方案中，E1A和至少一个E1B编码区通过一个核酸分子导入，在所述核酸分子上这些序列以特定距离分隔。应该清楚在第三个实施方案中，也可以不是一个核酸分子而是两或多个核酸分子被导入，其应满足E1A和至少一个E1B编码区以特定距离相间隔的标准，以防止这两或多个分子例如通过连锁、重组等方式形成一个分子。所得包装细胞特征在于E1A和两个E1B编码区彼此以一定距离存在，并因此减少了E1A和两个E1B编码序列一起掺入在这种包装细胞上增殖的重组腺病毒基因组中的机会。

本发明提供了一种制备能互补E1缺陷的腺病毒载体而不产生辅助病毒依赖性含E1颗粒的细胞的方法，包括如下步骤：a)将编码E1A基因功能和E1B基因功能的核酸序列导入前体细胞或祖细胞中，或者如果所述前体细胞已经包含一种E1A或E1B基因功能，则导入编码另一种E1A和E1B基因功能的核酸序列；b)选择或鉴别具有获得的E1A和E1B的细胞，其中所述E1A和E1B以当所述细胞被用于互补一或多种E1基因功能缺陷的重组腺病毒载体时防止辅助病毒依赖性含E1颗粒形成的染色体构型存在，所述载体缺少可能导致同源重组的与位于染色体上的E1序列实质上重叠的核酸序列。

一方面，本发明提供了一种制备在基因组中具有腺病毒E1A和E1B-19K及E1B-55K编码序列的细胞，其中包含所述序列的核酸序列被导入前体细胞中，所述方法特征在于：a)包含所述序列的至少两个核酸分子一起被导入所述前体细胞中，其中所述E1A和至少一个E1B编码序列存在于不同的核酸分子上，其在不同的时间被导入所述前体细胞中，其中所述前体细胞不是幼大鼠肾细胞；或者b)包含E1A编码序列的核酸分子和包含E1B编码序列的核酸分子被导入所述前体细胞中，其中所述核酸分子缺少可导致在所述至少两个分子之间同源重组的实质上的重叠；或者c)所述包含E1A和至少一个E1B编码序列的核酸序列在一个核酸分子或者当这些序列会形成一个单一核酸分子时它们在两或多个核酸分子上间隔至少4kb。优选地，在实施方案c)中，所述序列间隔至少10kb，更优选至少34.5kb或者更多。优选地，所述分隔序列是非E1序列，由此非常不可能或不能发生E1A和E1B的表达盒整合在一个单一病毒基因组中。或者，当所述E1A和至少一个E1B序列间隔0-15kb时，可在产生的细胞中筛选缺乏E1序列的反向重复，以选择其中当重组腺病毒在产生的细胞中增殖时产生HDEP的可能性降低或不存在的细胞。本发明还提供了可以通过本发明的方法获得的细胞。本发明进一步提供了在其基因组中包含腺病毒E1A及E1B-55K和E1B-19K编码序列的细胞，特征在于所述细胞基因组缺少其中所述E1A和两个E1B编码序列间隔少于4kb的核酸序列节段。优选地，所述细胞基因组缺少其中所述E1A和两个E1B编码序列间隔少于10kb的核酸序列节段，更优选地，所述细胞基因组缺少其中所述E1A和两个E1B编码序列间隔少于34.5kb的核酸序列节段。

本发明的另一方面提供了一种提供或产生包含腺病毒E1序列的细胞的方法，其中所述E1序列包括E1A和E1B编码序列，特征在于所述方法包括选择缺少包含所述E1序列的反向重复的细胞的步骤。本发明进一步提供了一种在其基因组中包含腺病毒E1序列的细胞，其中所述E1序列包括E1A和E1B编码序列，特征在于所述E1序列在所述基因组中不是以反向重复形式存在。在一个实施方案中，所述细胞在其基因组中包含所述腺病毒序列的至少两个拷贝，所述拷贝可以在同一染色体上。在另一个实施方案中，所述细胞在其基因组中包含所述E1序列的一个拷贝，并在其基因组中进一步缺少编码腺病毒(功能性)pIX的序列。

本发明另一方面提供了一种产生一批在E1区域具有缺失的重组腺病毒的方法，包括如下步骤：a)将所述重组腺病毒导入包含能互补所述重组腺病毒缺失的E1序列的腺病毒E1序列的细胞中；b)培养所述细胞并收获所述重组腺病毒，所述方法特征在于所述细胞是根据本发明的细胞。本领域技术人员清楚不导入所述重组腺病毒，也可以通过使用能形成所述重组腺病毒基因组并且在复制后及在所述细胞中包装后形成所述重组腺病毒的一或多个核酸片段开始产生重组腺病毒。因此，对于这个实施方案，重组腺病毒也可以是所述重组腺病毒的基因组。在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒与所述细胞中存在的E1序列缺少可导致同源重组的实质上的序列重叠。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包装系统，其包含在基因组中包含E1序列的包装细胞和在E1区域具有缺失的重组腺病毒载体，其中所述载体的基因组与所述包装细胞的基因组中的E1序列缺少实质上的重叠，特征在于所述包装细胞是根据本发明的细胞。

发明详述

有复制能力的腺病毒(RCA)是在细胞中不需要辅助腺病毒即可复制的腺病毒颗粒。本文所用HDEP(helper dependent E1-containing particle)是指包含腺病毒的至少E1A和E1B-55K编码序列的病毒颗粒，所述颗粒在缺少功能性E1A和/或E1B-55K的细胞中在没有“辅助病毒”存在的情况下不能复制。辅助病毒可以是野生型或突变的腺病毒，但也可以是提供HDEP中丧失的功能的任何腺病毒载体，并因此可以提供在包装细胞上增殖的(E1缺陷的)希望的重组腺病毒产物。E1A和E1B 55K序列是腺病毒增殖所必需的。HDEP通常进一步包含E1B-19K编码序列。HDEP中存在的E1序列应能互补重组的E1缺陷的腺病毒，所述重组的E1缺陷的腺病毒可作为HDEP的辅助病毒。HDEP可以通过包装细胞和载体中E1序列之间的重叠引起的同源重组而产生(Murakami et al，2002)，但目前出乎意料地从一些研究中显示HDEP可以在包装细胞与载体的序列之间没有实质上的同源/重叠的情况中产生，即通过在此称作非同源重组的程序进行(见例如Murakami et al，2004针对HDEP的可能结构所述)。本文所用“实质上的重叠”是指对于同源重组足够的重叠。在本发明称为“不具有实质上的重叠”的实施方案的任何情况中，如果重叠不超过50个核苷酸(nt)、优选少于40nt，更优选少于30nt，更优选少于20nt，更优选少于10nt，最优选根本不重叠，则认为达到这个条件。

尽管HDEP的形成机制目前还不充分明了，但清楚E1序列源自包装细胞的基因组。重组腺病毒批次中E1序列的存在是不希望的，因为其是RCA或HDEP形式。本发明提供了使得产生HDEP的机会最小化的方法和方式。另外，本发明提供了制备细胞的方法并提供了所得细胞，其中所述细胞具有以这样一种染色体构型存在的E1A和E1B：所述染色体构型防止E1A和E1B编码序列一起导入重组腺病毒中，并且因此当细胞用于互补E1缺陷的重组腺病毒载体时，并在所述载体与位于本发明的互补细胞染色体上的E1序列之间不具有实质上的重叠时，防止形成HDEP。为此，本发明的一个实施方案的细胞的染色体构象是E1A和至少一个E1B编码区在新细胞的基因组中是分隔的。由于确信反向重复通过刺激腺病毒序列的缺失而有助于HDEP的形成，因此在本发明的另一个实施方案中提供了包含E1A和E1B编码序列的细胞，其中E1序列在所述包装细胞的基因组中的反向重复构象中不存在。

本发明的细胞在其基因组中包含腺病毒E1A和E1B编码序列，优选在其基因组中包含所有功能性E1A和两个E1B(E1B-55K和E1B-19K)蛋白的编码序列。根据本发明，E1A和至少一个E1B蛋白可以是相同或者任选是不同血清型的。

优选地，在这些实施方案中，至少一个E1A和E1B是由分别与 E1A和E1B启动子不同的启动子调节的。

本发明的细胞

重组腺病毒从其增殖的细胞系中可以获取＞20kb的DNA，使得可以有效包装的腺病毒的最大基因组长度是大约38kb(对于基于腺病毒5型的载体而言，这个数字可能略微依赖于血清型)。这个特征用于制备根据本发明的新的互补细胞，所述细胞包含E1A和E1B编码序列，所述细胞特征在于在所述基因组中所述E1A和至少一个E1B序列间隔至少4kb，优选至少10kb，更优选至少34.5kb。这意味着这种细胞的基因组缺少其中所述E1A和两个E1B编码序列间隔分别少于4、10或34.5kb的核酸序列节段(见例如图22的示意图所示)。应清楚无论在什么情况下本发明提及在细胞基因组中两个序列间隔至少一定距离时，当这两个序列存在于分离的染色体上时则认为达到这个要求。因此，如本文所用，这两个序列位于不同的染色体上的实施方案可以解释为包括在在基因组中“分开至少x kb”或“间隔至少x kb”的含义内。

这种实施方案可通过本领域技术人员已知的方法简单检测，例如通过荧光原位杂交(FISH)，其可用于确定特定序列所在的染色体和/或染色体位置。

本发明的细胞在其基因组中包含腺病毒序列，优选所述腺病毒序列编码所有E1蛋白但缺少编码pIX或其一部分的序列(即这种细胞优选不包含来自pIX开放读框的序列(对于具有Ad5E1序列的细胞而言，这意味着它们优选不包含野生型Ad5的第3609-4031位核苷酸或其一部分)，更优选它们在pIX启动子中也具有缺失(对于具有Ad5E1序列的细胞而言，优选自第3550更优选自3525位核苷酸下游无pIX启动子序列)，以防止与具有在其自身启动子控制下的pIX的腺病毒载体明显重叠。包装细胞基因组中不存在pIX序列有助于防止所述基因组与重组腺病毒载体之间的重叠(美国专利5,994,128)。

本发明的细胞可衍生自永生化的细胞如A549、Hela等，在这种情况中需要选择标记以确定细胞。优选地，本发明的细胞衍生自原代细胞，在这种情况中通过E1A和E1B转化活性提供选择(见实施例)。在优选的方面，所述细胞衍生自视网膜细胞。它们可以是任何来源的细胞，包括人源的细胞。为增殖人腺病毒，优选人源细胞。所述细胞例如也可以是牛源的，以增殖重组牛腺病毒(美国专利6,379,944)。细胞的来源可以由本领域技术人员选择，以与所选择的重组腺病毒相容。

一方面，所述细胞衍生自原代人视网膜细胞(也称作HER细胞)。具有腺病毒E1序列的这种细胞的永生化例如在美国专利5,994,128，Byrd等1982、1988及Gallimore等1986所述。原代HER细胞可分离自胚胎(Byrd et al，1982，1988)。在其它实施方案中，所述细胞衍生自原代人胚胎肾细胞(见例如Graham et al，1977)。在另外的实施方案中，所述细胞衍生自原代羊水细胞，如人原代羊水细胞(见例如美国专利6,558,948对于具有腺病毒E1序列的原代羊水细胞永生化的方法所述)。

细胞的产生

本发明的细胞可以通过将腺病毒E1A和E1B-55K及E1B-19K编码序列导入前体细胞或祖细胞中而产生(因此所述细胞通过向其中导入E1序列而衍生自前体细胞或祖细胞)。根据本发明，所述E1A和至少一个E1B编码序列以未连锁的方式被导入所述前体细胞中。如在这种涵义下所用的“未连锁的”是指与在腺病毒中发现的E1A和E1B的天然构型即彼此直接相邻(见例如图14，其中以存在于质粒pIG.E1A.E1B中的形式示出E1A和E1B的天然的即连锁的构型pIG.E1A.E1B)不同的一种构型。注意在本发明之前，希望获得在其基因组中包含腺病毒E1A和两个E1B编码序列的包装细胞的本领域技术人员不会设想将E1A和至少一个E1B序列以未连锁形式导入，因为：a)这需要更多的工作并因此不方便，b)E1A和E1B序列均需要永生化。先前为了获得对E1A和E1B蛋白的转化能力的深入了解所进行的研究已经表明E1A和至少一个E1B编码序列的导入可确立克隆(van den Elsenet.al.，1982；Gallimore etal.，1986；Jochemsen et al.，1987；Rao etal.，1992；Nevels etal.，2001)。然而，这些质粒的同时导入和/或导入的序列例如质粒序列、调节序列如启动子和/或聚腺苷酸化信号、及E1B-55K和E1B-19K重叠序列之间的重叠很可能导致E1A和两个E1B编码区共同整合在基因组中的同一基因座上。van den Elsen et al(1982)确实观测到了这种共同整合。在一种情况中(Jochemsen et al.，1987)，将幼大鼠肾(BRK)细胞首先用E1A转染，然后将挑选的克隆用E1B质粒转染，以研究E1B表达对E1A表达的影响。显而易见这项研究是在特殊类型的细胞上进行并因此与本申请描述的发明不相关。在本发明之前，为了产生包装细胞，没有分别转染E1A和至少一个E1B编码序列以产生包装细胞的理由。迄今为止没有关于在重组腺病毒的基因组与包装细胞之间不具有实质上的重叠的情况下形成HDEP的描述。另外，本领域技术人员事实上被劝阻不要使用这种方法获得除了BRK衍生的细胞之外的细胞例如人细胞，因为Gallimore et al.(1986)已经描述了人细胞通过仅表达E1A而仅罕见地发生形态学转化，大多数克隆原位死亡或者分离后立即死亡。Ad12(亚组A)E1A表达质粒产生一个克隆的唯一情况是在转染后114天鉴别并且仅可以在该克隆在培养皿中过度生长后挑取。显然，本领域技术人员在现有技术的基础上没有理由将E1A和至少一个E1B基因在不同时间导入前体细胞中。本发明的优点在于提供了获得在其基因组中具有分隔的E1A和至少一个E1B编码序列的细胞的这些方法。在某些方面，本发明的细胞优选不是幼大鼠肾(BRK)细胞。在一优选的方面，本发明的细胞是人细胞。在一优选的方面，所述细胞衍生自HER细胞。应清楚其中根据本发明导入了E1序列的细胞在所述导入之前在其基因组中优选没有腺病毒E1A和E1B编码序列，只是在导入所述序列后才在其基因组中获得E1序列，从而成为永生化的并且能包装E1区域中具有缺失的重组腺病毒。例如，WO03/031633描述了将Ad11E1B-55k导入293细胞中：显而易见这样不能产生本发明的优点，因为已经存在于293细胞中的E1序列保持在原始构型中并且具有与E1A ORF间隔不到4kb的E1B ORF。相反，本发明提供了在其基因组中产生具有腺病毒E1A及E1B-19K和E1B-55K编码序列的细胞的方法，以及得自该方法的细胞，由此包含E1A和至少一个E1B编码序列的核酸序列彼此充分分隔，以防止细胞基因组的所有E1A和E1B序列同时导入一个单一腺病毒颗粒的基因组中。

根据产生本发明的细胞的第一个实施方案，E1A和至少一个E1B编码序列是通过将它们放置在在不同时间导入所述细胞的不同分子上而分别导入所述前体细胞中的，并且所述前体细胞不是BRK细胞。在一个实施方案中，首先导入E1A和E1B-21K编码序列，稍后导入E1B-55K编码序列。

根据产生本发明的细胞的第二个实施方案，包含所述E1A和所述E1B编码序列的至少两个核酸分子一起导入所述前体细胞中，特征在于所述至少两个核酸分子不具有实质上的重叠序列。确信这种重叠序列的存在至少以一些方式增强所述至少两个分子之间的相互作用，及随后所述分子上的序列共同整合进导入所述分子的前体细胞基因组的同一基因座的可能性，而本发明的一个目的就是解决这个问题。在一个实施方案中，至少一个E1A和E1B编码区被置于不同的异源调节序列如启动子和聚腺苷酸化序列的控制下。在另一个实施方案中，重叠的E1B-55K和E1B-19K序列是分隔的并且这些编码序列之间的所有重叠根据本领域技术人员已知的方法使用遗传密码冗余性知识通过遗传工程除去，从而使得可以独立地导入这些E1B编码序列并且彼此不连锁。在这个实施方案中，E1A和E1B编码区的导入可以是同时进行的，例如通过共转染所述至少两个分子，但是显然也可以组合第一个和第二个实施方案，即导入至少两个分子，所述至少两个分子包含一起包含E1A和两个E1B编码序列的核酸序列，其中所述至少两个分子彼此不具有实质上的重叠，且其中所述至少两个分子在不同时间导入前体细胞。

在第三个实施方案中，编码E1A和至少一个E1B编码序列的序列通过将它们置于一个单一核酸分子上而不连锁，其中所述E1A和至少一个E1B编码序列(显然这可以是两个E1B编码序列)间隔至少4kb，优选至少6kb，更优选至少8kb，更优选至少10kb，更优选至少15kb，最优选至少34.5kb核酸，在本文该核酸称作“间隔(spacer)”或“填充片段(stuffer)”核酸。间隔核酸序列可以有利地具有前述间隔核酸序列的性质，特别是所述序列不具有E1A和E1B编码序列，可以组合至少部分内含子序列，并且可以包含E1A和/或E1B编码序列的调节序列。本领域技术人员随即清楚在第三个实施方案的等效变化中，所述E1A和至少一个E1B编码序列可以存在于不同的核酸分子上而不是存在于一个分子上(见例如图13I、II，及例如实施例3所述)，只要当所述不同的核酸分子例如通过(同源)重组或连接或末端与末端连接而形成一个单一分子时，所述序列仍间隔至少指定距离即可。这个观点在E1A和至少一个E1B编码序列当整合进前体细胞基因组时间隔至少4kb、优选至少6kb、更优选至少8kb、更优选至少10kb、更优选至少15kb、最优选至少34.5kb的情况中也是如此(见例如实施例3和图21所述)。换句话说，本发明的第三个实施方案可因此通过将包含E1A及E1B-19K和E1B-55K编码序列的一个核酸分子(“分子A”)导入前体细胞中而进行，这三个编码序列的至少两个序列间隔至少4kb(实施方案3a)；或者相等地通过导入两或多个核酸分子而进行，当这些分子形成一个单一核酸分子时将形成“分子A”(实施方案3b)。在第三个实施方案的某些方面，在E1A和E1B侧翼的间隔核酸之间不具有实质上的重叠序列，在E1A和E1B编码序列的调节序列中也没有实质上的重叠序列，以减少这些分隔的序列之间相互作用和可能的同源重组的机会。

编码E1A和E1B的重组分子

一方面，本发明提供了一种包含编码腺病毒E1A蛋白和至少一种腺病毒E1B蛋白的核酸序列的重组分子，特征在于所述编码E1A的核酸序列和所述编码至少一个E1B蛋白的核酸序列间隔至少4kb，优选至少10kb，更优选至少34.5kb。这种分子可用于本发明的方法中以产生本发明的细胞。这种分子可以是本领域技术人员已知的各种形式，如质粒、粘粒、细菌人工染色体、YAC等等。

在一个等价的实施方案中，所述E1A和E1B蛋白编码核酸最初以单独的分子存在也是可能的。这种分子可任选通过同源重组、连接、位点特异性重组、末端与末端连接等而能形成一个单一分子。因此本发明的一个方面提供了一套至少两个核酸分子，其包含：a)编码腺病毒E1A蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子在所述E1A编码序列的两侧均具有至少5kb、优选至少17kb的间隔核酸序列，所述间隔核酸不编码E1B蛋白；b)编码腺病毒E1B蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子在所述E1B编码序列的两侧均具有至少5kb，优选至少17kb的间隔核酸序列，所述间隔核酸不编码E1A蛋白。所述间隔核酸可以是任何核酸，优选其是惰性的，即不包含编码序列，优选无已知调节元件，无可导致染色体不稳定的高度重复的区域等等。优选地，E1A编码序列侧翼的所述间隔核酸序列与E1B编码序列侧翼的所述间隔核酸序列不具有实质同源性。所述间隔片段可包括E1A或E1B表达盒的调节序列，如异源启动子和/或聚腺苷酸化位点。

当重组分子是环形形式时，其在宿主中的增殖通常可以方便地进行。在某些方面，本发明的重组分子是线性形式。这样可以有助于前体细胞系的转染，当使用线性分子时转染通常更有效。线性化可例如通过用一或多种方便的限制酶消化重组分子而实现，如本领域技术人员所已知。

缺少反向重复方向的E1序列的细胞系

无论在包装细胞与重组腺病毒之间不具有实质上的重叠的情况中产生HDEP的机制如何，很可能第一个步骤是来自包装细胞基因组的E1序列整合进病毒基因组中。为了容纳这些额外的序列，病毒随后必须删除腺病毒序列(Murakami et al，2002)。当存在反向重复时，这个步骤可能更有效(Steinwaerder et al，1999)。PER.C6

细胞系在其基因组中包含用于产生该细胞系的一些pIG.E1A.E1B质粒的重复，这些重复中有一些彼此是反向的。因此，PER.C6

细胞基因组中E1区域的反向重复的存在可影响产生HDEP的频率。应注意HDEP颗粒的形成也可以在其它腺病毒包装细胞系中出现，但在这些细胞系中由于正统的RCA的出现而无法检测到。当重组腺病毒在这种包装细胞上增殖时，包装细胞系中反向重复方向的E1序列的不存在很可能导致较低频率的HDEP产生或者甚至完全不产生。

因此当产生或选择在其基因组中包含E1区域的新细胞系时，可希望选择缺少反向重复，而仅具有直向重复，或者甚至E1序列单一整合的克隆。因此本发明的一方面提供了包含腺病毒E1序列的细胞及提供或产生这种细胞的方法，特征在于所述方法包括选择缺少包含所述E1序列的反向重复的细胞的步骤。本发明提供了在其基因组中包含腺病毒E1序列的细胞，其中所述E1序列包括E1A及E1B-19K和E1B-55K编码序列的至少一个功能性拷贝，特征在于所述E1序列或其一部分不以反向重复形式存在于所述基因组中。在这个实施方案中，所述细胞不是293细胞或其衍生物。如果反向重复存在，优选这种反向重复在所述细胞中不在10kb以内存在，并且对于本发明而言，具有至少10kb的非E1插入序列的反向重复不再进一步被认为是反向重复。原因是当E1序列的一个拷贝整合在染色体的某处，反向拷贝以足够大的距离整合在同一染色体以防止在腺病毒颗粒中摄取包含这两个重复的完整DNA节段时，这样就没有问题了。当所述距离可能引起片段摄取时(即10kb)，得自反向重复序列的左侧端的复制提供了太大以至于不能被包装的病毒基因组(图13所例证)。病毒基因组中E1序列的插入位点对于HDEP最后的总长度是重要的。显而易见，当更多地插入病毒左侧端时，包含E1的基因组片段的掺入产生可包装的基因组的机会增加。如果插入位点就在最小包装信号的3’端，则插入体可以大如18.5kb(包括E1A和E1B的一个拷贝及一个反向重复序列)并且仍可包装(假定左侧至右侧端复制包括350bp ITR和包装信号)。这不意味着例如17kb的插入体将易于产生HDEP，因为仍产生可包装大小的病毒的这个片段的可能的掺入位点限于就在最小包装序列3’端的1.5kb。因此，HDEP产生的频率随着E1A与E1B编码区之间距离的增加而降低，并且当该距离远小于所述的18.5kb时仍旧检测不到。

在不具有反向重复序列的情况下，E1A和E1B的直向插入也如此。在这种情况中，腺病毒基因组中的全部插入不能长于37.5kb(包括大约3kb的E1A和E1B区)，只有当直接插入在最小包装信号的3’端时可以如此。因此，当包装细胞基因组中E1A和至少一个E1B编码序列间隔至少34.5kb时，才能阻止这两个序列均插入重组腺病毒中。

另外，完整腺病毒基因组应该在随后的步骤中删除，这个程序在不具有反向重复序列的情况中可能效力低很多(Steinwaerder et al， 1999)。在任何情况中，不管基因组中是否存在反向的E1序列，当E1A和至少一个E1B编码序列在基因组中是分隔的时候，则产生包含E1A和E1B序列的颗粒的机会降低。因此，在某些实施方案中，本发明的细胞的基因组中所述E1A和至少一个E1B编码序列间隔至少4kb、6kb、8kb、10kb、12kb。在这些实施方案中，优选所述E1序列不以反向重复形式存在。

优选地，所述序列间隔至少15kb并且无反向的E1序列存在，这样将保证通过将来自所述细胞系基因组中的E1序列导入腺病毒中而在这种细胞中产生HDEP的理论可能性实际上降低为零(见图13所示)。在其它实施方案中，所述E1A和至少一个E1B编码序列间隔至少18kb、20kb、25kb、30kb。最优选地，所述序列间隔至少34.5kb。这样将保证衍生自该细胞基因组的E1A和E1B的单一整合不引起HDEP产生。显而易见，如上所述，在某些等价的实施方案中，所述E1A和至少一个E1B编码序列存在于细胞基因组的不同染色体上。

本领域技术人员已知筛选产生的克隆中E1序列的反向重复是否存在的方法，所述方法可包括PCR、Southern印迹、限制酶分析、Fiber-FISH等。在使用包含E1基因的质粒如pIG.E1A.E1B质粒(美国专利5,994,128)产生细胞克隆时，首先可确立克隆，在筛选循环中挑选缺少所述反向重复的那些克隆以进一步应用。来自所挑选的克隆的细胞然后可适当地用于产生重组腺病毒，期望这些细胞与包含所述反向重复的细胞相比，HDEP的产生频率显著较低(或甚至不存在)。因此，本发明的另一方面提供了在其基因组中包含腺病毒E1A和E1B编码序列的细胞，特征在于所述基因组中不存在反向重复形式的所述E1序列。对于本发明的这个方面，由至少10kb的非E1序列间隔的序列不被认为是反向重复。在一特殊方面，所述E1A和E1B序列在所述基因组中以每个基因组至少两个拷贝存在。一方面，所述至少两个拷贝包括一个染色体上存在的至少两个拷贝。在另一个实施方案中，所述细胞在其基因组中仅包含E1A和E1B编码区的一个拷贝，同时缺少编码腺病毒pIX的序列。当然，在其基因组中仅包含所述E1序列的一个拷贝的细胞期望具有较低的HDEP产生频率(或甚至不存在)。

细胞的应用

另一方面，本发明提供了一种在本发明的细胞中产生重组腺病毒的方法。这将产生与在本领域已知的系统上产生的重组腺病毒批次相比HDEP的频率显著降低的重组腺病毒批次，优选根本没有HDEP。在特别优选的实施方案中，用于产生所述重组腺病毒的载体和包装细胞缺少实质上的序列重叠(即优选少于10nt，或者更优选根本不重叠)，优选无重叠，从而使得载体与包装细胞的序列之间同源重组的机会最小，产生不包含E1的颗粒的病毒批次(HDEP，RCA)。

注意本发明提供的新细胞也可以如早先所述用于产生重组蛋白(WO 00/63403)，及如早先所述用于产生其它(非腺病毒)病毒(WO01/38362)。

本领域技术人员清楚转基因的血清型或性质对于本发明不是关键的。例如随即技术人员就会清楚用于产生细胞的腺病毒E1编码序列可以取自与在细胞上增殖的腺病毒相适应的任何方便的血清型，如Ad5、Ad35、Ad11、Ad16、Ad49等，或其组合，即来自一种血清型的E1A及来自另一种血清型的至少一个E1B编码序列(见例如WO02/40665)。技术人员也清楚在不偏离本发明范围或精神的范围内对本发明可以进行各种改变。现在通过如下非限制性实施例对本发明加以例证。

实施例

除非特别说明，则本发明以本领域技术人员已知的分子生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术进行。见例如Sambrook，Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel FM，et al，eds，1987；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；PCR2：A Practical Approach，MacPherson MJ，Hams BD，Taylor GR，eds，1995所述。

实施例1：使用编码E1A和E1B蛋白的单独的核酸产生互补细胞系

腺病毒E1基因对原代细胞的完全形态学转化是E1A和E1B区域编码的蛋白质的组合活性的结果。对不同的E1蛋白在细胞溶解性感染和转化中的作用已经进行了充分研究(见Zantema and van der Eb，1995；White，1995，1996综述)。腺病毒E1A蛋白是原代细胞转化所必需的。E1B-19K和E1B-55K都可以抵消诱导伴随的编程性细胞死亡，尽管通过不同的机制。尽管E1A区域编码一些蛋白质，但完整的区域通常称作E1A编码区，在所有实施方案中，本文所用的“E1A编码序列”是指编码所有E1A蛋白的序列。

在啮齿动物细胞中，E1A与E1B-19K或55K的一起的活性对于完全转化而言是足够的，但是两种E1B蛋白一起表达效力增加为两倍(Gallimore et al.，1985；Rao et al.，1992)。然而在人细胞中，E1B-55K蛋白的活性看起来更重要，因为观测到E1B-55K在确立永生化的转化的细胞系中是不可缺少的(Gallimore etal.，1986)。在腺病毒感染和病毒增殖中，E1A蛋白发挥激活包括E1B及其它早期区域的腺病毒基因的功能，可能通过与TATA结合蛋白的相互作用而进行(综述参见Zantema and van der Eb，1995)。E1B-55K的表达在关闭宿主蛋白合成及从细胞核将病毒编码的蛋白质选择性转运至胞质的感染晚期阶段中是重要的(Babiss et al.，1985；Pilder et al.，1986)。缺失E1B-55K的腺病毒示出在非互补的人细胞系上的复制降低(Harada and Berk， 1999)。因此，E1A和E1B-55K编码的蛋白质是原代人细胞转化及病毒在人细胞中有效复制所必需的。

非同源重组可导致包装细胞的细胞基因组中的E1序列掺入重组腺病毒中。最终得自最初重组的腺病毒的辅助病毒依赖性含E1颗粒能互补复制缺陷的载体在非互补(人)细胞上的复制，但是不能自主复制。这种互补是由E1A和E1B-55K二者及可能的E1B-19K功能介导的。因此，如果E1A和E1B-55K二者(及优选E1B-19K)的功能在腺病毒载体中结束的机会被消除或减少，则HDEP的形成将被消除或减少。

在此我们描述了用于产生具有彼此分隔的E1A和E1B-55K区域的腺病毒包装细胞系的表达E1A、E1A和E1B-19K、E1B(E1B-19K+E1B-55K)或E1B-55K的功能性质粒的实例。

先前已经描述了构建体pIG.E1A.E1B(图14；SEQ ID NO：1)，其包含Ad5-E1区(Ad5基因组的第459-3510位核苷酸(Genbank Acc.No.M73260)，与人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和乙型肝炎病毒聚腺苷酸化序列可操纵地连接(美国专利5,994,128)。

构建体pIG.E1A的产生

构建体pIG.E1A通过用HincII消化pIG.E1A.E1B，随后使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据厂商指导从凝胶中纯化所得5kb片段而产生。将分离的片段再连接并转化进STBL2感受态细胞(Invitrogen)中产生pIG.E1A(图1)。这个构建体包含Ad5基因组的第459-1578位核苷酸(Genbank Acc.No.M73260)。

构建体pIG.E1AB21的产生

将构建体pIG.E1A用XbaI和HpaI消化并将所得4.8kb片段如上述从凝胶中分离。将构建体pIG.E1A.E1B用BsrGI消化并用Klenow 酶(New England Biolabs)处理以使得5’突出端平端化。然后将DNA用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiágen)根据厂商指导进行纯化，随后用XbaI消化。将包含E1A和E1B19K编码序列的3’部分的所得913bp片段如上述从凝胶中分离。连接两个分离的片段并转化进DH5α-T1r细胞(Invitrogen)中，产生构建体pIG.E1AB21(图2)。这个构建体因此包含Ad5基因组的第459-2253位核苷酸(Genbank Acc.No.M73260)，从而所述E1A序列由PGK启动子驱动，所述E1B启动子驱动E1B-19K基因。

Ad5E1B-19K基因有时也称作Ad5E1B-21K基因，因为预测的氨基酸序列构成一个20.6KD蛋白质(例如，本申请中的一些质粒和引物用21K作为其名称的一部分)。

构建体pCR5B的产生

接下来如下产生包含Ad5-E1B区域的构建体。首先，使用pIG.E1A.E1B DNA作为模板及根据厂商指导使用Pwo DNA聚合酶(Roche)，使用终浓度为3％的DMSO，使用如下引物产生PCR片段，：

5E1Bfor-1：5′-CGG AAT TCG GCG TGT TAA ATG GGG CG-3′(SEQ ID NO：2)

5E1B-rev：5′-TAG CAG GCG ATT CTT GTGTC-3′(SEQ ID NO：3)。

扩增程序为94℃2分钟，随后进行30次循环(94℃30秒，50℃30秒及72℃1分钟)，以72℃10分钟结束。根据厂商指导，将所得481bp扩增的片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并与来自PCR克隆试剂盒(Stratagene)的pCR-ScriptAmp载体在存在SrfI酶的情况下连接。(平端)连接在载体中产生两个方向的插入体，选择具有在插入体5’末端EcoRI位点与载体EcoRI位点之间的最大片段的那个。这样产生了构建体pCR5B。靶序列(KpnI和EcoRI位点之间)的正确扩增通过测序核实。

构建体pE1B的产生

将pCR5B用KpnI和EcoRI消化，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离415bp的片段。然后将构建体pIG.E1A.E1B用EcoRI和KpnI消化，并将所得5.2kb载体片段如上述从凝胶中分离。连接分离的片段并转化进DH5α-T1r细胞(Invitrogen)中产生构建体pE1B(图3)。这个构建体中的E1B序列构成Ad5基因组的第1642-3510位核苷酸。

然后测试与全长Ad5E1表达构建体相比，新构建体的转化能力。为此，分离原代人胚胎视网膜(HER)细胞(见例如Byrd et al，1982，1988)，并在6cm培养皿中接种于补加了10％热失活的胎牛血清(FBS，Gibco BRL)的DMEM培养基(GibcoBRL)中。在60-70％铺满时，将细胞使用CaPO₄共沉淀试剂盒(Invitrogen)根据厂商指导用总共20μg DNA/培养皿转染。两周后，在原代细胞单层中可见作为转化灶的转化的克隆。转化灶中的细胞示出与原代细胞显然不同的形态。表2描述了使用每种转染获得的转化的克隆的量。

结果证实了先前所观测到的原代细胞可以用Ad5-E1A和E1B19K基因(pIG.E1AB21)转化的结果。

应注意这些转化灶与用存在完整的E1B区域的转染获得的转化灶相比通常较小。同样，在挑选得自用构建体pIG.E1AB21转染的转化灶并接种于96孔平板中后，未获得持续的细胞生长，并且所有细胞均死亡。在所有其它情况中，大多数挑选的转化灶均产生存活的细胞克隆。

由于利用pIG.E1AB21的转染最初会产生转化的细胞，因此可以用E1B-55K表达构建体再次转该细胞，例如在首次转染后5-10天再次转染。这样保证了获得在基因组的不同基因座上掺入这两个表达盒的细胞。

这个实验进一步证实了通过使用E1A和E1B基因的两个单独的质粒(pIG.E1A+pE1B)可以产生并确立转化的细胞克隆。然而，由于这两个质粒是一起转染的并且包含相当多的序列重叠(质粒主链和启动子/polyA)，因此E1A和E1B的整合发生在基因组的同一基因座中是可能的。

这可以使用仅具有表达盒(无载体序列)并且无序列重叠的片段而避免。所述序列重叠可以通过使用具有E1A和E1B序列的两个表达构建体的不同的调节序列而从调节元件中除去，如从启动子和聚腺苷酸化(polyA)序列中除去。优选地，这些序列充分不同以防止可导致在同源重组过程中形成成对结构的重叠。任何启动子和polyA序列均可以使用。优选地，所述调节序列与来自在这些细胞上增殖的重组腺病毒的转基因的那些调节序列不同。显而易见，这仅在当特定的重组腺病毒在这些细胞上增殖晚期阶段时才可确定并且依赖于特定的重组腺病毒。因此，稍后再选择这种转基因的调节序列是方便的，以使得它们与本发明确立的细胞中E1A和E1B序列的那些调节序列不同。然而，由于许多目前可利用的重组腺病毒载体携带CMV启动子和SV40polyA序列调节的转基因，因此本文所示例的E1A和E1B构建体的优选的调节序列与CMV启动子和SV40polyA序列不同。考虑到调节问题，这些调节序列进一步优选不是病毒源的。为此，上述质粒如下述进一步修饰。

构建体pCC.E1A和pCC.E1AB21的产生

将E1A序列用如下引物扩增：

5E1A-For：5′-CCG AAT TCG ATC GTG TAG TG-3′(SEQ ID NO：4)

5E1A-rev：5′-CGG GAT CCA TTT AAC ACG CCA TGC AAG-3′ (SEQ ID NO：5)

反应在pIG.E1A.E1B模板DNA上使用Pwo DNA聚合酶(Roche)根据厂商指导进行，但使用终浓度为3％的DMSO。PCR程序设定为94℃2分钟，随后30次循环(94℃30秒，58℃30秒及72℃120秒)，最后在72℃进行8分钟。所得1.2kb片段包含来自Ad5的E1A序列(Genbank Acc.No.M73260的第459-1655位核苷酸)，侧翼为EcoRI(5′)和BamHI(3′)位点。

第二个PCR片段使用引物5E1A-For及反向引物5E1AB21-rev：5′-CGG GAT CCT CAT TCC CGA GGG TCCAG-3′(SEQ ID NO：6)使用相同条件产生。所得1.8kb片段包含Ad5的E1A和E1B-19K序列(Genbank Acc.No.M73260的第459-2244位核苷酸)，侧翼为在EcoRI(5′)和BamHI(3′)位点。将这两个PCR片段从琼脂糖凝胶中分离，用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，并克隆进PCR克隆载体pCR-TOPOblunt(Invitrogen)中；并核实序列。然后将该构建体用EcoRI和BamHI消化，插入的片段使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)如上述从凝胶中分离。

然后将每个分离的片段连接进首先用EcoRI和BamHI消化并如上述从凝胶中纯化的载体pCC101(见下述)中。转化进电感受态DH10B细胞(Invitrogen)中产生构建体pCC.E1A(图4)和pCC.E1AB21(图5)。在这些质粒(衍生自WO 02/40665所述构建体pCC271)中存在一个合成的聚腺苷酸化信号(SPA)。

pCC101的产生

将pCC100(见下述)用XbaI消化并将所得线性片段使用QIAEXII凝胶提取试剂盒如上述从凝胶中纯化。通过将寡核苷酸X-SM-1：5′-CTAGGTCGACCAATTG-3′(SEQ ID NO：7)与X-SM-2：5′-CTAGCAATTGGTCGAC-3′(SEQ ID NO：8)退火制备一个接头。为此，将1μg每种寡核苷酸与2μl 10×NEB2缓冲液(NEB)和milliQ H₂O混合，终体积为20μl。将混合物置于98℃，在PCR设备中缓慢冷却至4℃(冷却速度为2℃/分钟)。然后使用相对于片段4倍摩尔过量的接头，将退火的接头与分离的XbaI消化的片段连接。连接的DNA使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据厂商指导纯化，并用XbaI消化以除去自身连接的载体DNA。在XbaI酶热失活后，将混合物用于转化DH5α-T1^r感受态细胞，产生pCC101(图6)。

pCC100的产生

将构建体pCC271(WO 02/40665描述)用EcoRI和PstI消化，并将3kb载体片段如上述从凝胶中分离。通过退火寡核苷酸EcoPst-3：5′-AAT TGA TAT CGA ATT CGC CGA GCT CGT AAG CTT GGA TCC CTG CA-3′(SEQ ID NO：9)与寡核苷酸EcoPst-4：5′-GGG ATC CAA GCT TAC GAG CTC GGC GAA TTC GAT ATC-3′(SEQ ID NO：10)制备接头。为此，将寡核苷酸如上述混合并通过在98℃温育2分钟、65℃温育30分钟及在室温温育2小时而退火。然后将分离的载体片段与过量退火的寡核苷酸连接，并转化进DH5α-T1^r感受态细胞中，产生构建体pCC100。

pCC200的产生

将质粒pBR322(GenBank J01749.1)用EcoRI消化，然后用Klenow酶平端化，随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。在用NheI第二次消化后，将4150bp载体片段使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离。相同地，将构建体pCC100用BsaAI消化，用Klenow酶平端化并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，随后用XbaI第二次消化并从琼脂糖凝胶中分离350bp片段。然后连接该片段并转化进化学感受态STBL-2细胞(Invitrogen)中，产生pCC200(图15)。

pCC105的产生

构建体pCC105包含人PGK启动子和衍生自人COL1A2基因的聚腺苷酸化序列。

首先，将COL1A2聚腺苷酸化序列(Natalizio et al.，2002)如作者所述通过PCR从人基因组DNA中扩增，使用重组Taq聚合酶(Invitrogen)和引物COL1A2F：5′-CAG CTA GCC TGC AGG AAG TAT GCA GAT TAT TTG-3′(SEQ ID NO：11)及COL1A2R-sal：5′-ACA CGT CGA CGG CTG GTA GAG ATG C-3′(SEQ ID NO：12)进行。

同此，将公布的序列在5’末端由SbfI限制序列延伸，在3’末端由SalI限制序列延伸。将所得PCR片段使用pCR-TOP04TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆进pCR-TOPO-TA中。在通过测序核实插入体后，将277bp插入体通过用SbfI和SalI消化分离自TOPO载体，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。相同地，将质粒pCC101也用SbfI和SalI消化，随后进行凝胶电泳。使用GeneClean试剂盒(Bio101)根据厂商指导从琼脂糖凝胶中分离2965bp载体片段。将这个载体片段以等摩尔量与纯化的COL1A2pA片段连接，并转化进化学感受态STBL-2细胞(Invitrogen)中。由此产生质粒pCC105(图7)。

pCC205的产生

构建体pCC205通过用SalI和EcoRI消化pCC200，随后使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化4225个核苷酸的载体片段而产生。相同地，将310个核苷酸的COL1A2polyA通过用EcoRI和SalI消化，随后通过凝胶电泳及使用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化而从构建体pCC105中分离。然后将这个两个片段以等摩尔量连接并转化进DH5α-T1r中，产生pCC205(图16)。

pCC.55Kcol的克隆

载体pCC205用于构建表达Ad5E1B-55k蛋白的质粒。为此，使用如下引物产生PCR产物：55KforE：5′-GGA ATT CGC CAC CAT GGA GCG AAG AAA CCC ATC TGA-3′(SEQ ID NO：13)和55KrevB：5′-gga tcc TCA ATC TGT ATC TTC ATC GCT AGAGCC-3′(SEQ ID NO：14)。PCR使用Pwo DNA聚合酶根据厂商指导在存在3％DMSO的情况下进行。扩增在pIG.E1A.E1B上进行，程序设定为在94℃2分钟，随后30次循环(94℃30秒，60℃30秒及72℃90秒)，最后在72℃8分钟。所得1510bp扩增的片段包含Ad5序列的E1B-55K序列第2019-3510位核苷酸。将该片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，用EcoRI和BamHI消化，随后凝胶电泳以除去被切割的末端。然后将这个片段使用GeneCleanII试剂盒(Bio101)从琼脂糖凝胶中纯化，并连接进也如上述用EcoRI和BamHI消化并分离自琼脂糖凝胶的pCC205中。将连接混合物转化进化学感受态STBL2细胞(Invitrogen)中，产生构建体pCC.55Kcol(图8)。

pIG.E1B的克隆

使用Pwo DNA聚合酶(Roche)根据厂商指导在存在3％DMSO的情况下产生一个PCR片段。在扩增反应中使用如下引物：5E1Bstart：5′-GGA ATT CCT CAT GGA GGC TTG GG-3′(SEQ ID NO：15)和5E1Brev2：5′-GTG TCT CAC AAC CGC TCT C-3′(SEQ ID NO：16)。扩增在pIG.E1A.E1B上进行，程序设定为94℃2分钟，随后5次循环(94℃30秒，56℃30秒及72℃60秒)，然后再进行35次循环(94℃30秒，60℃30秒及72℃60秒)，最后在68℃8分钟。然后将390个核苷酸的PCR片段用KpnI和EcoRI消化，产生347个核苷酸的片段，将其使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离。

将这个片段与5713bp pIG.E1A.E1B载体片段连接，该载体片段是用KpnI及用EcoRI部分消化，随后使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离并纯化而获得。在连接后，将该混合物转化进化学感受态STBL-2细胞中，产生质粒pIG.E1B(图9)。pIG.E1B包含Ad5基因组的第2019-3510位核苷酸。

pCC.E1Bcol的克隆

为了构建携带19K和55K Ad5 E1B这两个编码序列的质粒，将质粒pCC.55Kcol用EcoRI和KpnI消化。将5970个核苷酸的载体片段如上述通过凝胶电泳分离并使用GeneClean试剂盒II(Bio101)从琼脂糖凝胶中纯化。然后将构建体pIG.E1B也用KpnI和EcoRI消化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)将347个核苷酸的片段从凝胶中分离并纯化。这个插入体与分离的pCC.55Kcol载体片段的连接及转化进STBL2细胞中产生了构建体pCC.E1Bcol(图10)。这个构建体包含Ad5基因组序列的第1711-3510位核苷酸。

pEC.E1B的克隆

人延伸因子1-α启动子(EF1-α)通过用EcoRI和PmlI消化分离自质粒pEF/myc/nuc(Invitrogen)。在消化后，将片段用Klenow酶平端化，然后将1183个核苷酸的EF1-α启动子片段通过凝胶电泳分离并使用GeneCleanII试剂盒(Bio101)纯化。同样地，将载体pCC.E1Bcol用BstXI消化，随后用T4DNA聚合酶处理以使得末端平端化，并经过PCR纯化柱(Qiagen)纯化。然后用EcoRV进行第二次消化，随后进行凝胶电泳。然后将5827个核苷酸的载体片段用GeneCleanII试剂盒(Bio101)纯化。将EF1-α片段与载体片段以等摩尔量连接在一起并转化进化学感受态STBL-2细胞(Invitrogen)中，这样产生包含与质粒 pCC.E1Bcol中同样的Ad5-E1B序列的质粒pEC.E1B(图11)。

pSC.55K的克隆

使用重组Taq DNA聚合酶(Invitrogen)及如下引物，从pEF/myc/nuc质粒DNA(Invitrogen)中扩增SV40启动子：SV40.forS：5′-CAA CTA GTA CAT GTG GAA TGT GTG TCA GTT AGG-3′(SEQ ID NO：17)和SV40.RevERI：5′-GGA ATT CAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG G-3′(SEQ.ID.NO.18)。扩增程序设定为在94℃2分钟，随后进行5次循环(94℃30秒，48℃30秒及72℃45秒)，然后进行25次额外循环(94℃30秒，58℃30秒及72℃45秒)，最后在68℃8分钟结束。将所得357bp扩增的片段(GenBank Acc.No.J02400的SV40序列的第266至-71位核苷酸)使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离。然后使用PCR TOP04blunt克隆试剂盒(Invitrogen)将这个片段克隆进pCR-TOPO中。在核实序列后，将357bp插入体通过用EcoRI和SpeI消化从TOPO载体中分离，并使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离。同样地，将质粒pCC.55Kcol(具有一个pBR322-主链)用AvrII和EcoRI消化，随后进行凝胶电泳。如上述从凝胶中分离5508个核苷酸的载体片段，并以等摩尔量与消化的PCR片段连接。将该连接混合物转化进化学感受态STBL-2细胞中，产生包含与pCC.55Kcol中相同的Ad5E1B-55K序列的质粒pSC.55K(图12)。

为了从原代HER细胞中产生转化的克隆，将包含合适的表达盒的DNA片段从凝胶中分离。确信(重叠的)载体序列的消除减少共同整合的机会。为此，将pCC.E1A和pCC.E1AB21用BsaAI和AflIII消化，并使用ELU-Trap设备(Schleier and Schuell)根据厂商指导将插入片段从凝胶中纯化。这个设备可以大量分离DNA片段。将构建体pEC.E1B和pSC.55K分别用AatII/HincII和AflIII/HincII消化，并如上述分离插入片段。如上述培养并转染原代HER细胞。组合分离自pCC.E1A和pEC.E1B的片段以进行转染。将分离自pCC.E1AB21的DNA与pSC.55K组合或者单独转染。然后将后者培养物在第一次转染后7-10天，根据观察到的克隆的大小用分离自pSC.55K的DNA片段再转染。在转染前一天，将单独用E1AB21转染的培养皿的一半传代到10cm培养皿，然后再次转染，培养皿的另一半进行再转染而不进行之前的传代。

挑选得自这些转染的转化的克隆并在96孔平板及后续更大的尺寸中进一步扩展。该片段的整合位点和拷贝数目使用Southern印迹研究，并通过PCR揭示插入是否在近邻处发生。优选进一步应用转染的细胞基因组中E1A和E1B 55K二者存在于单一拷贝中的克隆，或者这二者存在于一个以上的拷贝中但无这些序列的反向重复构象的克隆，或者其中E1A和至少一个E1B编码序列(在这种情况中是E1B-55K)间隔至少4kb，优选至少10kb，更优选至少34.5kb的克隆。

实施例2：使用具有由大间隔序列分隔的E1A和E1B区域的核酸产生互补细胞系

如先前的实施例所述，使用E1A和E1B的单独的质粒，可以从原代细胞中产生稳定转化的细胞克隆。然而，当一起转染DNA片段时，仍存在转染的片段彼此紧邻的机会，尽管这个机会在不具有相当的序列重叠的情况下已经减少。E1A和E1B表达盒在它们之间存在少于30kb的非E1序列的情况下整合在染色体上的可能性可以通过在不同的E1表达盒侧翼放置大块的非(E1)编码DNA序列(所谓的“间隔”片段)而避免。如果在产生的包装细胞基因组中携带E1A的片段与携带E1B的片段相邻整合，则所述大的侧翼序列应产生足够的距离以消除在重组腺病毒载体在所述包装细胞上增殖的基础上E1A和E1B编码序列重组进同一重组载体分子中的机会。可以使用的大的间隔DNA片段非限制性例如是衍生自例如人肌养蛋白基因或人Apo-E1基因的大序列。也可以使用其它间隔分子，甚至可以使用来自非人来源的间隔分子。优选地，所述侧翼序列不包含功能蛋白的编码区并因此可衍生自内含子序列。同样，E1A和E1B序列也不需要在不同的分子上，可以位于同一个大分子如粘粒上。这些携带E1A和E1B的分子例如在图13中示出。在优选的实施方案中，E1A和E1B编码区之间的距离＞34.5kb，因为随后这两个区域共插入病毒中产生太大以至于不能包装的基因组。例如当使用具有大致在中间的表达盒的大约40kb的两个单独的粘粒片段时出现这种情况。然而，假如反向重复结构形式的E1有助于HDEP产生的频率，则E1A和E1B表达盒位于总长度为大约22kb的一个单一粘粒片段上的构建体(如图13I)就足够了，甚至当第二个拷贝以相反方向紧邻第一个拷贝而位于细胞基因组中时也是如此。镜像结构的完全整合将也涉及＞38kb的片段。同样，如果反向重复的存在增加HDEP形成的频率，则认为多个拷贝直向重复整合的情况问题较少，甚至当包括E1A和E1B的2个完整拷贝的DNA片段的长度≤20kb时也如此。在不具有反向重复的情况中，比重组病毒中剩余空间大的任何含E1的片段(即38kb减去重组病毒的实际基因组长度)整合进重组病毒迫使其作为随后的步骤缺失部分必需的病毒序列，以保证包装及因此的增殖。对通过同源重组产生的第一个HDEP基因组进行分析(Murakami et al.，2002)示出病毒序列的缺失是可能的。

整合进细胞基因组中的DNA序列由于染色质相关的阻抑而不总是可以激活转录因子。尤其当使用源自通常在即将用这些序列转导的细胞中无活性的基因组区域的内含子DNA的大片段时，基因表达由于失活的染色质而可以被关闭。最近鉴别了可抑制这种阻抑的序列。例如发挥绝缘体序列(insulator sequence)功能的鸡β-球蛋白HS4元件(美国专利5,610,053)、果蝇scs或scs′元件(Kellum et al，1991；Farkas et al，1992)、及通过特异性筛选抗阻抑物元件而鉴别的人基因组中的一系列序列(所谓的抗阻抑物元件或STAR元件)(Kwaks et al.，2003；WO 03/004704)。这些序列掺入E1A和E1B表达构建体(该序列阻止E1A和/或E1B基因的定位沉默(positional silencing))也增强永生化的克隆的量。因此，在本发明的某些实施方案中，在至少一个E1A和/或E1B表达构建体中存在一或多个STAR元件，例如STAR 7(Genbank登记号AY190751)或者STAR 40(Genbank登记号AY190756)。优选所述元件在E1A和/或E1B编码序列的两侧，即表达构建体可包含(从5’至3’)：STAR元件—表达调节序列(例如启动子)-E1A编码序列；或者E1A+一个E1B编码序列；或者一个E1B编码序列；或者两个E1B编码序列—聚腺苷酸化序列-STAR元件。

实施例3：具有在单独的构建体上并且侧翼有填充DNA的E1A和E1B的细胞系的产生

这个实施例描述了本发明的新的细胞系的产生，所述细胞系通过共转染具有E1A表达盒及侧翼有大的填充DNA的第一个DNA片段和具有E1B表达盒及侧翼有质粒DNA的第二个DNA片段而产生。

取这个实施例中克隆进粘粒载体主链中的人肌养蛋白内含子44序列(Genbank Acc.No.M86524)(pdys44；图17)作为E1A表达质粒周围的填充DNA。

将构建体pCC.E1A(实施例1中描述；图4)用AflIII和AvrII(New England Biolabs)消化，并将突出端用Klenow酶(New England Biolabs)平端化。将消化的片段在0.5％TAE琼脂糖凝胶上分离并将相应于PGK-E1A表达盒的2kb片段使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据厂商指导纯化。

将构建体pdys44(图17)用BglII(New England Biolabs)消化，并将突出端用Klenow酶平端化。将片段在0.5％TAE琼脂糖凝胶上分离并切离含有主链质粒和部分肌养蛋白内含子的27kb片段。然后将凝胶切片置于含有少量玻璃绒的注射器中，用注射器柱塞将含有DNA的缓冲液推进eppendorf管的末端。由此获得的DNA溶液含有大约5ng/μl，并直接用于与纯化的2kb PGK-E1A片段的连接反应中。转化进DH5αT1感受态细胞产生构建体p44-1.ccE1A(图18)。这个构建体含有在人PGK启动子控制下的E1A和一个合成的polyA信号。

构建体pE1B(实施例1中描述；图3)在这个实施例中用作E1B表达质粒。这个质粒含有在其自身启动子控制下的E1B和乙型肝炎病毒(HBV)polyA信号。

将构建体p44-1.ccE1A用XhoI和PmeI消化，并将消化的DNA通过苯酚/氯仿(1∶1)提取及随后的乙醇沉淀而纯化(产生在侧翼具有大约11.6kb上游(包括PGK启动子)和大约6.5kb下游(包括合成的polyA信号)填充片段的E1A编码序列)。然后沉淀DNA，用70％乙醇洗涤并无菌溶解于无菌的无内毒素的TE中。将质粒pE1B用ScaI消化并如上述纯化(产生在侧翼具有大约1.4kb上游和2.3kb以上的下游填充片段的E1B编码序列，所述下游填充片段包括HBV polyA序列)。

培养原代人HER细胞并在一系列转染中对传代数为6(PN6)进行转染，及在另一系列转染中对PN9进行转染。HER细胞培养和转染根据实施例1所述的方法进行。在独立的转染中将如上述制备的含有E1A和E1B的DNA以不同比例混合(衍生自载体序列或调节序列的两个片段彼此缺少显著重叠)，从而减少这两个片段之间同源重组的机会；如果这两个片段会形成一个单一核酸分子(例如通过末端与末端接合或者连接，理论上可能)并随后作为一个单一单位整合进基因组中，则所得细胞中的E1A和E1B编码序列将被4kb以上的填充序列间隔(理论上在E1A和E1B编码序列之间存在至少6.5kb(E1A下游)+1.4kb(E1B上游)＝至少7.9kb间隔)。将总共8个培养皿用大约等摩尔比率的这两个构建体(17μg E1A和3μg E1B质粒)转染，将3 个培养皿用10μg每个片段转染。在这两个系列的转染中均观测到转化灶，但在用10μg每个构建体的情况中获得相对更多的转化灶。在单独的培养皿上的用AseI和BglI消化的构建体pIG.E1A.E1B用作阳性对照(2μg DNA/培养皿)。正如所期望的，(单一的)阳性对照质粒与两个单独片段(来自p44-1.ccE1A和pE1B)相比转化灶形成的效率更高。pIG.E1A.E1B质粒的效率更高出大约10倍。对于用阳性对照质粒和两个片段转染，发现挑选的转化的细胞克隆中大约80-90％是存活的并建立细胞系。

这些实验清楚示出通过用单独的DNA片段上的侧翼有(非重叠的)填充DNA的E1A和E1B基因共转染以转化原代细胞是可行的。进一步分析共6个克隆：HER01-B-71(人细胞系，2004年10月1日保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，保藏号04100101)、HER01-H-87(人细胞系，2004年10月1日保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，保藏号04100102)、HER01-H-86、HER01-H-88、HER01-H-89和HER01-B-90。

E1基因的表达在Western印迹上使用E1蛋白的特异性抗体分析。在Western印迹分析中使用总量为10μg的得自产生的细胞克隆的裂解物的蛋白质。将样品在加入1/4体积的NuPage样品缓冲液(Invitrogen)后在70℃变性15分钟。作为阳性对照，使用PER.C6

细胞裂解物。未转染的原代HER细胞裂解物(传代数为6)作为阴性对照。将样品在10％BisTris SDS page凝胶(Invitrogen)上运行，旁边是Seeblue plus2预染色的标记(Invitrogen)。从凝胶中制备Western印迹。使用如下抗体：1)E1A：小鼠抗人Ad2.E1A(1∶400，Santa Cruz)，或者2)E1B.19K：大鼠抗人E1B 21K单克隆抗体(1∶500，Oncogene)，或者3)E1B.55K：小鼠抗人55Kda(自杂交瘤细胞系C9A1C6中收获，得自Dr.R.Hoeben，LUMC，Leiden)。如下抗体用作二级抗体：1)E1A：山羊抗小鼠IgG-HRP(Biorad)，2)E1B.19K：山羊抗大鼠IgG-HRP(Epcam)，3)E1B.55K：山羊抗小鼠IgG-HRP(Biorad)。使用ECL+分析(Amersham)观测蛋白质。

从这些实验中获知所有测试的克隆均表达E1A和E1B蛋白，并且水平与在PER.C6

细胞中的表达水平相当(图19)。这证实了原代细胞的转化确实是由Ad5E1表达诱导的，不是自发事件的结果。

Ad5E1基因在这些细胞系中的功能性表达也可以通过示出该细胞能互补E1缺失的Ad5病毒而测试。因此对6个不同的细胞克隆测试了Ad5.eGFP载体的复制情况，这是一种E1缺失的(缺失Ad5序列的第455-3510位核苷酸)基于Ad5的表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体。为此，将细胞以1×10⁶个细胞/孔的密度接种并在第二天用感染复数(MOI)为5个病毒颗粒(VP)/细胞感染。作为阳性对照，将PER.C6

细胞也进行接种并用MOI＝5感染。5天后，在所有孔中均见到完全的致细胞病变(CPE)。收获细胞和培养基，冷冻/解冻三次，离心除去细胞碎片。然后将上清(粗裂解物)用于感染A549细胞。为此，将5×10⁵个A549细胞接种在24孔平板中，第二天用50μl所述粗裂解物感染。2天后，收获A549细胞并通过FACS分析GFP表达情况。结果示出所有克隆均能互补Ad5.eGFP载体(图20)。

特别地，所述腺病毒载体(缺失E1，无第455-3510位核苷酸)与细胞系中存在的E1序列(Ad5，第459-3510位核苷酸)无重叠，因此这个实施例中的腺病毒载体与新细胞系的组合相当于本发明的包装系统，这个实施例中重组腺病毒的产生相当于产生本发明的一批重组腺病毒的方法。

将产生的细胞系的基因组DNA在Southern印迹上使用E1A和E1B探针进行测试，以论证E1A和E1B编码序列在细胞基因组中间隔4kb以上。为此，将基因组DNA用限制性核酸内切酶EcoRV和BglII消化(图21)。将消化的DNA通过凝胶电泳进行大小分离(例如使用倒转电场凝胶电泳(FIGE)，以使得可以分离大的DNA片段)，然后通过毛细管印迹移至尼龙膜上。为进行印迹杂交，将三个不同的探针放射性标记。一个是Ad5.E1A探针，其是从位于Ad5.E1A基因中EcoRV位点的3’端的EcoRV-SalI限制片段(1330bp；见图21)中产生的。产生两个Ad5.E1B探针：Ad5.E1B(5′)，从BssHII-BglII片段(1354bp)中产生；Ad5.E1B(3′)，从BglII-BsrGI片段(652bp)中产生，分别位于Ad5.E1B基因中BglII位点的5’和3’侧。制备包含产生的细胞系的经消化的基因组DNA的相同印迹，或者在与第一个探针杂交后剥离印迹，然后与第二个探针杂交。每种方法均应可以覆盖用E1A和E1B探针获得的信号。

在转化的细胞系产生期间转染和整合后，如果E1A片段整合为紧邻包含E1B的片段，则用E1A和E1B的探针检测到印迹上的相同条带，条带的大小反映两个基因之间的距离。由于E1A和E1B片段彼此的方向未知，因此单独使用能杂交BglII限制位点的5’或3’片段的两个E1B探针。如果E1A片段整合在紧邻另一个E1A片段，则得自EcoRV消化的条带不被E1B探针识别。单一的整合子(integrant)或末端片段也产生不被这两种探针识别的条带。

总之，这个实施例中的实验明显示出原代人细胞与单独的质粒的共同转染产生转化的细胞系，所述原代人细胞和单独的质粒一个包含侧翼为大的填充片段区域的E1A，一个包含侧翼为主链序列的E1B。另外，这些细胞系以足以有效互补E1缺失的Ad5载体的数量表达E1蛋白。

在另一个实施方案中，将E1A和E1B序列克隆进一个单一的构建体中，这些序列之间具有填充片段，之后使用该单一的构建体产生细胞系。

显而易见，如果E1A和E1B之间需要更大的距离，则所述E1B编码序列侧翼也可以是更长的填充片段核酸，和/或E1A和E1B编码序列侧翼的填充片段的长度可以增加，通过标准的常规分子生物学技术根据本发明揭示的教导进行。因此，这个实施例显然不应理解为将本发明的范围限制在实际进行的实验范围内，而是本发明的概念的示例。

表2：用Ad5-E1表达构建体对原代HER细胞的转化

构建体	用量	培养皿数	转化灶/培养皿
				pIG.E1A.E1B	20μgr	2	31
pIG.E1A	20μgr	2	0
				pIG.E1A+pE1B	每个10μgr	4	15
pIG.E1AB21	20μgr	2	11.5
				pIG.E1A B21+pE1B	每个10μgr	4	10
AdApt.eGFP	20μgr	1	0

[0153] 参考文献：

Byrd P，Brown KW，Gallimore PH.1982.Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12DNA.Nature298：69-71。

Byrd PJ，Grand RJA，Gallimore PH.1988.Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1regions and combinations of E1A+ras.Oncogene 2：477-484。

Fallaux FJ，Bout A，van der Velde I，van den Wollenberg DJM，Hehir KM，Keegan J，Auger C，Cramer SJ，van Ormondt H，van der Eb A，Valerio D，Hoeben RC.1998.New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses.Hum Gene Ther 9：1909-1917。

Farkas G，Udvardy A.1992.Sequence of scs and scs′Drosophila DNA fragments with boundary function in the control of gene expression.Nucleic Acids Res.20：2604。

Gallimore，P.H.，Byrd，P.J.，Whittaker，J.L.and Grand，R.J.A.(1985).Properties of rat cells transformed by DNA plasmids containing adenovirus type 12 E1 DNA or specific fragments of the E1 region：comparison of transforming frequencies.Cancer Res.，45，p2670-2680。

Gallimore，P.H.，Grand，R.J.A.and Byrd，P.J.(1986).Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40，adenovirus and ras oncogenes.AntiCancer Res.6，p499-508。

Graham FL，Smiley J，Russell WC，Nairn R.1977.Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.J Gen Virol 36：59-72。

Jochemsen AG，PeltenburgLTC，te Pas MFW，de Wit CM，Bos JL，van der Eb AJ.1997.Activation of adenovirus 5E1A transcription by region E1B in transformed primary rat cells.EMBO J.6：3399-3405。

Kwaks TH，Barnett P，Hemrika W，Siersma T，Sewalt RG，Satijn DP，Brons JF，Van Blokland R，Kwakman P，Kruckeberg AL，Kelder A，Otte AP.2003.Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells.Nature Biotech 21：553-558(+corrigendum volume 21number 7，july 2003，p.822)。

Kellum R，Schedl P.1991.A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains.Cell 64：941-950。

Lochmuller，H.，Jani，A.，Huard，J.，Prescott，M.，Simoneau，M.，Massie，B.，Karpath，G.and Acsadi，G.(1994)Emergence of early region1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication-defective adenovirus recombinants(dE1+dE3)during multiple passages in 293cells。

Human Gene Therapy，5，1485-149。

Louis N，Evelegh C，Graham FL.1997.Cloning and sequencing of the cellular-viral junctions from the human adenovirus type 5transformed293cell line.Virol.233：423-429。

Murakami P，Pungor E，Files J，Do L，van Rijnsoever R，Vogels R，Bout A，McCaman M.2002.A single short stretch of homology between adenoviral vector and packaging cell line can give rise to cytopathic effect-inducing，helper-dependentE1-positive particles.Hum Gene Ther13：909-920。

Murakami P，Havenga M，Fawaz F，Vogels R，Marzio G，Pungor E，Files J，Do L，Goudsmit J，McCaman M.2004.Common structure of rare replication-deficientE1-positive particles in adenoviral vector batches.J Virol 78：6200-6208。

Nevels M，Tauber B，Spruss T，Wolf H，Dobner T.2001.″Hit-and-Run″transformation by adenovirus oncogenes.J Virol.75：3089-3094。

Nichols WW，Lardenoije R，Ledwith BJ，Brouwer K，Manam S，Vogels R，Kaslow D，Zuidgeest D，Bett AJ，Chen L，van der Kaaden M，Galloway SM，Hill RB，Machotka SV，Anderson CA，Lewis J，Martinez D，Lebron J，Russo C，Valerio D，Bout A。

Propagation of adenoviral vectors：use of PER.C6 cells.InAdenoviral vectors for gene therapy，(Ed.Curiel D.T.and Douglas，J.T.).Pub.Academic Press，2002。

Rao，L.，Debbas，M.，Sabbatini，P.，Hockenbery，D.，Korsmeyer，S.and White，E.(1992).The adenovirus E1A proteins induce apoptosis，which is inhibited by the E1B 19-kDa andBcl-2proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，p7742-7746。

Steinwaerder DS，Carlson CA，Lieber A.1999.Generation of adenovirus vectors devoid of all viral genes by recombination between inverted repeats.J.Virol.73：9303-9313。

Van den Elsen P，de Pater S，Houweling A，van der Veer J，van der Eb A.1982.The rE1Ationship between region E1A and E1B of human adenoviruses in cell transformation.Gene 18：175-185。

White，E.(1995).Regulation of p53-dependent apoptosis by E1A and E1B.In：The molecular repertoire of adenoviruses III.Eds.Doerfler，W.andBohm，P..Springer-Verlag Berlin HeidE1Berg 1995，p33-58。

White，E.(1996).Life，death，and the pursuit of apoptosis.Genes Dev.10(1)，p1-15。

Zantema，A.and van der Eb，A.J.(1995).Modulation of gene expression by adenovirus transformation.In：The molecular repertoire of adenoviruses III.Eds.Doerfler，W.andBohm，P.Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1995，p1-23.

Claims

1.一种包含编码腺病毒E1A蛋白及至少一种腺病毒E1B蛋白的核酸序列的重组分子，特征在于所述编码E1A蛋白的核酸序列与编码至少一种E1B蛋白的核酸序列间隔至少8kb，或者一套至少两种核酸分子，其中当该套至少两种核酸分子通过端到端连接形成一个单一分子时将形成所述重组分子。

2.权利要求1的重组分子或一套至少两种核酸分子，其中所述编码E1A蛋白的核酸序列与编码至少一种E1B蛋白的核酸序列间隔至少10kb。

3.权利要求2的重组分子或一套至少两种核酸分子，其中所述编码E1A蛋白的核酸序列与编码至少一种E1B蛋白的核酸序列间隔至少34.5kb。

4.权利要求1-3任一项的重组分子或一套至少两种核酸分子，其中所述分子或所述至少两种核酸分子是线性的。

5.包含权利要求1-3任一项的重组分子或一套至少两种核酸分子的细胞。

6.权利要求5的细胞，其中重组核酸分子或至少两种核酸分子整合进所述细胞的基因组。

7.权利要求6的细胞，其基因组中包含腺病毒E1A及E1B-55K和E1B-19K编码序列，其中对于基因组中所述E1A和E1B编码序列的任何拷贝而言，所述E1A和至少一种所述E1B编码序列间隔至少8kb。

8.权利要求7的细胞，其中对于基因组中所述E1A和E1B编码序列的任何拷贝而言，所述E1A和至少一种所述E1B编码序列间隔至少10kb。

9.权利要求8的细胞，其中对于基因组中所述E1A和E1B编码序列的任何拷贝而言，所述E1A和至少一种所述E1B编码序列间隔至少34.5kb。