CN101730741B - 将基因组装入受体宿主细胞的方法 - Google Patents

Abstract

当前公开的发明涉及将从一个物种(供体)分离的基因组装入适当制备的第二物种的细胞(受体)的方法。供体遗传物质导入受体宿主细胞有效地将受体宿主细胞转化为一种新的细胞，作为提供的遗传物质起作用的结果，所述新的细胞在功能上被分类为属于供体遗传物质的属和种。

Description

将基因组装入受体宿主细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2007年5月1日提交的美国临时申请号60/927,259和60/927,293的优先权。这些文献的内容在此完整引入作为参考。

在联邦政府资助的研究中完成的发明的权利声明

本工作部分得到国立卫生研究院和国防部基金的支持。美国政府享有本发明的一些权利。

技术领域

本发明一般涉及将基因组装入受体宿主细胞的方法。

背景技术

已有文献描述大DNA分子进入细菌细胞的4种自然过程。它们是转化，转导，接合(conjungation)，和细胞融合。但这些天然机制以及任何报道过的实验室方法都不能将细菌基因组插入其它细菌细胞以得到具有输入基因组的基因型和表型的新细胞。用其它物种的DNA转化细菌是常见的，但只能转化小段DNA。利用从温和裂解的枯草杆菌(Bacillus subtilis)原生质体分离的拟核，Akamatsu及其同事证明了较远标志物的同物种共转化。他们最近的分析得出结论，至少30％的4.2Mbp枯草杆菌基因组被重组入受体细胞。

发明概述

在一个实施方案中，当前公开的发明涉及一种物种间基因组移植的方法，包括：从第一物种制备供体基因组；从第二物种制备受体细胞，其中所述第一物种和第二物种均来自相同属；和将分离的供体基因组装入受体细胞，由此供体基因组从表型上将受体细胞转化为第一物种的表型。供体基因组可以从第一物种的细胞分离或合成制备。供体基因组可选的包含筛选标志物。在本发明的一个方面，在装入前从供体基因组去除蛋白。在本发明的另一方面，受体细胞包括受体基因组。供体基因组可以编码一种识别受体基因组序列但不识别供体基因组序列的限制性核酸内切酶。供体基因组可以是甲基化的，例如，供体基因组可以是GATC Dam甲基化的。仍在本发明的另一方面，第一物种是丝状支原体(Mycoplasma mycoides)大菌落(Large Colony，LC)株，第二物种是山羊支原体(Mycoplasma capricolum)。

另一实施方案中，本发明涉及一种将基因组装入微细胞(minicell)的方法，包括：从第一物种制备供体基因组；从第二物种制备受体微细胞，其中所述第一物种和第二物种均来自相同属；和将供体基因组装入受体微细胞，由此供体基因组从表型上将受体细胞转化为第一物种的表型。供体基因组可以从第一物种的细胞分离或合成制备。供体基因组可选的包含筛选标志物。在本发明的一个方面，在装入前从供体基因组去除蛋白。仍在本发明的另一方面，第一物种是丝状支原体(Mycoplasma mycoides)LC株，第二物种是山羊支原体。

附图说明

图1显示各种限制性修饰系统。

图2显示甲基化的基因组DNA。

图3显示与图2所示甲基化基因组DNA相对比的甲基化基因组DNA。

图4显示支原体细胞的相差显微照片，其细胞形状因过表达FtsZ而改变。

图5显示过表达FtsZ蛋白(产生可用作供体基因组移植的受体的延伸细胞)的支原体细胞的相差和表面荧光显微照片。

图6.在限制性内切酶Mbo I存在的条件下，丝状支原体LC基因组DNA增强的移植。将纯化的丝状支原体LC基因组DNA与限制性内切酶Mbo I的系列稀释物混合，然后将混合物移植入山羊支原体受体细胞，通过种于选择性培养基回收移植物。供体丝状支原体基因组DNA的天然甲基化防止它被酶切割。与此相反，受体山羊支原体细胞的基因组DNA对Mbo I敏感。供体DNA和酶的共移植选择性破坏受体细胞的基因组DNA，这反映在回收的移植物的数量。该机制与以下事实一致，移植物产量随着酶浓度的增加而增加。平板编号列在图的底部。平板1，无添加的基因组DNA；平板2，无受体细胞；平板3，基因组DNA加10μl Mbo I；平板4，基因组DNA加1μl Mbo I；平板5，基因组DNA加0.1μl MboI；平板6，基因组DNA加0.01μl Mbo I；平板7，基因组DNA不含MboI。

图7.证明块状的DNA是完整和环状的，而迁移入凝胶的条带状DNA是线性的。(A)上样有包含丝状支原体LC DNA的胶块的脉冲场凝胶。将0.5×TBE缓冲凝胶电泳20小时，然后用SYBR金染色。标尺泳道包含BioRad酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA大小标尺。应注意大量DNA仍在填料中。(B)显示PFGE前(BPFGE)或PFGE后(APFGE)显示胶块，以及PFGE后产生的基因组尺寸条带，利用Plasmid-Safe DNA核酸酶处理或不处理。核酸酶消化线性DNA，但对环状双链DNA无影响。这些数据表明迁移入凝胶的DNA条带是核酸外切酶敏感的，因此是线性的。

图8.山羊支原体、丝状支原体LC和一系列移植物克隆的Southern印迹分析。基因组DNA用HindIII消化，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。将DNA转移到N+尼龙膜，并用IS1296特异探针检测。在移植物中添加IS1296条带可能导致IS元件的突然扩充，当其在移植时进入山羊支原体环境中。

图9.蛋白质组分析。利用来自丝状支原体LC(A)、山羊支原体(B)和移植物克隆(C)的细胞裂解物进行2维凝胶电泳。使用标准条件在固定pH梯度(IPG)条(pH范围4到7)上第一维和第二维SDS-PAGE(Mr 8到200kDa)(18)分离蛋白样点。凝胶用G-250染色，从每块凝胶切除96个样点。样点71(凝胶A)，23(凝胶B)和8(凝胶C)被鉴定为醋酸盐激酶。醋酸盐激酶显示明显的碱性pH迁移(凝胶B)。胰蛋白酶消化和MALDI质谱法分析(MALDI-MS，ABI4700 Proteomics Analyzer)的醋酸盐激酶肽(样点8，凝胶C)的序列覆盖图(sequence coverage map)定位于与两个支原体种相同的肽(红色)和只存在于丝状支原体LC的肽(蓝色)。

图10.分离的丝状支原体LC DNA在琼脂糖块中的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，不存在可检测的与DNA有关的蛋白水平。凝胶用银染色。在左栏标记“完整细胞”的3条泳道是丝状支原体LC细胞的3个稀释物，它们在SDS中煮沸并上样到凝胶。中间栏包含含有丝状支原体LC DNA的琼脂糖块，所述丝状支原体LC DNA在PFGE前(B)或后(A)在SDS中煮沸并上样到蛋白凝胶。为了确定凝胶顶部的材料是蛋白还是DNA，在PFGE封闭前后将右栏用DNase I处理。在所述栏中，标尺之一是DNase I。

图11.链霉素对移植前丝状支原体LC供体基因组DNA拓扑结构的影响。如正文所述温和的从丝状支原体LC细胞分离基因组DNA。细胞在添加四环素(10μg/ml)(A)或四环素(10μg/ml)和链霉素(10μg/ml)(B)的SP4培养基中生长。在室温下将去蛋白的DNA用SYBR金(1×；Molecular Probes)染色15分钟。将7微升细胞上样于玻璃载片，并通过荧光显微镜(×1000)(Zeiss Axioskop 2plus)观察。

图12.在37℃生长18小时后，当pH为7.5(A)或6.2(B)时，pH对在添加17％胎牛血清和0.5％葡萄糖的SOB培养基中生长的山羊支原体受体细胞形状的影响。将500μl细胞在10℃ 2200g离心5分钟，然后重悬于200μlPBS。在室温下添加SYBR金(1×；Molecular Probes)将细胞染色15分钟。将7微升细胞上样于玻璃载片，并通过荧光显微镜(×1000)(Zeiss Axioskop 2plus)观察。

图13.两种野生型株和移植物(CL11.1)的山羊支原体和丝状支原体LC特异PCR扩增。

图14.30个不同丝状支原体LC筛选克隆(A)和～50个移植物(B)的Southern印迹。利用与IS1296插入序列杂交的PCR扩增子检测所述印迹。对于所述印迹，不同样品(尽管都具有多个拷贝的IS1296)具有稍微不同的模式，提示元件的移动。对于移植物来说，供体基因组在单个泳道中显示。

图15.来自4个不同实验的丝状支原体LC(基因组供体)，山羊支原体(受体细胞)和移植物的菌落杂交，利用对山羊支原体VmcE和VmcF表面抗原特异的多克隆抗体或对丝状支原体LC VchL表面抗原特异的单克隆抗体检测。

发明详述

基因组的化学合成最近被报道。Gibson，et al.，“Complete ChemicalSynthesis，Assembly，and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome，”Science(2008年2月29日)Vol.319.no.5867，pp.1215-1220，以及AttorneyDocket No.61687-3000800，61687-3000801，61687-3000802和61687-3000803，上述内容均在此完整引入作为参考。该方法具有多种用途，包括检验关于细胞活性所需最小基因集的假设以及构建定制的合成基因组(包含挑选的基因以编码希望的代谢途径)的方法。一旦构建出合成基因组，它必须被导入细胞环境，在那里基因组的编码指令可以被表达。当前公开的发明显示，从一个物种(供体)分离的基因组可以移植入适当制备的第二物种的细胞(受体)。供体遗传物质导入受体宿主细胞有效地将受体宿主细胞转化为一种新的细胞，作为提供的遗传物质起作用的结果，所述新的细胞在功能上被分类为属于供体遗传物质的属和种。

根据所述方法可以使用任何属和种的供体和受体细胞。最佳的供体染色体来源于与受体宿主细胞属于相同属的原始有机体。例如，来自各种支原体种的供体可用于直接(采用从天然来源分离的基因组形式)或间接(其中基因组是合成制备的，基于支原体前体构建)提供遗传物质用于本发明公开的用途。

本发明涉及将供体遗传物质移植入受体宿主细胞，其中供体遗传物质是功能性的，并控制受体宿主细胞。可以通过大量不同的方法实现受体宿主细胞的控制。所述方法可以被分成两种一般类型，用于保留其基因组的受体细胞的方法，和用于不含内源基因组的受体细胞的方法。

取代内源宿主基因组

利用包含内源基因组的受体细胞的移植方法优选的包括内源基因组被供体基因组编码的一个或多个产物灭活的方法。根据本文提供的各种示例性方法，制备供体染色体或基因组并将其导入宿主细胞。供体基因组可以编码一个或多个系统，当导入受体细胞时，所述系统用于灭活或破坏受体基因组。预期使用各种系统实现该目标。例如，限制性核酸内切酶可以由供体基因组或染色体编码，它们对受体基因组具有特异性。还可以包括其它系统，诸如阻止受体基因组的复制或功能的抑制性RNAs。这类抑制性RNA的实例是靶向于受体基因组复制起点的RNA。供体产生这种抑制性RNA来阻止内源染色体的复制，这进而允许供体基因组控制受体细胞并提供掺入子代细胞的遗传物质。

在本发明的一个实施方案中，供体基因组编码一个或多个限制性核酸内切酶，其作用对于供体基因组来说是阻断或抑制的，但功能上抗内源受体基因组。例如，有可能选择一种在非常罕见的位点切割的限制性核酸内切酶，然后将供体基因组或染色体定制为不含所述位点。在优选的实施方案中，通过供体基因组甲基化实现这种阻断。在另一实施方案中，可以在供体染色体装入或移植入宿主或受体细胞之前或之后将供体基因组或染色体甲基化。此外，供体染色体的甲基化可以是天然或人工产生的，诸如在体外环境中。

受体细胞中的内源染色体可以是未甲基化的和/或不适当甲基化的。当从供体染色体表达限制性内切酶时，限制性内切酶可以在特定位点切割内在染色体(resident chromosome)。在另一种方法中，在移植过程中包括合适的限制性核酸内切酶。在限制性核酸内切酶导入宿主细胞后，限制性核酸内切酶立即或几乎立即开始降解内在染色体，与从供体基因组表达限制性核酸内切酶所需的时间相比节省时间。

通过在受体细胞内产生甲基化酶并从供体染色体产生甲基指导的限制性内切酶或与供体染色体共移植甲基指导的限制性内切酶，可以使用甲基指导的核酸内切酶(能够切割甲基化DNA)。

在一些实施方案中，受体对限制性核酸内切酶敏感，因为它包含酶的识别位点。供体染色体不会含有这种序列，但将产生酶，与酶共移植，或受体可以用酶预处理。类似地，可以使用化学酶核酸酶、化学核酸酶和修饰剂(靶向于对内在染色体特异的序列)的共转化。在移植之前、期间和/或之后可以使用这些方法的全部或其中一些来选择性破坏内在染色体。可用限制性核酸内切酶和大范围核酸酶的范围，以及具有定制识别位点的酶的产生使得这种方法具有广泛应用。

可选的，受体细胞可能处在核苷酸类似物存在的条件下，因此这类类似物可能只存在于内在染色体内。随后所述类似物可以被供体染色体编码的试剂或与供体染色体共转化的试剂作为靶标。在具有或不具有修复这种损伤的遗传能力的条件下，内在染色体被选择性破坏。

根据本文提供的各种方法，丝状支原体LC编码多个限制性修饰系统，其中大部分不同于山羊支原体的单个限制性修饰系统(图1)。尽管在Western印迹分析(图2)中通过对甲基化腺嘌呤特异的抗体的识别确定，丝状支原体LC和山羊支原体均包含甲基化腺嘌呤，丝状支原体LC看起来是在GATC序列被dam基因(Dam甲基化酶)编码的大肠杆菌甲基化酶同源物位点特异性甲基化，而山羊支原体不是这样。Dam甲基化酶将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到序列GATC中腺嘌呤残基的N6位。这种系统和方法的能力得到以下两个因素的证明：第一，丝状支原体LC基因组DNA对限制性核酸内切酶DpnI(其在腺嘌呤甲基化的GATC序列处特异性切割)敏感以及对限制性内切酶MboI(其被GATC序列处腺嘌呤甲基化阻断)耐受；和第二，山羊支原体基因组DNA对DpnI耐受，对MboI敏感(图3)。

在一些实施方案中，供体基因组的一种或多种限制性核酸内切酶(内在基因组中不存在)切割内在基因组。例如，当丝状支原体LC基因组(其是GATC Dam甲基化的)被移植入山羊支原体细胞(其不是GATC Dam甲基化的)时，表达从移植基因组转录的丝状支原体LC限制性内切酶(切割未甲基化的GATC序列)导致内在山羊支原体基因组被切割成许多片段。然后移植的丝状支原体LC能够自由控制山羊支原体细胞。其它不存在于山羊支原体的丝状支原体LC限制性核酸内切酶也可以切割内在基因组。

根据本文提供的一种方法，通过利用合适的限制性修饰系统提供基因组，可以实现天然或合成生殖支原体(M.genitalium)基因组(或其它基因组，天然或合成的)的有效基因组移植。这种方法可以分为两个步骤进行。首先，将大肠杆菌Dam甲基化酶基因克隆入生殖支原体基因组，这样的话所获生殖支原体细胞具有Dam甲基化的基因组。其次，向包含甲基化酶的克隆中添加相应限制性核酸内切酶的基因。尽管该实例涉及大肠杆菌基因，但限制性甲基化系统可以来自各种生物体。这类工程化的基因组是甲基化的，并免受自身限制性系统切割。移植入不含相应甲基化的敏感株将造成内在染色体的降解。对于合成基因组来说，当所述基因组被组装入宿主生物体(和无活性的)内时，可以由宿主克隆株提供合成基因组的甲基化。根据选择性的系统和方法，移植前可以在体外进行甲基化，或可以合成供体基因组使其对相关限制性核酸内切酶具有抗性。应理解供体基因组的抗性还可以通过其它方法实现，这仍属于本文提供的各种方法的范围。

通过将受体细胞暴露于各种化合物或刺激物还可以使受体细胞基因组不能复制。例如，受体细胞可以暴露于化合物，所述化合物与受体基因组交联或使其不能复制，但随后可以从系统中去除。受体细胞还可以是被辐射过的，从而使得内源基因组不能复制，但仍能支持移植供体染色体的功能。

根据另一种系统和方法，内在染色体可以被选择性破坏而无实质改变。合适放置的lox-P位点可以从内在染色体选择性去除关键的复制组件-诸如复制的起点和终点。尽管染色体保持基本上完整，但它很难复制，即使有的话。比较起来，在存在Cre lox-P重组的条件下，不含这类识别位点的供体染色体可以更容易的复制。除了起点或终点之外的位点可以类似地造成内在染色体失去复制或有效发挥作用的能力，从而将其破坏。类似地小RNA的表达可以产生静止的(quiescent)大肠杆菌。这种RNA干扰复制。可以将供体染色体制备成对这种RNA或类似试剂不敏感。在这种情况下，从供体不敏感的染色体表达RNA或与供体不敏感的染色体共移植RNA将选择性破坏内在染色体的复制，但不显著改变染色体自身。T4-噬菌体ndd蛋白也阻止大肠杆菌染色体正确发挥作用，但是，染色体保持基本上不变。该蛋白对噬菌体基因组没有类似的作用。可以使用蛋白诸如Ndd选择性终止内在染色体的复制，但不影响供体染色体被复制的能力。

非染色体的宿主细胞

当前描述的发明的选择性实施方案要求使用非染色体的宿主或受体细胞。非染色体的细胞，亦称为微细胞，通常是异常细胞分裂的产物，包含RNA和蛋白，但几乎不含或不含染色体DNA。微细胞是不含染色体DNA的细胞的衍生物，有时被称为无核细胞。因为真细菌和古细菌细胞，与真核细胞不同，不具有细胞核(包含染色体的特殊细胞器)，这些非真核微细胞被更精确地描述为是“无染色体的”或“非染色体的”，与“无核的”相反。尽管如此，当涉及除其它微细胞之外的细菌微细胞时，本领域技术人员经常使用术语“无核的”。因此，在本文中，术语“微细胞”包括不含染色体的真细菌细胞的衍生物；不含其染色体的古细菌细胞的衍生物，和真核细胞的无核衍生物。但是应理解，相关领域的技术人员可以泛泛的使用术语“无核微细胞”或“无核细胞”来表示任何前述类型的微细胞。微细胞或血影细胞相对于受体细胞具有数个优势：保留它们的内源基因组或人造细胞样结构，诸如脂质体，因为微细胞的细胞质包含酶机器以允许和指导从外源基因组或人工染色体合成蛋白。

各种细菌已经被证明产生微细胞。例如，美国专利号4,190,495(其在此完整引入作为参考)涉及大肠杆菌的微细胞生产株，其据称被用于蛋白的重组表达。美国专利号7,183,105(其在此也被完整引入作为参考)描述了真细菌微细胞的产生及其作为核酸递送载体的用途。

微细胞或血影细胞(ghost cell)可以用作接受供体基因组并产生表达供体基因组的子代细胞的受体细胞。但是，当作为血影细胞靶标的受体细胞合成降解供体基因组的限制性核酸酶时，该过程被限制，即使不被阻止。因此需要一种用于血影细胞产生和子代细胞产生的基因组装入的方法。

微细胞无法分裂或生长，但仍然包含功能性细胞壁，细胞膜，核糖体，能量产生系统，并且能够将上述系统的完整性维持较长时间。根据本文提供的系统和方法，通过破坏或过表达一些参与染色体分离(SMC，ScpA，scpB，gyrB)和细胞分裂(FtsZ)的基因可以产生支原体微细胞。例如，将在生殖支原体、山羊支原体和/或Mycoplasma allzgatoris中发现的ftsZ基因克隆入穿梭质粒，所述穿梭质粒包含来自这些支原体中每种的oriC区。ftsZ蛋白的过表达导致小-无染色体(chromosomeless)细胞以及长度可变的丝状细胞的出现(图4，图5)。

此外，在移植前可以使用破坏内在染色体的方法中的一些或全部来进行各种各样的预处理，包括涉及甲基化的那些方法。任何用于破坏或灭活内在染色体的遗传、化学或物理方法都属于本发明的范围。

在另一系统和方法中，可以在一个温度使用温度敏感的DNase来降解受体细胞基因组，然后在用于移植的第二个温度使DNase失活。类似地，染色体损伤的方法可以使用可逆DNase(大肠杆菌素E2)。该酶及其同源物可以轻易的被免疫蛋白灭活。大肠杆菌素E2在受体细胞中的活化、产生或添加降解其基因组，而相应免疫蛋白的随后活化、产生或添加保护稍后添加的供体染色体。

尽管本文描述了各种实施方案和方法，应理解它们只是为了举例说明，而不是为了限制。此外，优选的实施方案的宽度和范围不应受到任何上述示例性实施方案的限制。

商业应用

最近报道了合成细菌全基因组的能力。利用这种技术现在有可能合成编码代谢途径的基因组，所述代谢途径能够产生用于商业用途的各种产品，诸如疫苗、生物燃料和工业上有用的酶。

当前描述的技术可用于产生免疫组合物以引发生物体的免疫应答。例如，当前描述的技术可用于产生疫苗组合物。最有效的疫苗总是使用活的细胞或病毒。诸如脊髓灰质炎，牛痘或BCG。一些细菌性病原体的菌株诸如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或沙门氏菌(Salmonella sp.)具有免疫原性，这使其成为有效的疫苗；但是，迄今为止还不能有效去除所述生物体的致病性并同时保留它们的免疫原性。对于现有的基因组操作技术来说这项任务过于复杂。存在太多未知功能和已知功能的基因需要从潜在的疫苗基因组缺失或灭活。需要单独的和以组合形式完成基因去除。为了完成这项工作，存在太多种可能性需要尝试。

利用合成基因组技术，可以从包括单个基因或来自指定生物体的基因组区域的合成盒重组组装基因组，这样的话产生数千种基因组的不同变异。这种方法可以是特异性缺失和随机缺失的组合。可以将不同基因组的所述群移植入合适受体细胞，然后在体外和/或体内分析中进行筛选来寻找具有免疫原性并且不具有致病性的移植物。因此可以采用比非合成基因组技术更快捷、便宜的方式，产生更多的疫苗候选物，并筛选合适的活性。

本文描述的方法可用于产生有效治疗或预防疾病牛传染性胸膜肺炎(CBPP)的组合物，该疾病是由细菌丝状支原体小菌落株(Small Colony)引起的。这种疾病，亦称为牛胸膜肺炎，是黄牛、犁牛、水牛和瘤牛的主要病原体。该疾病在非洲、中东、南欧以及亚洲部分地区广泛传播。因此确实需要改进的疫苗。该疾病生物体是此处用于证明基因组移植的细菌的系统发育近亲属，丝状支原体大菌落株GM12，丝状支原体小菌落株不容易进行基因组操作。利用先前描述的用于产生合成生殖支原体基因组的合成基因组技术，可以将丝状支原体小菌落株细菌的各种抗原基因克隆入丝状支原体大菌落株基因组。所述方法可以移植许多不同形式的丝状支原体大菌落株基因组(向该基因组中添加丝状支原体小菌落株基因)，和产生表达所选丝状支原体小菌落株抗原的丝状支原体大菌落株细胞。预期单独的和组合使用各种不同的丝状支原体小菌落株抗原基因。一些突变体将用做活活疫苗。

当前公开方法还可用于开发生物燃料。一些真核藻类合成的油类占其干重的差不多70％。作为光合作用产物的这些油类是理想的生物燃料。产生这些油类的生物体可以在沙漠地区的水池中生长，因此不会为了产生生物燃料而占用耕地。关于这些藻类的一个问题是它们生长缓慢。利用基因组组装技术，我们可以克隆编码构成这些途径的酶的基因和重建基因以便用原核替代真核基因表达，通过改变转录启动子、翻译信号和密码子优化。可以将编码代谢途径的基因的这些盒掺入光合细菌的基因组，这样的话所获嵌合基因组可以产生作为光合作用结果的相同油类。然后将所述基因组移植入合适的受体细胞。

本发明还可用于产生工业酶或工业生物体。所述方法可用于构建丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylcum)和解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)嵌合体的基因组，该基因组具有来自前一物种的编码从葡萄糖合成乙醇所需酶的基因，以及来自后一物种的编码可有效降解纤维素的纤维素酶的基因。可以将该基因组移植入合适的受体细胞以产生能有效降解纤维素产生乙醇的细胞。

提供下列实施例为了说明而不是限制本发明。

实施例1

将丝状支原体大菌落(LC)株基因组植入山羊支原体受体细胞

选择支原体(柔膜体纲的成员)构建合成细胞。这种选择是基于该细菌分类单位特有的多种特性。支原体的基本特征是，基因组小，多数物种使用UGA编码色氨酸(而不是终止密码子)，以及完全不具有细胞壁。小基因组更容易合成，且处理时断裂的可能性更低。改变的遗传密码促进在大肠杆菌中的克隆，因为它减少了支原体蛋白的表达。细胞壁的缺失使得这些细菌的外表面类似于真核细胞的质膜，以便我们能用成熟将大DNA分子插入真核细胞的方法，简化我们将基因组装入受体细胞的任务。

我们的合成基因组基于生殖支原体(Mycoplasma genitalium)，其具有在纯性培养物中生长的任何细胞的最小基因组(580Kb)(2，3)。尽管我们的合成基因组基于生殖支原体染色体的模式，但利用两种生长更快的支原体物种(丝状支原体亚种丝状大菌落株GM12和山羊支原体亚种山羊株Californiakid)分别作为供体和受体细胞来开发基因组装方法。这些生物体均是山羊的机会病原体，但是可以在BL2条件下在实验室中生长。它们分别每隔80和100分钟分裂一次；而生殖支原体(用做最近公开的合成基因组的模型的生物体)每9-10个小时才分裂一次。这些生长更快的支原体的使用加速了我们开发合成性生殖支原体基因组的移植方法的任务。

丝状支原体LC和山羊支原体是支原体丝状亚组内的不同物种。测定这两种基因组的序列以确定亲缘程度。两个基因组的比较显示，丝状支原体LC基因组1,083,241bp序列草图的76.4％可对应于(map to)1,010,023bp山羊支原体基因组(Genbank登录号NC 007633.5)，该部分相当于平均91.5％的核苷酸同一性。剩余～24％的丝状支原体LC基因组包含大量未在山羊支原体中发现的插入序列。该全基因组鸟枪项目已经保存于DDBJ/EMBL/GenBank，项目登录号为AAZK00000000。该实施例描述的版本是第一版，AAZK01000000。

为实现所述物种间基因组移植，尝试了多种方法。该过程有三个关键阶段：(1)从丝状支原体LC分离完整无损(intact)的供体基因组，(2)制备受体山羊支原体细胞，以及(3)将分离的基因组装入受体细胞。选择这种基因组移植方向是基于发现，含丝状支原体LC复制起点(oriC)的质粒可在山羊支原体中复制，而含山羊支原体oriC的质粒不在丝状支原体LC中复制。

制备供体基因组DNA

在溶液中对完整染色体进行操作使DNA暴露于可引起断裂的剪切力。因此重要的是，在去污剂和蛋白水解酶处理期间通过将细胞悬浮在琼脂糖块中而使基因组操作减至最少。完整无损的染色体被固定在最初容纳细胞的琼脂糖空洞中。然后将消化的蛋白成分，脂质，RNAs，和剪切的基因组DNAs通过透析或电泳与固定的完整基因组DNA分离。

利用BIO-RAD的CHEF MAMMALIAN GENOMIC DNA PLUG KIT进行完整基因组DNA的分离。简单来说，包含四环素抗性(tetM)和β半乳糖苷酶基因(lacZ)的丝状支原体LC细胞在37℃添加10μg/ml四环素和10μg/ml链霉素的SP4培养基中生长到中等密度。向培养基中添加链霉素将在后面描述。50-100ml经培养的细胞在10℃通过4,575g离心15分钟沉淀。将细胞重悬于20ml 10mM Tris pH 6.5加0.5M蔗糖，如前所述进行沉淀，再次重悬至1ml(-1到5×10⁹细胞/ml)。将细胞悬液在50℃温育15分钟，然后与等体积的溶于1×TAE缓冲液[40mM Tris-醋酸盐，1mM EDTA]的2％低熔点(LMP)琼脂糖混合。置于50℃ 5分钟后，将细胞和LMP琼脂糖(2ml)的混合物按100pl等分到胶块模具(plug mold)中。20个胶块(plug)在4℃凝固。通过添加6ml蛋白酶K反应缓冲液[100mM EDTA，pH 8.0，0.2％脱氧胆酸钠；1％月桂基肌氨酸钠]和240pl蛋白酶K，将包埋的支原体细胞在50℃裂解和蛋白消化24小时。然后在室温搅拌条件下将20个胶块用20ml 1×TE缓冲液[Tris-HCl(20mM)-EDTA(50mM)；pH 8.0]清洗4次，共1小时，将其保存于4℃的10ml TE缓冲液中。

为证明温和制备基因组DNA产生完整的环状分子。在溶于TAE的1％LMP凝胶中，利用钳压均匀电场(contour-clamped homogeneous electric field，CHEF DR.III；BIO-RAD)，对一些琼脂糖胶块进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)。在24小时内，按照3.5V/cm，将脉冲时间从60秒上升到120秒。迁移后，从孔中取出胶块，将其保存于4℃的10ml[Tris-HCl(20mM)-EDTA(50mM)；pH 8.0]缓冲液，以备染色体移植实验中用作完整基因组DNA的来源。在PFGE期间，有可能完整的环状细菌染色体被琼脂糖捕获而不迁移，但全长线性DNA、以及更小的DNA片段、RNA、蛋白和任何其它带电的细胞分子在去污剂和酶消化后仍被电泳至所述胶块以外。在被SYBR金(Molecular Probes)染色的脉冲场凝胶中(图7A)，有与1.125MB线性DNA分子量标志(与丝状支原体LC基因组差不多大小)共电泳的DNA条带，还有加样孔处的较强条带，表明大量DNA仍然在胶块中。对胶块进行彻底消化，用质粒安全型ATP依赖性DNA酶(EPICENTRE BIOTECHNOLOGIES)切出1.125MI3条带，这使得胶块中DNA的量相对不变，而1.125MB条带中的DNA被降解(图7B)。质粒安全型ATP依赖性DNA酶将线性双链DNA消化成脱氧核苷酸，而对闭环的和线性的单链DNA效率较低。该酶对有切口的或闭环的双链DNA或超螺旋DNA没有活性。这提示在胶块中存在大量环状基因组DNA。

对胶块进行分析以证实其中包裹的DNA是裸露的。将胶块在SDS中煮沸，再上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶，结果未显示可检测水平的蛋白，表明至少绝大多数的DNA是裸露的(图10)。染色体去蛋白作用的效率的进一步证据来自质谱分析，这是一种更灵敏的技术。在进行PFGE之前，琼脂糖胶块中不存在丝状支原体LC肽，而在进行PFGE之后，胶块中有几乎检测不到的量的多种不同丝状支原体LC肽。不同的胶块具有不同的肽。

供体基因组制备的最后步骤需要从琼脂糖包裹中释放DNA。在移植实验前，将包含丝状支原体LC基因组DNA的琼脂糖胶块(PFGE前或后)，用1ml 0.1×TE缓冲液[Tris-HCl(2mM)-EDTA(5mM)；pH 8.0]，在温和搅拌条件下，洗2次，共30分钟。将缓冲液完全弃去，在65℃将琼脂糖胶块用1/10体积的10×beta-琼脂糖酶缓冲液[10mM bis Tris-HCl(pH 6.5)，1mMEDTA]熔化10分钟。熔化的琼脂糖被冷却到42℃维持10分钟，然后在相同温度，使每100μl胶块与2.5个单位的beta琼脂糖酶I(NEW ENGLANDBIOLABS)一起温育过夜。每个胶块据计算包含大约10μg DNA(-8×10⁹基因组)。总之，这些数据表明，所述胶块包含大量的完整、环状、超螺旋、和裸露的丝状支原体LC基因组DNA。

从生长在含氨基糖苷类抗生素链霉素的培养基中的丝状支原体LC细胞制备供体基因组DNA，使基因组移植效率加倍。链霉素可使基因组变得致密，从而改变供体基因组的外表。对在不含链霉素时生长的细胞中分离的供体DNA进行荧光显微照相，发现有DNA纤维的混杂体(mish-mash)，且混有少许亮点(图11A)。当丝状支原体LC培养物在含链霉素的SP4培养基中生长时，可视为亮点而不是纤维的DNA要多得多(图11B)。亮点被认为代表环状超螺旋形式的基因组。

受体细胞制备和基因组移植反应条件

山羊支原体受体细胞在含17％胎牛血清和0.5％葡萄糖的6ml SOB培养基中制备，37℃温育，直至培养基pH为6.2，然后在10℃用4,575g离心15分钟来沉淀细胞。发现继续生长将使培养基更酸化，导致受体细胞更不适于基因组移植。当pH从7.4降至6.2时，常规的卵圆形山羊支原体细胞显著改变形状。细胞变得更长，更薄并出现分枝(图12)。细胞用[Tris 10m.M-NaCl250m.M(pH 6.5)]清洗一次，用200μl CaCl₂(0.1M)重悬，在冰上放置30分钟。在此期间，利用大口径的基因组移液管头，将20μl beta-琼脂糖酶处理的胶块(～50ng/μl)小心转移至400μl无血清SP4培养基(SP4(-))，室温温育30分钟。为进行基因组移植，将山羊支原体细胞与10μg酵母tRNA(Invitrogen)混合，温和转移至含20μl丝状支原体LC全基因组DNA的400μl SP4(-)。添加等体积的2×融合缓冲液[Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM，聚乙二醇8000(PEG)10％]，将管温和摇晃一小会，使内容物混合。37℃50分钟后，添加10ml SP4，37℃将细胞温育3小时，以便回收。最后，细胞在10℃以4,575g离心15分钟，重悬于0.7ml SP4，铺到含3μg/ml四环素和150μg/ml X-Gal的SP4琼脂平板上。用其它抗生素如氯霉素和链霉素进行处理也被发现显著增加移植效率。

平板在37℃温育，直至～3天后形成大的蓝色菌落(假定为丝状支原体LC)。为了将移植培养物被来自供体基因组制备过程的丝状支原体LC细胞污染的风险降到最低，细胞培养工作使用三个不同的通风橱：一个用于丝状支原体LC供体细胞制备，一个用于山羊支原体，一个用于移植克隆。有时，在～10天后，可以观察到蓝色和白色的较小菌落(假定为山羊支原体)。挑取单个菌落，在包含5μg/ml四环素的肉汤培养基中生长。在增殖期间，将四环素浓度逐渐增加到10μg/ml。当该技术刚被开发出来时，它对所有胶块都进行PFGE，后来发现这个步骤不是必需的。胶块经历PFGE之后，未观察到移植产率的显著差异。

每个实验中包括两个阴性对照。为了确保丝状支原体基因组DNA不包含活细胞，一个对照完全如上述处理但不使用山羊支原体受体细胞。类似地，在另一个对照中，山羊支原体受体细胞被模拟(mock)移植但其实不使用任何供体DNA。一系列实验的结果显示于表1。在不含受体细胞的对照中不曾观察到菌落，因此供体DNA不含任何污染的丝状支原体LC活细胞。

表1.显示对照的一系列实验的结果。

^*此实验后又进行了6次实验，但此处未列出未产生移植克隆的实验。

这些实验中更高的基因组移植效率归因于在培养丝状支原体LC供体基因组的SP4培养基中含链霉素。

假定移植物的分析

如果基因组被成功地移植，则可以预期会出现因丝状支原体LC基因组移植所致的蓝色、四环素抗性菌落。但是，具有该表型的菌落还可以因包含tetM和lacZ基因的丝状支原体LC基因组DNA片段重组至山羊支原体基因组中所致。为了排除重组，检查所移植的克隆的表型和基因型。

基因型分析

利用对每个物种特异的引物通过PCR分析数个移植克隆，以确定假定的移植物是否具有除了所选的tetM和lacZ标记基因以外的丝状支原体LC序列。使用对IS1296插入序列特异的PCR引物，所述IS1296插入序列在测序的丝状支原体LC基因组中存在11个拷贝，而不存在于山羊支原体基因组。类似地，使用对山羊支原体精氨酸脱亚胺酶基因特异的PCR引物，所述精氨酸脱亚胺酶基因不存在于丝状支原体LC。只有当模板是丝状支原体野生型株或移植克隆中的一种时，IS1296 PCR才产生扩增子。类似地，当使用山羊支原体模板DNA时山羊支原体精氨酸脱亚胺酶PCR产生扩增子，但当使用丝状支原体LC wt DNA或来自移植克隆的DNAs时，上述PCR不产生扩增子。PCR实验未排除以下可能性，包含IS1296、tetM基因和lacZ基因的丝状支原体LC基因组片段以破坏精氨酸脱亚胺酶基因的方式重组入山羊支原体基因组(图13)。一种更可信的查看整个基因组的基因型分析利用了对供体和受体支原体以及一系列假定移植物进行的Southern印迹分析。来自所述物种中每一种的基因组DNA用限制性内切酶HindIII消化，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。制备Southern印迹，用IS1296序列检测。与预期一致，没有探针与野生型山羊支原体泳道杂交(图8)。对获得的每个移植物(＞200)以及一系列丝状支原体LC克隆(图14)进行这种分析。结果观察到，尽管野生型丝状支原体和假定移植物有多个Southern印迹相同，但也有一些显示不同带型。推测这是IS元件转座的结果。对30个未移植的丝状支原体LC样品以及71个移植物进行印迹分析，发现这些移植物中含IS1296的片段更为多样化。我们假设：尽管丝状支原体LC细胞中的IS1296元件的迁移率在一定程度上被抑制，但当供体基因组被导入山羊支原体细胞质时，移植物的初始阶段可能不存在抑制。然后对从两个移植物克隆产生的全基因组文库进行样品测序。对每个克隆的基因组超过1300个序列读数(＞1×基因组覆盖)的分析显示，所有读数符合丝状支原体LC序列。未发现只有山羊支原体才有的序列。在不符合丝状支原体LC或山羊支原体基因组序列的24个读数中，大部分是非常短的读数(＜200碱基)或嵌合克隆的结果，这预计是丝状支原体LC中的活性转座子所致，且这也是文库构建的一部分。上述结果全部符合以下假设：丝状支原体LC基因组被成功导入山羊支原体，然后在抗生素筛选期间山羊基因组丢失。

表型分析

采用两种方式检查所移植克隆的表型。一种方式检查这两种支原体各自特征性的单基因产物。使用菌落Western印迹，利用对山羊支原体VmcE和VmcF表面抗原特异的多克隆抗体、以及对丝状支原体LC VchL表面抗原特异的单克隆抗体，检测供体和受体细胞菌落以及来自4个不同移植物的菌落。在这两种分析法中，移植物印迹结合丝状支原体LC VchL特异性抗体的强度与丝状支原体LC VchL结合丝状支原体LC印迹的强度相同(图15)。类似地，移植物印迹不结合对山羊支原体VmcE和VmcF特异的抗体。此外，对所有3个菌株的细胞裂解物，利用2维电泳(2-DE)凝胶的差异展示进行蛋白质组分析，然后用基质辅助的激光解吸电离(MALDI)质谱法鉴定蛋白样点。令人惊讶的是，丝状支原体LC和移植克隆的2-DE样点模式在2-DE限度内是相同的，而山羊支原体多个2-DE样点模式是非常不同的。各凝胶之间有超过50％的对应样点不能匹配(图9A-C)。从MALDI-MS数据获得更多证据证明，移植物蛋白质组与丝状支原体LC蛋白质组相同，但不具有任何山羊支原体特征。对于近90个所鉴定的移植物样点，利用Mascot算法获得的置信度分数总是丝状支原体LC的等于或高于山羊支原体蛋白的，尽管存在高序列同源性。有94个MS/MS分数唯一地匹配丝状支原体LC蛋白的肽序列(Mascot预期值为0.11-3.8×10^-11)，未发现唯一匹配山羊支原体的肽。在一个实施例中，图9D显示乙酸激酶(acetate kinase)的肽只匹配相应丝状支原体LC蛋白的序列。故所述表型分析也表明，这些移植物是丝状支原体LC，而不是移植丝状支原体LC基因组后、两个基因组通过细胞分裂分离之前、供体与受体细胞基因组之间的重组产生山羊支原体-丝状支原体LC嵌合体。

基因组移植效率的优化

为了确定何种因素控制基因组移植效率，改变移植实验中使用的山羊支原体受体细胞的数量和丝状支原体LC基因组DNA的量。当使用10⁷-5×10⁷个细胞时，移植物产率是最佳的。在较低的供体DNA浓度，移植的基因组DNA的量与移植物产率之间存在线性关系。该产率在更高的供体DNA浓度达到平台期(表2)。在后面的实验中发现，将5％PEG 6000(Fluka)替换为5％PEG 8000(USB)，如上述实验中所用，导致移植效率增加大约5×(表S3)。还观察到，供体基因组经RNase处理不消除移植。

表2.基因组移植作为所移植的丝状支原体LC基因组DNA的量的应变量

^*在两块不同平板观察到的移植物菌落。

表S3.PEG来源和分子量对基因组移植效率的影响

这些数据证明，全基因组从一个物种移植到了另一个物种，且所得的子代是与供体基因组相同的物种。但是它们没有解释移植的机制。鉴于支原体因不含细胞壁而类似于哺乳动物细胞，尝试了一系列有效将大DNA分子转移入真核细胞的方法。这些方法包括，阳离子去污剂介导的转染，电穿孔，以及利用各种阳离子试剂进行的供体基因组压缩(compaction)。虽然这些方法中没有一种被证明对全基因组移植有效，但基于PEG的方法可能类似于针对真核细胞开发的PEG驱动细胞融合方法。为了检验这种假设，制得山羊支原体的两种亲代株(一种在染色体载有tetM标记，另一在稳定的oriC质粒中含氯霉素抗性标记(CAT))作为“受体”细胞，在上述移植实验的融合缓冲液存在的条件下混合和温育。仅在有5％PEG时获得低频率的抗两种抗生素的子代。细胞经CaCl₂预处理后，菌落数量增加大约30×(表S4)。对30个克隆进行序列分析显示，所有克隆在细胞中预期的染色体和质粒位置具有tetM和CAT标记。因此可知，利用我们基于PEG的方法，山羊支原体细胞融合。上述结果与Shlomo Rottem的膜研究一致，证明在有5％PEG时山羊支原体细胞的融合水平最高。也在很可能使细胞融合的PEG浓度介导基因向肺支原体(Mycoplasma pulmonis)中转移，但只有小DNA节段被转移。可以想象，在一些情况下，细胞可以围绕裸露的丝状支原体LC基因组融合。这些如今陷在山羊支原体胞质中的基因组表达着tetM蛋白，它们一旦铺至含四环素的SP4琼脂后，将允许大融合细胞生长和分裂。不含丝状支原体基因组的细胞不生长。最后，在无PEG的条件下，经过细胞分裂和染色体分离过程，正常但抗四环素的、产beta-半乳糖苷酶的丝状支原体细胞在平板上产生大的蓝色菌落。这种由PEG介导基因组移植的基本方法允许将其它物种植入含抗生素抗性基因的裸露基因组。文献提示，在多种常见细菌中对细胞壁进行部分消化来制备原生质体(protoplast)或球状体(spheroplast)，将使它们易于掺入大量外源DNA。尽管如此，这种类型的全基因组转移不太可能在自然界中发生。在未经SDS和蛋白酶K处理的条件下，观察到丝状支原体LC细胞的拟核(nucleoid)在去蛋白化之前不产生移植物。考虑到未必有天然存在的自由移动、且已脱蛋白的完整细菌基因组，基因组移植可以是实验室才有的现象。但仍发现第五种细菌DNA转移形式，允许以受体细胞作为平台，利用改造的天然基因组或经合成生物学家开发的方法人为产生的基因组，来产生新物种。

表S4.山羊支原体中的细胞融合

a.如基因组移植实验中所述，同时制备两种亲代株作为“受体”细胞，并在有2×融合缓冲液[Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM，聚乙二醇8000(PEG)10％]存在的条件下混合。

b.向PEG-细胞混合物中添加10个单位的DNase I(New England Biolabs)，以证明菌落来源于细胞融合而不来源于对胞外质粒DNA的摄取。

c.按(a)所述处理两种亲代株，不同的是，2×融合缓冲液不含任何PEG[Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM]

d.按(a)所述处理两种亲代株，但略去CaCl₂处理。细胞在冰上于清洗缓冲液[Tris10mM pH6.5：NaCl 250mM]中预保温30分钟。

Claims (8)

1.一种物种间基因组移植的方法，包括：

从丝状支原体大菌落物种制备分离的供体基因组；

从山羊支原体物种制备受体细胞，和

将分离的供体基因组装入受体细胞，由此用所提供的丝状支原体大菌落物种的供体基因组对受体细胞进行移植，

其中，所述受体细胞能生长和分裂，以产生供体基因组支配的细胞，所述供体基因组在表型上将所产生的细胞转化为供体基因组物种的表型。

2.权利要求1的方法，其中所述供体基因组是合成制备的。

3.权利要求1的方法，其中所述供体基因组包括筛选标记。

4.权利要求1的方法，其中在装入前从所述供体基因组去除蛋白。

5.权利要求1的方法，其中所述受体细胞包括被移植的供体基因组替换的受体基因组。

6.权利要求1的方法，其中所述供体基因组编码限制性核酸内切酶，其识别所述受体基因组的序列，但不识别所述供体基因组的序列。

7.权利要求1的方法，其中所述供体基因组是甲基化的。

8.权利要求1的方法，其中所述供体基因组是GATC Dam甲基化的。