CN101384729A - 固相测序 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了对样品中的核酸进行测序的方法，该方法基于使用末端－磷酸根－标记的核苷酸作为对于核酸聚合酶的底物。本发明的方法使用核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯或脱氧核苷多磷酸酯类似物，它们具有连接到末端－磷酸根上的生色染料、化学发光或荧光部分、质量标记或电化学标记。当核酸聚合酶使用这种类似物作为底物时，酶－活化的标记将存在于磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品上，通过磷酸酯酶切割磷酰基转移的多磷酸酯产品导致在其上连接的标记中的可测定的变化，在某些情况下标记的多磷酸酯可以通过标记而直接被测定，并且提供了关于核酸的信息。当聚合酶试验在磷酸酯酶存在下进行时，提供了方便的实时监测DNA或RNA合成和表征靶核酸的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求美国临时申请号60/445,193(2003年2月5日提交)的优先权，引入其公开的全部作为本申请的参考。
发明的领域
本申请一般地涉及对样品中的多核苷酸进行测序的方法，所述方法基于使用含有三个或多个磷酸根的末端-磷酸根-标记的核苷酸作为核酸聚合酶的底物.使用的标记是酶可活化的，并且包括化学发光、荧光、电化学和生色的部分以及质量标记.
发明的背景
在具有高度特异性和灵敏度的样品中测定特定核酸或类似物的方法是公知的，所述方法通常要求首先根据存在的特定靶序列或被分析物来扩增核酸序列，在扩增以后测定扩增的序列，并且进行定量。通常的核酸测定体系包括测定荧光标记、与荧光酶相连的测定体系、抗体-介导的标记测定和放射性标记测定.
广泛使用的测定方法的一个缺点是需要从最终的标记产品或副产品中分离被标记的起始物，所述分离一般需要凝胶电泳或将靶序列固定在用于测定的膜上，但是测定经常需要很多试剂和/或温育步骤。
已知DNA和RNA聚合酶能够识别和使用在三磷酸根部分的γ位具有修饰或替代的核苷.还已知各种聚合酶识别和使用γ-修饰的核苷酸三磷酸酯(NTP＇s)的能力看来十分依赖于与γ-磷酸根连接的部分。一般来说RNA聚合酶比DNA聚合酶更杂乱。
监测在γ-磷酸酯修饰的核苷酸存在下从RNA聚合酶合成RNA的比色试验以前已经被报道过。在该在先报道中，RNA聚合酶反应在γ-修饰的碱性磷酸酯酶抗性的核苷三磷酸酯存在下进行，后者在其γ-磷酸酯处被二硝基苯基基团修饰.当RNA聚合酶反应在这样的γ-修饰的NTP作为单核苷三磷酸酯和均聚模板存在下进行时，发现RNA聚合酶能够识别和使用修饰的NTP。但是当聚合酶反应在碱性磷酸酯酶存在下进行时，它消化磷酰基转移的对-硝基苯基焦磷酸酯羟醛产品(aldo-product)，形成生色的对-硝基苯基酯，并且报道了吸收的提高。该测定方法的缺点是在碱性磷酸酯酶存在下实时(real-time)的比色试验仅仅能够使用均聚模板进行，因此不能用于杂聚模板的序列分析.
因此提供在杂聚模板存在下测定RNA的方法是有利的，该方法不限于使用单一末端-磷酸根修饰的核苷酸作为唯一的核苷酸(后者基本上对于磷酸酯酶不反应)，该方法允许使用杂聚模板进行单管试验来对RNA的合成进行实时监测.
更有利的是该方法能够为RNA提供类似的试验，其中在末端-磷酸根上的标记的身份是不同的，以允许通过RNA聚合酶更好地识别和使用.另外理想的是末端-磷酸根上的标记可以不同，这样可以进行化学发光和荧光测定，通过质量或还原电位进行分析，以及改进生色测定，同时测定仅需要简单和常规的仪器.
由于本领域已知在识别和使用末端修饰的核苷酸时DNA聚合酶比RNA聚合酶较少杂乱，其中末端位置上的部分的身份能够极大地影响DNA聚合酶对于核苷酸的特异性，提供通过监测DNA聚合酶活性来测定DNA的非放射性方法是更理想的，而且DNA的合成和序列测定能够在单管试验中完成实时监测，以及在核苷酸底物的末端-磷酸根上的标记可以包括化学发光、荧光和生色测定，以及通过质量和还原电位进行分析.
发明的概述
本发明提供测定核酸序列存在的方法，包括以下步骤：a)进行核酸聚合酶反应，其中所述的反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸的反应，该反应的结果产生标记的多磷酸酯；b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应，产生可测定的物种；和c)测定可测定物种的存在。在本发明中，磷酸酯酶的定义包括能够断裂磷酸单酯、磷酸硫酯、氨基磷酸酯、多磷酸酯和核苷酸而释放出无机磷酸根的任何酶，在本发明的上下文中，这种酶不断裂末端标记的核苷磷酸酯(即末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯实质上对磷酸酯酶不反应)。本文所述的磷酸酯酶的定义特别地包括，但是不限于碱性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)和酸性磷酸酯酶(EC 3.1.3.2)。在本发明中核苷酸的定义包括天然或修饰的核苷磷酸酯。
本发明进一步提供一种对核酸序列进行测序的方法，包括a)固定测序反应的一个关键组分，例如多聚酶、引物、模板或通过混合两种或多种这些组分而形成的复合物，b)进行杂交，除非在步骤a)以前已经进行过杂交，c)在核酸聚合酶、磷酸酯酶和末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯存在下温育，假如存在的核苷酸在聚合位点处与靶序列是互补的，则该反应产生多磷酸酯.标记的多磷酸酯然后与磷酸酯酶或磷酸酯或多磷酸酯转移酶反应，产生容易区别于磷酸酯结合的染料的有信号的游离标记(free label).假如加入的核苷酸在聚合位点处与靶序列不互补，就没有聚合反应的发生，并且不产生游离标记，因此游离标记的形成可以鉴定加入的碱基和靶序列.在允许聚合反应进行足够的时间(时间从微秒导几分钟)和测定信号存在或不存在以后，可以通过任何本领域公知的方法将固体载体从溶液中分离，包括但是不限于洗涤、过虑、浓缩、滗析等方法，并且在新鲜的聚合酶(假如需要)和磷酸酯酶存在下加入下一个核苷酸.应该注意在聚合已经进行以后可以加入磷酸酯酶.
按照上述说明，本发明提供对核酸模板的靶区域进行测序的方法，包括：
a)在固体载体上进行核酸聚合反应以形成反应混合物，所述的反应混合物包括核酸模板、引物、核酸聚合酶和选自带有天然碱基或碱基类似物的核苷的一个末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯；
其中将所述反应混合物的一种组分或两种或多种所述组分的复合物固定在所述固体载体上，所述组分选自由所述核酸模板、所述引物和所述核酸聚合酶组成的组，以及
假如所述的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯在聚合位点处含有与模板碱基互补的碱基，则所述反应的结果产生多磷酸酯；
b)将所述的反应混合物用磷酸酯酶处理，其中假如所述标记的多磷酸酯在步骤a)中产生，则产生可测定的物种；
c)测定所述的可测定物种；
d)通过将选自其余的天然碱基或碱基类似物的不同的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯加入反应混合物，继续所述的聚合反应，并且重复步骤b)和c)；和
e)从所述的导致可测定物种产生的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的身份和加入顺序来鉴定所述的靶区域序列。
本发明还提供在连续流动或停止-流动体系中使用上述步骤对靶进行测序的方法，其中通过本领域任何一个公知的方法将固定化的材料固定就位，并且将不同的试剂和缓冲剂从体系的一端泵入，从体系的另一端排出。试剂和缓冲剂可以连续流动或被固定就位一段时间，使聚合反应和磷酸酯酶的水解得以进行。
本发明还提供测定DNA序列存在的方法，包括以下步骤：a)在末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应，其中反应结果产生标记的多磷酸酯；b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应，产生可测定的物种；和c)测定存在的可测定的物种.
本发明还提供测定存在的核酸序列的方法，包括以下步骤：(a)在至少一种在多磷酸酯链上具有四个或更多磷酸根基团的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应，反应结果产生标记的多磷酸酯；和(b)测定标记的多磷酸酯.
按照上述说明，本发明提供对核酸模板的靶区域进行测序的方法，包括：
a)通过形成反应混合物在固体载体上进行核酸聚合反应，所述反应混合物包括核酸模板、引物、核酸聚合酶和一个带有四个或更多个磷酸根的、选自带有天然碱基和碱基类似物的核苷的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯，并且
其中将所述反应混合物的一种组分或两种或多种组分的复合物固定在所述固体载体上，所述的组分选自由所述核酸模板、所述引物和所述核酸聚合酶组成的组，假如所述末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯在结合位点处含有与模板碱基互补的碱基，则所述反应结果产生标记的多磷酸酯；
b)测定所述的标记的多磷酸酯；
c)通过将选自其余的天然碱基或碱基类似物的不同的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯加入所述反应混合物中继续所述的聚合反应，并且重复步骤b)；以及
d)从导致所述标记的多磷酸酯产生的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的身份和加入顺序来鉴定所述的靶区域序列。
另外本发明涉及测定核酸序列存在的方法，包括以下步骤：a)在至少一种在多磷酸酯链中有四个或多个磷酸根基团的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应，其中反应结果产生标记的多磷酸酯；b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应，产生可测定的物种；和c)测定存在的可测定的物种。
本发明的另一方面涉及对核酸进行定量的方法，包括以下步骤：(a)进行核酸聚合酶反应，其中反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸的反应，反应导致标记的多磷酸酯的产生；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应，产生可测定的副产品物种，其数量基本上和核酸的数量成比例；(c)测量可测定的物种；和(d)使用公知的标准对测定值进行比较，来确定核酸的量.
本发明还涉及定量DNA序列的方法，包括以下步骤：(a)在末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应，反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的副产品物种，其数量基本上和DNA序列的数量成比例；(c)测量可测定的物种；和(d)使用公知的标准对测定值进行比较，来确定DNA的量.
本发明的另一方面涉及测定在核酸序列中的单个核苷酸的身份的方法，包括以下步骤：(a)在至少一种末端磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应，反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种；(c)测定存在的可测定物种；和(d)确定掺入的核苷.
本发明还提供确定核酸序列中的单个核苷酸的身份的方法，包括以下步骤：(a)在至少一种在多磷酸酯链上具有四个或多个磷酸根基团的末端磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应，反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种；(c)测定存在的可测定物种；和(d)确定掺入的核苷.
本发明还包括核酸测定试剂盒，其中所述的试剂盒包括：
a)至少一种或几种根据下式的末端-磷酸根-标记的核苷酸：
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是2或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，当磷酸根被除去以后它变为可独立地测定的，
其中L是酶可活化的标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基；
b)至少一种DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶；和
c)磷酸酯酶.
本发明还提供另一核酸测定试剂盒，包括：
a)至少一种根据下式的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是3或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，
其中L是标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、膦酸酯、硫酯、或氨基磷酸酯键的羟基、卤烷基、巯基或氨基；
b)至少一种选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶组成的组的酶。
附图的简要说明
图1显示在模板-定向方法中在磷酸酯酶存在下通过利用γ-磷酸根-标记的ddGTP的聚合酶得到的荧光。
图2显示在模板-定向方法中在磷酸酯酶存在下通过利用γ-磷酸根-标记的ddATP的聚合酶得到的荧光.
图3表示在磷酸酯酶存在下在顺序加入末端-磷酸根-标记的核苷酸后得到的相对荧光.
图4表示在流通或停止-流动体系中使用末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯测序的图解。
优选实施方案的详细说明
本文定义的术语“核苷”是包括嘌呤、去氮杂嘌呤、嘧啶或在1＇位或等价位置上连接到糖或糖替代物，如碳环或非碳环的部分上的修饰的碱基，包括2＇-脱氧和2＇-羟基以及2＇，3＇-二脱氧形式以及其它取代.
本文定义的术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，其中的酯化位点通常对应于连接到戊糖的C-5位上的羟基。
本文定义的术语“寡核苷酸”包括核苷酸或其衍生物的线型低聚体、脱氧核糖核苷、核糖核苷等.在全部说明书中，寡核苷酸是用字母的序列表示的，核苷酸是从左到右的5＇-3＇的顺序，除非另有说明，其中A是脱氧腺苷，C是脱氧胞苷，G是脱氧鸟苷，T是胸苷。
术语“引物”是指线型寡核苷酸，它以特定的方式退火为独特的核酸序列上，并且允许扩增该独特的序列.
术语“靶核酸序列”等是指其序列的身份或核苷的顺序或位置由一种或几种本发明的方法确定的核酸。
本发明涉及对样品中的多核苷酸进行测序的方法，其中使用常规的试验通过核酸聚合酶活性来监测RNA或DNA的合成.RNA和DNA聚合酶通过将核苷单磷酸酯从核苷三磷酸酯(NTP)或脱氧核苷三磷酸酯(dNTP)转移到增长的核苷酸链的3＇羟基上来合成寡核苷酸，该反应的驱动力是酸酐键的断裂和同时的无机焦磷酸根的形成。
本发明利用这样的发现：对核苷酸的末端-磷酸根的结构修饰没有取消其在聚合酶反应中的功能，寡核苷酸的合成反应涉及仅仅在核苷酸的α-和β-磷酰基上的直接变化，使得在末端磷酸酯位置具有修饰的核苷酸作为核酸聚合酶反应的底物是有价值的。
在某些实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，如DNA聚合酶I、II或III或DNA聚合酶α、β、ν，或末端脱氧核苷酸转移酶或端粒末端转移酶。在另一实施方案中，合适的聚合酶包括但是不限于依赖于DNA的RNA聚合酶、引发酶或依赖于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶).
本发明的方法使用核苷多磷酸酯，如脱氧核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯、碳环核苷多磷酸酯或非环核苷多磷酸酯类似物，并且带有连接到末端-磷酸酯的电化学标记、质量标记或生色染料、化学发光标记或荧光标记.当核酸聚合酶使用这种类似物作为底物时，酶-可活化的标记将存在于磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品中.通过磷酸酯酶对磷酰基转移的多磷酸酯产品的断裂导致在其上连接的标记中的可测定的变化。应该注意RNA和DNA聚合酶能够识别带有修饰的末端磷酰基的核苷酸，本发明人确信这种原料不是磷酸酯酶的模板.以下的反应式显示了本发明方法中的最相关的分子；即末端-磷酸根-标记的核苷酸、标记的多磷酸酯副产品和酶-活化的标记.
上式中n是1或更大，R1和R2独立地是H、OH、SH、SR、OR、F、Br、Cl、I、N3、NHR或NH2；B是核苷碱基或修饰的杂环碱基；X是0、S或NH；Y是0、S或BH3；L是磷酸酯酶可活化的标记，它可以是生色的、发荧光的或是化学发光的分子、质量标记或电化学标记。质量标记是适合于质谱仪的小分子量部分，由于质量上的不同很容易区别于其它组分。电化学标记是容易氧化或还原的物种。曾经公开过当n是2或更大时，与当n是1时比较，核苷酸显著地是聚合酶的更好的底物。因此在优选的实施方案中，n是2、3或4，R1和R2独立地是H或OH；X和Y是0；B是核苷酸碱基和L是可以生色、发荧光或化学发光的分子的标记。
在本文提供的测定核酸序列的存在的方法的一个实施方案中，其步骤包括：(a)进行核酸聚合酶反应，其中反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸，其中的聚合酶反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯和适合于水解磷酸酯的磷酸酯酶反应，产生可测定的物种；和c)通过适当的方式测定可测定物种的存在.在所述的实施方案中，用于核酸聚合酶反应的模板可以是杂聚或均聚的模板。在全部说明书中，通过末端-磷酸根-标记的核苷酸，释放的标记的多磷酸酯随后将核苷单磷酸酯掺入到增长的核苷酸链，可以与磷酸酯酶反应产生可测定的物种.包括在实质上对磷酸酯酶不反应的反应中的其它核苷酸可以例如在末端-磷酸根处被不导致产生可测定物种的部分阻断.在该特定实施方案中，用于测定的核酸可以包括RNA、天然或合成的寡核苷酸、线粒体或染色体DNA.
本发明进一步提供测定DNA序列存在的方法，其步骤包括：(a)在末端-磷酸根标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应，其中反应导致标记的多磷酸酯的产生；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应，产生可测定的物种；和c)测定所述的可测定物种的存在.用于测定的DNA序列可以包括从细胞分离出来的DNA、化学处理的DNA，例如二硫化物(bisulfite)处理的甲基化DNA或按照本领域公知方法化学或酶促合成的DNA.所述方法包括PCR，并且记载于DNA结构部分A：DNA的合成 和物理分析(Lilley，D.M.J.和Dahlberg，J.E.(Eds.)，MethodsEnzymol.，211，Academic Press，Inc.，New York(1992))，将其作为本文的参考.DNA序列还包括染色体DNA和天然或合成的寡核苷酸，DNA可以是双-链或单-链的。
本发明的方法还包括在聚合酶反应中含有一个或多个附加的测定试剂的步骤.一个或多个附加的测定试剂是每个能够独立地应答的，在测定时彼此区别，并且和可测定的物种区别，例如一个或多个附加的测定试剂中的一个或多个可以是抗体。
在聚合酶反应中加入作为底物的合适的核苷酸包括核苷多磷酸酯，例如包括但是不限于脱氧核糖核苷多磷酸酯、核糖核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯、碳环核苷多磷酸酯和非环核苷多磷酸酯及其类似物。特别理想的是含有在多磷酸酯链上含有3、4、5或6磷酸根基团的核苷酸，其中末端磷酸根被标记.
应该注意，在包括多磷酸酯链上含有四个或更多个磷酸根的末端-磷酸根-标记的核苷酸的实施方案中，磷酰基转移的标记的多磷酸酯副产品可以不使用磷酸酯酶处理进行测定，其属于本发明期望的范围。例如天然或修饰的核苷碱基，特别是鸟嘌呤能够引起荧光标记的猝灭，因此在末端-磷酸根-标记的核苷酸中，标记可以部分地被碱基猝灭.由于加入核苷单磷酸酯，标记的多磷酸酯副产品由于其提高的荧光度而可以被测定.另外在通过荧光、颜色、化学发光或电化学测定鉴定以前，通过色谱分离方法机械地分离标记的多磷酸酯产品是可能的，此外质谱方法通过质量差别能够用于测定产品.
本发明方法包括在至少一种DNA或RNA聚合酶存在下进行聚合酶反应，合适的核酸聚合酶包括引发霉、端粒酶、末端脱氧核苷酸转移酶和逆转录酶.可以需要核酸模板用于进行聚合酶反应，并且可以被加入到聚合酶反应溶液中.可以预期在本发明测定方法中的所有的步骤(a)、(b)和(c)能够使用单一的或均相的反应混合物同时进行，以及按顺序进行.
在本发明考虑的范围内，核酸聚合酶反应可以包括使用聚合酶的扩增方法.这种方法的实例包括聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)和核酸序列碱基扩增(NASBA).例如其中靶分子是核酸聚合物如DNA时，可以通过将γ-磷酸根标记的核苷酸碱基例如腺嘌呤、胸腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或其它氮杂环碱基的PCR掺入到DNA分子中来测定它。聚合酶链反应(PCR)方法记载于Science Vol.239，P.487，1988，(Saiki等)，U.S.Patent4,683,195(Mullis等)和Molecular Cloning，(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpr ing Harbor，NY(1980)(Sambrook J.等(Eds.))，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NY(1999)(Ausubel，F.M.等(Eds.))和Recombinant DNA Methodology II，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.，NY，(1995)(Wu，R.(Ed.))。使用PCR通过将用于测定的靶核酸如DNA直接放入含有PCR试剂和适当引物的反应器中来对它进行扩增。通常选择在序列上至少与靶核酸的一部分互补的引物。
应该注意，适合于进行本发明方法步骤(a)的核酸聚合酶反应还包括扩增核酸序列的RCA方法，例如公开于U.S.专利5,854,033(Lizardi，Paul M.)的方法可以作为本文的参考。聚合酶反应还包括基于核酸序列的扩增(NASBA)，其中该体系包括扩增RNA，而不是DNA，并且扩增是等温的，发生在同一温度(41℃)下.通过NASBA扩增靶RNA涉及三种酶：逆转录酶、RNA酶H和T7RNA聚合酶的协同活性，它们与寡核苷酸引物一起定向到样品靶RNA上，这些酶在四个步骤中催化靶单链RNA的指数式扩增：四个步骤是扩展、降解、DNA合成和环状RNA扩增.
RT-PCR、RCA和NASBA的方法通常需要间接地通过定量扩增产品来测定靶核酸的起始数量.一般首先通过在琼脂凝胶上的电泳从起始物分离扩增产品，以便确信成功的扩增，然后使用任何方便的核酸测定体系，如测定荧光标记、酶-联测定体系、抗体-介导的标记测定和放射性标记测定进行定量。相比之下，本发明的方法在能够能够测定这些产品以前不需要从原料中分离聚合酶反应产品.例如本发明中的报道分子(荧光、化学发光或生色)或其它有用分子以如下的方式连接核苷酸，使得当被磷酸酯结合掩蔽时在某些条件下它是不能被测定的。但是在将核苷酸掺入增长的寡核苷酸链和用磷酸酯酶处理反应后，在所述条件下标记又是可以测定的.例如假如1，3-二氯-9，9-二甲基-吖啶-2-酮(DDAO)的三环结构一侧上的羟基连接到核苷酸的末端-磷酸酯位置，则DDAO在659nm处将不发荧光。一旦核苷单磷酸酯被掺入到DNA中，另一产品DDAO多磷酸酯(它在659nm也不发荧光)就是磷酸酯酶的底物，一旦去-磷酰基化而形成DDAO，染料部分将变为在659nm处发出荧光，因此是可以测定的。对多磷酸酯产品的特定分析能够在聚合酶反应溶液中进行，消除了从原料中分离反应产品的需要，所述方案允许测定，并且能够任选地在聚合反应期间使用常规仪器如光谱仪来定量形成的核酸。
在上述方法中，聚合酶反应步骤可以进一步包括在磷酸酯酶存在下进行聚合酶反应，该反应将多磷酸酯副产品转化为可测定的标记。这样就可以设计方便的试验以测定核酸序列的存在，允许连续监测可测定物种的形成。这代表了一种均相试验方式，因为它能够在单一试管中进行。
上述试验方法的一个方式包括，但是不限于在单一类型的、能够产生可测定物种的末端-磷酸根-标记的核苷酸，例如末端-磷酸酯-修饰的ATP的存在下进行聚合酶反应，其中所有其它的核苷酸实质上对磷酸酯酶不反应，但是产生非-可测定的物种.
在另一试验方式中，聚合酶反应可以在多于一种类型的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行，每种类型能够产生可专一性地测定的物种.例如试验可以包括第一核苷酸(即腺苷多磷酸酯)，它和第一标记缔合，当从磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品中酶促游离出来时，所述标记在第一波长处发光；并且第二核苷酸(即鸟苷多磷酸酯)缔合第二标记，后者在第二波长处发光.理想的是第一和第二波长发射基本上很少重叠或不重叠.在本发明预期的范围内还包括基于核苷酸序列信息的多个同时的试验其后能够基于从多磷酸酯释放的特定标记而被衍生得到.
在上述测定核酸序列存在的方法的另一方面中，末端-磷酸根-标记的核苷酸可以用下式表示：
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是2或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，当磷酸酯被除去以后它变为可独立地测定的，
其中L是酶-可活化的标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基；
在上述测定核酸序列存在的方法的另一方面中，其中可测定的物种是可标记的多磷酸酯、末端-磷酸根-标记的核苷酸，可以用下式表示：
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是3或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，
其中L是标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、膦酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、卤代烷基、巯基或氨基。
对于本发明方法的目的，有用的碳环部分记载于Ferraro，M.和Gotor，V.的Chem Rev.2000，volume 100，4319-48；合适的糖部分记载于Joeng，L.S.等人的J Med.Chem.1993，vol.356，2627-38；Kim H.0.等人的J Med.Chem.193，vol.36，30-7；和EschenmosserA.的Science 1999，vol.284，2118-2124.另外有用的非环部分记载于Martinez，C.I.等人的Nucleic Acid Research 1999，vol. 27，1271-1274；Martinez，C.I.等人的Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997，vol.7，3013-3016；和U.S.Patent5,558，91(Trainer，G.L.)。这些部分的结构表示如下，对于所有的部分R可以是H、OH、NHR、F、N3、SH、SR、OR、低级烷基或芳基；对于糖的部分，X和Y独立地是0，S或NH；对于非环部分X＝0、S、NH、NR.
碳环部分
糖部分
非环部分
在某些实施方案中，糖部分用下式表示：
它可以选自：核糖基、2＇-脱氧核糖基、3＇-脱氧核糖基、2＇，3＇二脱氢二脱氧核糖基、2＇，3＇-二脱氧核糖基、2＇-或3＇-烷氧基脱氧核糖基、2＇-或3＇-氨基脱氧核糖基、2＇-或3＇-氟脱氧核糖基、2＇-或3＇-巯基脱氧核糖基、2＇-或3＇-烷硫基脱氧核糖基、非环、碳环和其它修饰的糖.
而且上式中的碱基可以包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤或其类似物.
对于本发明优选的实施方案，其中的标记是在磷酸酯酶处理以后被活化的，连接在末端-磷酸根-标记的核苷酸中的末端-磷酸根位置上的标记可以选自由1，2-二氧杂环丁烷化学发光化合物、产生荧光的染料、生色染料、质量标记和电化学标记组成的组.这将允许可测定的物种因存在颜色、荧光发射、化学发光、质量变化、电化学测定中的任何一个或其组合而可被测定.可用于本发明中的某些染料列于表1中，在本发明的范围内也可以使用作为上述染料的衍生物的其它染料，以及在除去磷酸根基团以后在物理或化学性质上发生可测定变化的其它染料.
其中下式中的磷酰基代的标记：
是发荧光的部分，它理想地选自以下(全部以磷酸单酯表示)：以商品名ELF97出售的2-(5＇-氯-2＇-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮(Molecular Probes，Inc.)、荧光素二磷酸酯(四铵盐)、荧光素3＇(6＇)-O-烷基-6＇(3＇)-磷酸酯、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(二铵盐)、4-甲基伞形酰基磷酸酯(游离酸)、试卤灵磷酸酯、4-三氟甲基伞形酰基磷酸酯、伞形酰基磷酸酯、3-氰基伞形酰基磷酸酯、9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯、6，8-二氟-4-甲基伞形酰基磷酸酯及其衍生物.所述染料的结构如下所示：
2-(5＇-氯-2＇-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮
荧光素二磷酸酯荧光素3＇(6＇)-O-烷基-6＇(3＇)-磷酸酯
9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(二铵盐)
4-甲基伞形酰基磷酸酯
6，8-二氟-4-甲基伞形酰基磷酸酯
4-三氟甲基伞形酰基磷酸酯
伞形酰基磷酸酯
3-氰基伞形酰基磷酸酯
试卤灵磷酸酯
9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯
其中下式中的磷酰基化的标记部分：
是生色部分，它可以选自以下：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、3-吲哚氧基磷酸酯、对-硝基苯基磷酸酯及其衍生物.这些生色染料的结构作为磷酸单酯表示如下：
溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(二钠盐)
3-吲哚基磷酸酯(二钠盐)
p-硝基苯基磷酸酯
1-在末端-磷酸根位置的部分还可以是化学发光化合物，其中理想的是它是磷酸酯酶-活化的1，2-二氧杂环丁烷化合物.1，2-二氧杂环丁烷化合物可以包括，但是不限于2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2＇-(5-氯-)三环[3，3，1-13，7]-癸-1-基)-1-苯基磷酸酯二钠盐，CDP-Star(商品名)(Tropix，Inc.，Bedford，MA)、氯金刚烷-2＇-亚基甲氧基苯氧基磷酰基二氧杂环丁烷，CSPD(商品名)(Tropix)，和3-(2＇-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3＂-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷，AMPPD(商品名)(Tropix).这些市场上可以买到的二氧杂环丁烷化合物分别记载于US专利5,582,980、5,112,960和4,978,614，并且作为本文的参考.
对于涉及标记的多磷酸酯的测定的本发明的实施方案，可以使用任何来自公知类型的荧光或生色染料的荧光染料或生色染料，例如呫吨、花青、卟啉、香豆素、bodipy染料、merro花箐、芘、偶氮染料等，它们可以被适当地官能化，以便连接到磷酸酯上.这些染料是公知的，并且可以从市场上买到.作为标记的多磷酸酯的很容易测定的染料的实例列于表2中.
表2：以标记的多磷酸酯形式可被测定的可测定物种的实例
若丹明绿羧酸 羧基-荧光素
芘 丹酰
Bodipy 二甲基氨基香豆素羧酸
Eosin-5-异硫氰酸酯 甲氧基香豆素羧酸
Texas Red Oregon绿-488羧酸
ROX TAMRA
蒽-异硫氰酸酯 Cy3
Cy3.5 Cy5
Cy5.5 苯胺
-磺酸
上述方法还包括定量核酸序列的步骤.一方面测定物种能够以实质上与扩增的核酸序列数量成比例的数量产生.定量核酸序列的步骤通过将由可测定物种产生的光谱与已知的光谱进行比较来完成是理想的。
本发明还包括对核酸序列进行测序的方法，a)固定将测序反应的关键的组分之一，如聚合酶、引物、模板或通过混合两种或多种所述组分而形成的复合物，b)进行杂交(除非在步骤a)中已经进行过)，c)在核酸聚合酶、磷酸酯酶和末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯存在下温育.假如存在的核苷酸在聚合位点处与靶序列互补的话，则所述反应产生标记的多磷酸酯.然后标记的多磷酸酯与磷酸酯酶或磷酸酯或多磷酸酯转移酶进行反应，产生具有容易区别于磷酸酯键合的染料的信号的游离标记.假如加入的核苷酸和靶序列在聚合位点处不互补，就不发生聚合，就没有游离标记产生。因此形成游离的标记能够鉴定加入的碱基以及靶序列.在允许聚合反应进行足够的时间以后(几微秒到几分钟)，测定有或没有信号，通过本领域公知的方法将固体载体从溶液中分离，包括但是不限于洗涤、过滤、浓缩、滗析等。可以在新鲜的聚合酶(假如需要)和磷酸酯酶存在下加入下一个核苷酸，加入末端-磷酸根标记的核苷酸(它实际上形成可测定的物种)的顺序决定靶核酸的序列，它应当与加入的碱基互补。还应该注意在聚合已经进行以后可以加入磷酸酯酶。
在本发明的一个方面中，可以按照上述方法探测靶核酸中已知序列的存在，在该情况下我们可以选择以准确的顺序加入末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯，该顺序预料能够导致掺入互补的碱基。换句话说，假如预期靶序列是ACGGTA，则末端标记的核苷多磷酸酯可以以TGCCAT的顺序被加入。
另一方面我们可以选择以预置的顺序加入末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯，并且以循环方式重复该顺序，无论是探测靶核酸中的已知的序列还是未知的序列都可以进行这种操作。例如我们可以以顺序AGCT加入末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯，并且重复该顺序任何次数的循环.
正如下述更详细地讨论的只要互补性被保留，这些末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯就可以含有天然的碱基或其类似物.
本发明还提供在连续流动或停止-流动体系中采用上述步骤对靶序列进行测序的方法，其中通过本领域任何一个公知的方法将固定材料固定就位，将不同的试剂和缓冲液从体系的一端泵入，从体系的另一端排出。试剂和缓冲液可以连续流动或固定就位一定时间，以便发生聚合反应和进行磷酸酯酶水解，在图4中展示了所述方法的图解说明.
在一个实施方案中，本发明提供定量核酸的方法，包括以下步骤：(a)进行核酸聚合酶反应，该聚合酶反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸的反应，其中反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的副产品物种，其数量基本上与被定量的核酸的数量成比例；(c)测量可测定的物种；和(d)使用公知的标准比较测定值，以确定核酸的数量.在定量核酸方法的该实施方案中，被定量的核酸可以是RNA.核酸也可以是天然或合成的寡核苷酸、染色体DNA或DNA。
本发明还提供定量DNA序列的方法，包括以下步骤：(a)在末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应，其中反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的副产品物种，其数量基本上与被定量的DNA序列的数量成比例；(c)测量可测定的物种；和(d)使用公知标准比较测量值以便确定DNA的数量。在该实施方案中，被定量的DNA序列可以包括天然的或合成的寡核苷酸，或从细胞中分离的DNA，包括染色体DNA。
在一个上述定量核酸序列的方法中，聚合酶反应步骤进一步包括在磷酸酯酶存在下进行聚合酶反应，如以上说明书中所述，这将允许核酸聚合酶活性的实时监测，因此允许对靶核酸序列进行实时测定以便定量。
本文提供的用于定量核酸序列方法的末端-磷酸根-标记的核苷酸可以用下式表示：
本文提供的定量核酸序列方法的上式的最优选的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯是含有酶可活化的标记的那些末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯.通过磷酸酯酶的活性酶-可活化的标记变得可测定，所述磷酸酯酶改变了在标记和天然或修饰的核苷酸的末端-磷酸根之间的磷酸酯键，以这种方式产生可测定的物种。可测定的物种是可以通过存在的颜色、荧光发射、化学发光、质量差别或电化学潜能中的任何一个或其组合而被测定的.如上所述酶可活化的标记可以是1，2-二氧杂环丁烷化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记或电化学标记或其组合。合适的标记是与上述那些相同的.
如在实施例部分中将进一步详细描述的，本发明提供测定靶核酸序列中的单个核苷酸的身份的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在至少一种末端磷酸根标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应，反应结果产生标记的多磷酸酯；(b)使标记的多磷酸酯与磷酸酯酶反应产生标记的物种；(c)测定标记的物种的存在；和(d)鉴定被掺入的核苷。在所述实施方案中末端磷酸根-标记的核苷酸在多磷酸酯链中包括四个或更多个磷酸根.
本发明的另一方面涉及核酸测定试剂盒，包括：
a)至少一种或几种下式的末端-磷酸根-标记的核苷酸：
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是2或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，当磷酸酯被除去以后它变为可独立地测定的，
其中L是酶-活化的标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基；
b)至少一种DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶；
c)磷酸酯酶.
本发明的另一方面涉及核酸测定试剂盒，包括：
a)至少一种下式的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯：
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是3更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，
其中L是标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、膦酸酯、硫酯、或氨基磷酸酯键的羟基、卤烷基、巯基或氨基。
b)至少一种选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶组成的组中的酶。
在上述试剂盒中末端-磷酸根-标记的核苷酸中的糖的部分包括，但是不限于核糖基、2＇-脱氧核糖基、3＇-脱氧核糖基、2＇，3＇-二脱氧核糖基、2＇，3＇-二脱氢二脱氧核糖基、2＇-或3＇-烷氧基核糖基、2＇-或3＇-氨基核糖基、2＇-或3＇-氟核糖基、2＇-或3＇-巯基核糖基、2＇-或3＇-烷硫基核糖基、非环、碳环和其它修饰的糖.
碱基可以是，但是不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤或其类似物.
而且如上所述，酶-可活化的标记可以是1，2-二氧杂环丁烷化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记、电化学标记或其组合。在核苷酸的末端-磷酸根位置轭合的合适的化合物和上述的那些相同.
实施例
以下实施例仅仅用于说明的目的，不以任何方式限制其后的权利要求。
实施例1
制备γ-(4-三氟甲基香豆素基)ddGTP(γCF3香豆素-ddGTP)
将ddGTP(200μl，46.4mM溶液，纯度>96％)和无水二甲基甲酰胺(DMF，2 x 0.5ml)共同蒸发，往其中加入二环己基碳化二亚胺(DCC，9.6mg，5当量)，再将混合物与无水DMF(0.5ml)共同蒸发，然后在无水DMF(0.5ml)中浸取残留物，将混合物搅拌过夜。还剩余约20％未环化的三磷酸酯(可能是来自环状三甲基磷酸酯在柱上的水解)。向混合物中加入另外2当量DCC，搅拌2h以后，加入7-羟基-4-三氟甲基香豆素(4-三氟甲基伞形酮，42.7mg，20当量)和三乙胺(26μl，20当量)，将混合物在室温下搅拌，2天以后，HPLC(在0.1M三乙基铵乙酸盐(TEAA)中的0-30％乙腈/15分钟，30-50％乙腈/5分钟和50-100％乙腈/10分钟，C18 3.9 x 150mm柱，流速1ml/分钟)显示在9.7分钟有新的产品和起始的环状三磷酸酯(在254nm下比例为77：5)。再搅拌混合物1天，P-31 NMR显示γ-标记的核苷-三磷酸酯作为反应混合物的主要成分。
将反应混合物用旋转蒸发器浓缩，用水(5 x 1ml)萃取残留物，HPLC显示纯度在254nm处为82％和在335nm处为81％。用旋转蒸发器浓缩混合的水溶液，并且溶解在水(1ml)中，在1英寸 x 300cm C18柱上，使用在0.1M三乙基铵碳酸氢盐中的0-30％乙腈(TEAB，pH 8.3)/30min和30-50％乙腈/10min，15ml/min流速提纯，将产品峰收集在3个馏分中，除了通过鼓入CO2将TEAB缓冲液的pH降低到6.7以外，使用如上述相同的制备性的HPLC方法再提纯馏分1.将产品峰浓缩，使用MeOH(2倍)和水(1倍)共同蒸发.将样品溶解在1ml水中，HPLC显示在254处和在335nm处纯度>99％.UV显示浓度为2.2mM，假设消光系数在322nm处是11,000(对于报道的7-羟基-4-三氟甲基香豆素的β半乳糖苷衍生物，分子探针目录)，MS:M-＝702.18(计算值702.31)，UV λA＝253，276和322nm。连接到ddGTP的γ-磷酸根上的三氟香豆素染料322nm的最大激发，约415nm的最大发射发荧光，由于磷酸酯水解释放香豆素染料，光谱发生变化，最大激发约为385nm和最大发射约为502nm，这种变化很容易通过简单的荧光测定值或颜色变化来测定.γ核苷酸的合成被Arzumanov一般性地描述(A.et al.in J BiolChem(1996)Oct 4；271(40)：24389-94).
γ-(4-三氟甲基香豆素基)二脱氧鸟苷-5＇-三磷酸酯
(γCF3香豆素-ddGTP)
实施例2
制备γ-(3-氰基香豆素基)ddATP(γ-CN香豆素-ddATP)
将ddATP(100gl，89mM溶液，>96％)和无水DMF(2 x 1ml)共同蒸发，往其中加入DCC(9.2mg，5当量)，搅拌混合物，再和无水DMF(1ml)共同蒸发，用无水DMF(0.5ml)浸取残留物，于室温搅拌反应过夜以后，加入7-羟基-3-氰基香豆素(33.3mg，20当量)和TEA(25μl，20当量)。将混合物于室温搅拌1天以后在8.1分钟观察到主要产品(55％，在254nm处)和在10分钟(-10％)观察到另一次要产品，一天以后没有观察到大的变化.
用旋转蒸发器浓缩反应混合物，用3 x 2ml水萃取残留物并且过滤，浓缩水溶液，在C-18上提纯，使用0.1M TEAB中的0-30％乙腈(pH6.7)/30min，30-50％乙腈/10min，流速15ml/min.将主峰收集在3个馏分中，主峰的HPLC(馏分2)显示纯度在254nm处为95.6％，在335nm处为98.1％.用旋转蒸发器(室温)浓缩，与MeOH(2x)及水(1x)共同蒸发，将残留物溶解在0.5ml水中，把5μl样品稀释到1ml进行UV分析，346nm＝0.784，假设消光系数为20,000(对于报道的7-乙氧基-3-氰基香豆素，分子探针目录)，浓度＝7.84mM，产量＝3.92μmol，44％.在C-18柱上再提纯样品，使用与上述同样的方法.将样品峰收集在3个馏分中，将纯度>98％(254nm)和纯度>99.5％(340nm)的馏分2和3被混合，浓缩以后将残留物与MeOH(2x)及水(1x)共同蒸发。将样品溶解在水(1ml)中得到2.77mM的溶液.MS:M-＝642.98au(计算值643.00au)，UV λA＝263和346nm，连接到ddATP的γ-磷酸根上的氰基香豆素染料以346nm的最大激发和约411nm为最大发射发荧光.由于磷酸酯水解释放香豆素染料，光谱发生变化，最大激发约为408nm和最大发射约为450nm，这种变化很容易通过简单的样品的荧光测定值和颜色的变化来测定.γ-核苷酸的合成被Arzumanov，A等人一般性地描述(JBiol Chem.(1996)Oct4；271(40)：24389-94)。
γ-(3-氰基香豆素基)二脱氧腺苷-5＇-三磷酸酯
(γ-CN香豆素-ddATP)
实施例3
制备δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧胸苷-5＇-四磷酸酯(ddT4P-DDAO)
将ddTTP(100μl，80mM溶液)和无水二甲基甲酰胺(DMF，2 x 1ml)共同蒸发，往其中加入二环己基碳化二亚胺(8.3mg，5当量)，再将混合物和无水DMF(1ml)共同蒸发，用无水DMF(1ml)浸取残留物，将反应于室温下搅拌过夜，HPLC显示出大部分环化的三磷酸酯(-82％).浓缩反应混合物，用无水乙醚洗涤残留物3次，再溶解于无水DMF中，用旋转蒸发器浓缩致干，用DDAO-单磷酸酯、铵盐(5mg，1.5当量)(200μl，无水DMF中)浸取残留物，于40℃搅拌一周，HPLC显示形成了新的产品，其理想的UV特征是11.96分钟.(HPLC方法：在0.1M三乙基铵乙酸盐中的0.30％乙腈(pH7)/15min，30-50％乙腈/5min，Novapak C-18 3.9 x 150mm柱，1ml/min).LCMS(ES-)也显示主峰834(M-1峰).浓缩反应混合物，在Delt apakC18，19 x 300mm柱上提纯，使用0.1M TEAB(pH6.7)和乙腈。用HPLC再提纯产品的馏分，使用上述相同的方法.浓缩纯的产品馏分，与MeOH(2x)及水(1x)共同蒸发，将残留物溶解在水(1.2ml)中，得到1.23mM的溶液.HPCL纯度>97.5％(在254nm处)，>96％(在455nm处)；UV λA＝267nm和455nm；MS:M-1＝834.04(计算值8.33.95)。
以类似的方式合成和提供了δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧胞苷-5＇四磷酸酯(ddC4P-DDAO)、δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮二脱氧腺苷-5＇-四磷酸酯(ddA4P-DDAO)和δ-9H(1，3-二氯-9，9二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧鸟苷-5＇-四磷酸酯(ddG4P-DDAO).分析这些提纯的化合物得到以下数据：ddC4P-DDAO:UV λA＝268nm和454nm；MS：M-1＝819.32(计算值818.96)；ddA4P-DDAO：UV λA＝263nm和457nm；MS：M-1＝843.30(计算值842.97)；ddG4P-DDAO：UV λA＝257nm和457nm；MS：M-1＝859.40(计算值858.97)。
实施例4
制备ε-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧胸苷-5＇-五磷酸酯DDAO-ddT-五磷酸酯(ddT5P-DDAO)
A.制备DDAO焦磷酸酯
将DDAO-磷酸酯二铵盐(11.8μmol)和无水DMF(3 x 0.25ml)共同蒸发，溶解在DMF(0.5ml)中，往其中加入羰基二咪唑(CDI，9.6mg，5当量)，将混合物于室温下搅拌过夜，通过加入MeOH(5μl)除去过量的CDI，搅拌30分钟，往该混合物中加入三丁基铵磷酸二氢盐(10当量，236ml(0.5M溶液，DMF中)，于室温下搅拌混合物4天，用旋转蒸发器浓缩反应混合物，在HiPrep16.10Q XL柱上提纯残留物，使用0-100％B，使用0.1MTEAB/乙腈(3:1)作为缓冲液A和1MTEAB/乙腈(3:1)作为缓冲液B.收集主峰(HPLC纯度98％)，浓缩并且与甲醇(2x)共同蒸发，将残留物溶解在1ml水中得到5.9mM的溶液，UV/VISλmax＝456nm.
B.制备ddT5P-DDAO
将ddTTP(100μl的47.5mM溶液，水中)和无水DMF(2 x 1ml)共同蒸发，往其中加入DCC(5当量，4.9mg)，将混合物和DMF(1 x 1ml)共同蒸发，使用无水DMF(0.5ml)浸取残留物，于室温下搅拌3小时，往其中加入1.03当量DDAO焦磷酸酯(DMF溶液)，和无水DMF(2 x 1ml)共同蒸发，将混合物浓缩致干，使用200μl无水DMF浸取，将混合物于38℃加热2天，浓缩反应混合物，用水稀释，过虑并且在HiTrap 5ml离子交换柱上提纯，使用0-100％A-B，使用2步骤梯度，溶剂A＝0.1MTEAB/乙腈(3：1)，溶剂B＝1M TEAB/乙腈(3：1)，合并馏分12 x 13(含有大量产品)，浓缩并且和甲醇(2x)共同蒸发，在Xterra RP C-1830-100mm柱上提纯残留物，使用0.30％乙腈(0.1M TEAB中，5柱中，和30-50％乙腈(2柱体积)，流速10ml/min，浓缩含有纯产品的馏分，并且和甲醇(2x)及水(1x)共同蒸发，HPLC纯度(在455nm处)>99％，UV/VIS＝268nm和455nm.MS：M-1＝914.03(计算值913.93)。
连接到这些多磷酸酯的γ-磷酸根上的DDAO染料以455nm的最大激发和约608nm的最大发射发荧光，由于磷酸酯水解释放游离的染料，光谱发生变化，最大激发约为645nm和最大发射约为659nm，这种变化很容易通过测定简单的荧光测定值和颜色变化而测定。
应该注意带有染料或连接于末端磷酸根的其他可测定部分的类似的核苷酸化合物也能够使用类似上述实施例1-4所述的方法制备.它们包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷-四磷酸酯、带有任何天然碱基的核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤和尿嘧啶)以及修饰的碱基或修饰的糖。
实施例5
制备δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧胸苷-5＇-四磷酸酯(dT4P-DDAO)
将10微摩尔TTP TEA盐蒸发至干，往该残留物中加入40微摩尔三丁基胺和5ml干燥的吡啶，再将溶液蒸发至干，和3ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF)共蒸发两次以后，将残留物再溶解于200μl干燥的DMF中，使用氩气冲洗和停止反应，将50微摩尔(8mg)羰基二咪唑(CDI)溶解在100μl干燥的DMF中，使用针筒加入.在环境温度下搅拌反应烧瓶4小时。进行上述反应时，将35mg(83微摩尔)DDAO磷酸酯和166微摩尔三丁基胺溶解在DMF中，将DDAO磷酸酯蒸发至干，然后和干燥的DMF一起进行3次共蒸发.将残留物溶解在300μl干燥的DMF中。
反应4小时以后，将3.2μl无水甲醇加入到TTP-CDI反应物中，搅拌反应30分钟，往该混合物中加入DDAO磷酸酯溶液，将混合物于环境温度下搅拌18小时，使用反相HPLC(Xterra 4.6 x 100柱，0.1MTEAA/乙腈)核查反应，通过蒸发将反应体积减少到200μl，允许反应进行80小时.
80小时以后，通过加入15ml0.1M TEAB停止反应，将稀释的混合物加到19 x 100 Xterra RP柱中，使用0.1M TEAB中的乙腈进行梯度洗脱，将含有纯DDAO T4P的馏分蒸发至干，和乙醇一起共蒸发两次.使用MilliQ水重建残留物.产量：1.10微摩尔，11％；HPLC纯度>98％(455nm)；MS：M-1＝850.07(计算值849.95).
除了使用3.5当量的DDAO磷酸酯代替8.3当量以外按照与上述类似的方法制备了δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧鸟苷-5＇-四磷酸酯(dG4P-DDAO)、δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧胞苷-5＇-四磷酸酯(dC4P-DDAO)和δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧胸苷-5＇-四磷酸酯(dA4P-DDAO).使用C18提纯以后，使用Mono Q 10/10柱离子交换提纯样品.
δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧鸟苷-5＇四磷酸酯(dG4P-DDAO)：产量0.57μmol，5.7％；HPLC纯度99％(455nm)；MS：M-1＝875.03(计算值874.96)。
δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧胞苷-5＇四磷酸酯(dC4P-DDAO)：产量0.24微摩尔，2.4％；HPLC纯度99％(455nm)；MS：M-1＝835.03(计算值834.95).
δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-脱氧腺苷-5＇-四磷酸酯；产量0.38微摩尔，3.8％；HPLC纯度99％(455nm)；MS：M-1＝859.07(计算值858.97)。
以下的实施例6、7和8说明，在用于测定核酸序列的模板-定向方法中通过核酸聚合酶将连接于末端磷酸根的带有染料衍生物的核苷酸可以作为底物有效地掺入到增长的核酸链中。
实施例6
利用聚合酶掺入γ磷酸根-标记的ddGTP来测定核酸序列
使用实施例(1)的二脱氧核苷酸，在室温下装配(23℃)反应。反应物含有引物模板的组合，该组合具有退火到两个不同的寡核苷酸模板之一上的单一的寡核苷酸引物(以SEQ ID NO：1表示)，这两个模板在邻近引物的3＇-端处含有作为下一个模板核苷酸的dC或dT，分别对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
引物：
5＇-GTT CTC GGC ATC ACC ATC CG-3＇(SEQ ID NO：1)
参考图1对于本实施例中的模板1(SEQ ID NO：2)，期望DNA聚合酶利用标记的ddGTP来延长引物.同样对于图1中的模板2(SEQ IDNO：3)，期望DNA聚合酶利用ddATP来延长引物，但是不使用标记的ddGTP.
模板#1：
5＇-CAC CCT TAT CTG GTT GTC CAC GGA TGG TGA TGC CGA GAA C-3＇(SEQID NO：2)
模板#2：
5＇-CAC CCT TAT CTG GTT GTC TAC GGA TGG TGA TGC CGA GAA C-3＇(SEQID NO：3)
反应条件：将含有25mMTris，pH8.0、5％甘油、5mM MgCl2、0.5mMβ-乙硫醇、0.01％吐温-20、0.25单位的河虾碱性磷酸酯酶、100nM退火到模板(下一个模板核苷酸是dCMP或dTMP)上的引物和2μM ddGTP-CF3-香豆素的70μl反应物被装配在以时间驱动模式操作的LS-55荧光光度计(Perkin Elmer)的石英荧光超-微容器中。
激发和发射波长分别是390nm和500nm，激发狭缝的宽度是5nm，发射狭缝的宽度是15nm，通过加入基因工程化的，以便消除3＇-5＇外切核酸酶活性和5＇-3＇外切核酸酶活性，并且辨别二脱氧核苷酸的0.35μl(11单位)克隆的DNA聚合酶I和0.25mMMnCl2来启动反应。
如图1所示，反应物含有γ标记的ddGTP，仅仅对于引物：模板1测定到了染料发射，其中在模板中的下一个核苷酸是dC。通过河虾碱性磷酸酯酶断裂磷酰基转移的焦磷酸酯产品导致CF3-香豆素标记的可测定的变化，这样就允许测定核酸.对于引物：模板2，设有得到可测定的染料发射。
实施例7
利用聚合酶掺入γ磷酸酯-标记的ddATP来测定核酸序列
使用实施例的(2)二脱氧核苷酸，在室温下装配(23℃)反应，反应物含有具有单一寡核苷酸引物(SEQ ID NO：1)的引物：模板组合，该单一寡核苷酸引物被退火到含有临近引物的3＇末端的作为模板核苷酸的dC或dT的两个不同寡核苷酸模板之一上，这两个模板分别对应于SEQID NO：2和SEQ ID NO：3.
参考图2对于本实施例中的模板2(SEQ ID NO：3)，期望DNA聚合酶利用标记的ddATP来延长引物。同样对于图2中的模板1(SEQ IDNO：2)，期望DNA聚合酶使用ddG TP来延长引物，但是不使用标记的ddATP。
反应条件：将含有25mM Tris，pH8.0、5％甘油5mM MgCl2、0.5mMβ-乙硫醇、0.01％吐温-20、0.25单位河虾碱性磷酸酯酶、100nM退火为模板的引物和2μM ddATP-CN-香豆素的70μl反应物装配在以时间驱动模式操作的LS-55发光光度计(Perkin Elmer)的石英荧光超-微容器中.
激发和发射波长分别是410nm和450nm，激发狭缝的宽度是5nm，发射狭缝宽度是15nm，通过加入0.35μl(11单位)基因工程化的，以便消除3＇-5＇外切核酸酶活性和5＇-3＇外切核酸酶活性，并且辨别二脱氧核苷酸的克隆的DNA聚合酶I和0.25mM MnCl2来启动反应。
如图2所示，对于含有γ标记的dd A TP的反应，仅仅对于引物：模板2测得染料发射，其中在模板中的下一个核苷酸是dT。通过河虾碱性磷酸酯酶断裂磷酰基转移的焦磷酸酯产品导致CN-香豆素标记的可测定的变化，这样就可以测定核酸。对于引物：模板1，没有得到可测定的染料发射.
实施例8
在固体载体上对合成的靶进行测序
A.引物-靶复合物的固定化：
将动态珠(dynabeads)(M-270链霉抗生物素蛋白涂覆的磁性珠，200μl，10mg/ml)悬浮液放在离心管中(eppendorf)，并且放在磁性支架上。使用移液管除去上清液，从磁性支架上移出离心管。将珠粒再悬浮于含有0.01％吐温-20(450μl)的1xPBS中，将管子再放在支架上。除去上清液以后，使用IxPBS(450μl)重复该过程。将珠粒再悬浮于IxPBS-吐温缓冲液(190μl)和标记的寡核苷酸中(以下显示的序列，例如SEQ ID NO：4的生物素酰基化的模板-引物，在5＇-端用荧光素标记的，10μl 50μM的水溶液).将混合物在加热部件上于37℃保温30分钟，同时震荡，移去上清液，用1xPBS-吐温(1ml)和1xPBS(1ml)洗涤珠粒，将珠粒悬浮于1ml PBS中，并且放在冰箱中.为了进行寡载荷分析，将100μl的珠粒悬浮液放在离心管中，并且放在磁性支架上，移去上清液以后加入浓氢氧化铵(100μl)，封闭管子，于65℃在加热部件上保温悬浮液10分钟，同时震荡释放寡核苷酸。再将管子放在磁性支架上并且移去悬浮液，使用1xPBS调整到100μl，并且放在微量滴定盘中.在孔中放置每100μl 1xPBS缓冲液中含有25.000μmol、12.500μmol、6.250μmol、3.125μmol和1.562μmol的标记的寡核苷酸的标准，在TECAN超级扫描仪上扫描微量滴定盘的荧光发射.通过将数据拟合为一条直线来测定载荷，发现每100μl最终的珠粒悬浮液，载荷是13.94pmol，对应于20μl原始的珠粒悬浮液.
SEQ ID NO：4
B.序列测定：
制备了以下缓冲液和核苷酸溶液：5ml的25mM Hepes(pH8.2)、5mMMgCl2、0.5mM MnCl2、0.01％吐温、0.125u/μl TSI聚合酶和0.0026u/μl河虾碱性磷酸酯酶(SAP)。将25μl每一种dN4P-(4-Me-香豆素)(N＝G、T或C)的100μM溶液单独地与475μl上述缓冲液混合。将50μl的dA4P-(4-Me-香豆素)100μM溶液与950μl的上述缓冲液混合。
将预先负载了寡核苷酸的磁性珠粒(含有1.39pmol寡核苷酸的10μl负载的珠粒悬浮液)用磁性分离器使用上述缓冲液洗涤(2 x 50μl)，往珠粒上加入50μl单一核苷酸溶液，按照下列顺序加入：GCTA-GATC-GCTA-GCAT-GTA-AG-GA-A-C-G。因此，在第一循环中加入dG4P-(4-Me-香豆素)，在第二循环中加入dC4P-(4-甲基-香豆素)等。加入每种核苷酸以后，以1400的震荡速度，于37℃温育珠粒5分钟，用分离器分离，将上清液放在标记的孔中.在加入下一个核苷酸以前，将珠粒用水(2 x 50μl)和上述缓冲液(1 x 50μl)洗涤，将每个洗液分别放在各标记的孔中以便读数。在各孔中放入50μl每种上述核苷酸溶液，以便测定本底的荧光发射.在另一组孔中，将核苷酸溶液用蛇毒磷酸二酯酶处理(已知它能够断裂核苷酸而产生染料磷酸酯)，并且用稀释10倍的含有磷酸酯酶的上述缓冲液作为标准来测定总的可能信号。每种核苷酸加入产生的信号与总的可能信号的比例能够用于定量的目的.于不同的间隔对微量盘读数，并且在试验结束时在TECAN超级扫描仪上读数，在360nm处激发样品并且在465nm处读数.在加入每个核苷酸混合物以后，(来自悬浮液和洗涤液)通过减去存在于核苷酸溶液中的本底来校正粗略荧光数值.用根据模板的序列预期将要被掺入的碱基数乘以在前一次掺入事件掺入的每个核苷酸的荧光计数来计算每次加入预期的数值。
利用本发明的上述教导，本领于的技术人员能够对本发明进行许多改进，这些改进被包括在正如所附的权利要求书中提出的本发明的范围之内.
序列表
<110>SOOD，Anup
KUMAR，Shiv
NELSON，John
FULLER，Carl
<120>固相测序
<130>PB0313
<140>将要被转让
<141>2004-02-05
<150>US 60/445,193
<151>2003-02-05
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>1
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>2
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>3
<210>4
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>4
Claims (62)
1.对核酸模板的靶区域进行测序的方法，包括:
a)通过形成反应混合物在固体载体上进行核酸聚合反应，所述的反应混合物包括核酸模板、引物、核酸聚合酶和选自带有天然碱基或碱基类似物的核苷的一个末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯；
其中所述反应混合物的一种组分或两种或多种所述组分的复合物被固定在所述的固体载体上，所述组分选自由所述的核酸模板、所述的引物和所述的核酸聚合酶组成的组，以及
假如所述末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯含有在聚合位点处与模板碱基互补的碱基，则所述的反应结果产生标记的多磷酸酯；
b)将所述的反应混合物用磷酸酯酶处理，其中假如所述标记的多磷酸酯在步骤a)中产生，则产生可测定的物种；
c)测定所述的可测定物种；
d)通过将选自其余天然碱基或碱基类似物的不同的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯加入所述的反应混合物，来继续所述的聚合反应，并且重复步骤b)和c)；和
e)从加入的导致所述可测定物种产生的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的身份和顺序鉴定所述的靶区域序列。
2.权利要求1的方法，其中在所述的进行步骤中将所述的核酸模板固定在所述的固体载体上.
3.权利要求1的方法，其中在所述的进行步骤中将所述的引物固定在所述固体载体上.
4.权利要求1的方法，其中首先将所述核酸模板和所述引物杂交，然后在所述的进行步骤中将它们固定在所述的固体载体上.
5.权利要求1的方法，其中在所述的进行步骤中将所述的核酸聚合酶固定在所述的固体载体上.
6.权利要求1的方法，其中所述的步骤在流通或停止-流动系统中以连续方式进行。
7.权利要求1的方法，进一步包括定量所述核酸序列的步骤。
8.权利要求1的方法，进一步包括:通过将所述的可测定物种产生的光谱与已知标准产生的光谱比较而定量所述的核酸序列。
9.权利要求1的方法，其中所述的核酸聚合酶是一种聚合酶。
10.权利要求1的方法，其中所述核酸模板是一种RNA模板。
11.权利要求1的方法，其中所述核酸模板是一种DNA模板。
12.权利要求1的方法，其中所述核酸模板是天然或合成的寡核苷酸。
13.权利要求1的方法，其中所述的进行步骤和所述的随后的步骤同时进行。
14.权利要求1的方法，其中所述末端磷酸根-标记的核苷多磷酸酯在多磷酸酯链上包含四个或多个磷酸酯基团.
15.权利要求1的方法，其中所述的可测定物种以基本上与核酸序列的数量成比例的数量被产生.
16.权利要求1的方法，其中所述的磷酸酯酶是酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶或另一种磷酸酯转移酶.
17.权利要求1的方法，进一步包括在所述的聚合反应中包含一种或多种另外的测定试剂.
18.权利要求17的方法，其中所述一种或多种另外的测定试剂是各自独立地是能够应答的，彼此不同，并且与所述的可测定的物种不同.
19.权利要求17的方法，其中所述一种或多种另外的测定试剂中的一种或几种是抗体.
20.权利要求1的方法，其中所述的可测定物种是可以通过由选自颜色、荧光发射、化学发光、质量变化、还原/氧化电位及其它们的组合组成的组的性质测定的。
21.权利要求1的方法，其中所述的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯由下式表示:
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是2或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，当磷酸根被除去时它变为可独立地测定，
其中L是酶-可活化的标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根处含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基。
22.权利要求21的方法，其中所述酶-可活化的标记选自由化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记、电化学标记及其组合组成的组。
23.权利要求22的方法，其中所述的荧光染料选自由2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮、荧光素二磷酸酯、荧光素3′(6′)-O-烷基-6′(3′)-磷酸酯、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯、4-甲基伞形酰基磷酸酯、荧光素磷酸酯、4-三氟甲基伞形酰基磷酸酯、伞形酰基磷酸酯、3-氰基伞形酰基磷酸酯、9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯、6，8-二氟-4-甲基伞形酰基磷酸酯及其结合组成的组.
24.权利要求22的方法，其中所述的生色染料选自由5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、3-吲哚氧基磷酸酯、对-硝基苯基磷酸酯及其组合组成的组.
25.权利要求22的方法，其中所述的化学发光化合物是磷酸酯酶-活化的1，2-二氧杂丁烷化合物.
26.权利要求25的方法，其中所述1，2-二氧杂丁烷化合物选自由2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧杂丁烷-3，2′-(5-氯-)三环[3，3，1-137]癸-1-基)-1-苯基磷酸酯、氯金刚烷-2′-亚基甲氧基苯氧基磷酰基化的二氧杂丁烷，3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3＂-磷酰基氧基)苯基-1，2-二氧杂丁烷及其组合组成的组.
27.权利要求21的方法，其中所述的糖部分选自由核糖基、2′-脱氧核糖基、3′-脱氧核糖基、2′，3′-二脱氧核糖基、2′，3′-二脱氢二脱氧核糖基、2′-烷氧基核糖基、2′-叠氮基核糖基、2′-氨基核糖基、2′-氟核糖基、2′-巯基核糖基、2′-烷硫基核糖基、碳环、非环及其组合组成的组。
28.权利要求21的方法，其中所述的糖部分选自核糖基或2′-脱氧核糖基糖。
29.权利要求21的方法，其中所述含氮杂环碱基选自由尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和其类似物及其组合组成的组.
30.权利要求1的方法，其中所述核酸模板的靶区域具有已知的序列并且其中加入末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的顺序基于靶区域的序列.
31.权利要求1的方法，其中所述核酸模板的靶区域具有未知的序列并且其中加入末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的顺序出现在预先装置的循环中，重复所述预先装置的循环，并且不考虑掺入到给定循环中的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的身份.
32.对核酸模板的靶区域进行测序的方法，包括:
a)通过形成反应混合物在固体载体上进行核酸聚合反应，所述的反应混合物包括核酸模板、引物、核酸聚合酶和带有四个或多个磷酸根的一种末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯，选自带有天然碱基或碱基类似物的核苷；
其中所述反应混合物的一种组分或两种或多种所述组分的复合物被固定在所述的固体载体上，并且所述的组分选自由所述的核酸模板、所述引物和所述核酸聚合酶组成的组，以及
假如所述末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯含有在聚合位点处与模板碱基互补的碱基，则所述的反应结果产生标记的多磷酸酯；
b)测定所述标记的多磷酸酯；
c)通过将不同的、选自其余的天然碱基或碱基类似物的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯加入到所述混合物中而继续所述的聚合反应并且重复步骤b)；
d)从加入的导致所述标记的多磷酸酯产生的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的身份和加入顺序来确定所述的靶区域序列.
33.权利要求32的方法，其中在所述的进行核酸聚合反应的步骤中将所述核酸模板固定在所述的固体载体上。
34.权利要求32的方法，其中在所述的进行核酸聚合反应步骤中将所述引物固定在所述的固体载体上.
35.权利要求32的方法，其中首先将所述核酸模板和所述引物杂交，然后在所述进行核酸聚合反应步骤中固定在所述固体载体上。
36.权利要求32的方法，其中在所述进行核酸聚合反应步骤中将所述核酸聚合酶固定在所述固体载体上.
37.权利要求32的方法，其中所述步骤在流通或停止-流动系统中以连续方式进行。
38.权利要求32的方法，进一步包括定量所述核酸序列的步骤。
39.权利要求32的方法，进一步包括:通过比较由所述可测定物种得到的光谱和由已知标准得到的光谱来定量所述的核酸序列.
40.权利要求32的方法，其中所述的核酸聚合酶是一种聚合酶.
41.权利要求32的方法，其中所述核酸模板是一种RNA模板.
42.权利要求32的方法，其中所述核酸模板是一种DNA模板.
43.权利要求32的方法，其中所述核酸模板是天然或合成的寡核苷酸.
44.权利要求32的方法，进一步包括在所述聚合反应中包括一种或多种另外的测定试剂.
45.权利要求44的方法，其中所述的一种或多种另外的测定试剂各自是独立地能够应答的，彼此不同，并且与所述的标记的多磷磷酯不同.
46.权利要求44的方法，其中所述一种或多种另外的测定试剂中的一种或几种是抗体。
47.权利要求32的方法，其中所述标记的多磷酸酯是可以通过选自由颜色、荧光发射、质量变化、还原/氧化电位及其它们的组合组成的组的性质测定的.
48.权利要求32的方法，其中所述末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯以下式表示:
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是3或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，
其中L是标记，它或在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、卤烷基、巯基氨基。
49.权利要求48的方法，其中所述的标记选自由荧光染料、生色染料、质量标记、电化学标记及其组合组成的组.
50.权利要求49的方法，其中所述荧光染料选自由呫吨染料、花青染料、merro花青染料、偶氮染料、卟啉染料、香豆素染料及其bodipydyeand衍生物组成的组.
51.权利要求49的方法，其中所述的生色染料选自由偶氮染料、merro花青、花青染料、呫吨染料、卟啉染料、香豆素染料、a bodipy染料及其衍生物组成的组.
52.权利要求48的方法，其中所述糖部分选自由核糖基、2′-脱氧核糖基、3′-脱氧核糖基、2′，3′-二脱氧核糖基、2′，3′-二脱氢二脱氧核糖基、2′-烷氧基核糖基、2′-叠氮核糖基、2′-氨基核糖基、2′-氟核糖基、2′-巯基核糖基、2′-烷硫基核糖基、碳环、非环和其它修饰的糖组成的组.
53.权利要求48的方法，其中所述糖部分选自核糖基或2′-脱氧核糖基糖。
54.权利要求48的方法，其中所述含氮杂环碱基选自由尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤及其类似物组成的组.
55.权利要求32的方法，其中所述核酸模板的靶区域具有已知的序列，并且其中加入的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的顺序基于靶区域的序列.
56.权利要求32的方法，其中所述核酸模板的靶区域具有未知的序列，并且其中加入的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯顺序出现在预先装置的循环中，重复所述预先装置的循环，并且不考虑掺入到给定循环中的末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯的身份.
57.一种核酸测定试剂盒，包括:
a)至少一种如下式的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯:
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是2或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，当磷酸根被除去时它变为可独立地测定的，
其中L是酶可活化的标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基；
b)至少一种选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶组成的组的酶；c)磷酸酯酶.
58.权利要求57的试剂盒，其中所述末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯在多磷酸酯链上包括四个或多个磷酸根基团.
59.权利要求57的试剂盒，其中所述糖部分选自核糖基或2′-脱氧核糖基糖.
60.权利要求57的试剂盒，其中所述含氮杂环碱基选自由尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤及其类似物组成的组.
61.权利要求57的试剂盒，其中所述酶-可活化的标记选自由化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记、电化学标记及其组合组成的组.
62.核酸测定试剂盒，包括:
a)至少一种如下式的末端-磷酸根-标记的核苷多磷酸酯:
其中
P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；
n是2或更大；
Y是氧或硫原子；
B是含氮杂环碱基；
S是非环部分、碳环部分或糖部分；
P-L是磷酰基化的标记，
其中L是标记，它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、卤烷基、巯基或氨基；
b)至少一种选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶组成的组的酶.
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Massachusetts, USA Patentee after: Globegroup life technology consulting America Co.,Ltd. Address before: New Jersey, USA Patentee before: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES Corp. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20140910 |
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| CX01 | Expiry of patent term |