CN101227913A - 自胶凝的藻酸盐体系及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了用于制备藻酸盐凝胶的成套工具和组合物。该成套工具和组合物包含可溶的藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。公开了分配自胶凝的藻酸盐分散体的方法。该方法包括形成不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒在含可溶的藻酸盐溶液中的分散体，分配该分散体形成藻酸盐凝胶基质。该方法可包括将分散体分配到个体的体内。还公开一种厚度大于5mm并具有均匀的藻酸盐基质网状物的藻酸盐凝胶，均匀的藻酸盐凝胶不含以下的一种或多种：硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乳酸盐、EDTA或脂质。本发明还公开了可植入的器件，该器件包含均匀藻酸盐凝胶的涂层。还公开了改善胰岛或其它细胞集合体或组织在分离后以及储存和运输时的存活性的方法。

Description

自胶凝的藻酸盐体系及其用途
发明领域
本发明涉及具有延迟胶凝过程的藻酸盐体系，并涉及制备和使用该体系的组合物、器件和成套工具和方法。
发明背景
本申请要求于2004年10月12日提交的标题为“自胶凝藻酸盐体系及其用途(Self-Gelling Alginate Systems and Uses Thereof)”的美国临时申请No.60/617,852的优先权，该申请的内容参考结合于本文。
藻酸盐是亲水性的海洋生物高分子，具有能在生理相关的温度下形成并固化的热稳定凝胶的独特性能。藻酸盐是一类由1-4配糖连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)残基的非支化的二元共聚物。两种糖醛酸单体的相对量和它们在聚合物链中的顺序排列可依据藻酸盐的来源而变化。藻酸盐是在如Laminaria hyperborea、Macrocystis pyrifera、Lessonia nigrescens和Ascophyllum nodosum的海洋褐藻中的结构聚合物。藻酸盐也可以由诸如绿脓假单胞菌、Azotobacter vinelandii和Pseudomonas fluoresceins等特定细菌所产生(WO04011628 A1)。
藻酸盐凝胶可在二价阳离子与来自G残基的负电荷基团形成离子键时产生，所述G残基来自不同的两种藻酸盐中的每一种，因而使这些两种聚合物交联。在许多藻酸盐聚合物中形成多重交联键而产生为藻酸盐凝胶结构的基质。
藻酸盐凝胶可以是水凝胶，即含有大量水但没有发生溶解的交联的藻酸盐聚合物。生物聚合物凝胶，如藻酸盐水凝胶，是用于组织工程(tissueenginering applications)和其它生物应用的较佳候选物。因为这种性能和能够在生理条件条件下形成凝胶，藻酸盐被广泛使用并对其用于封装目的以及作为生物构建材料进行了研究。将细胞截留在藻酸盐珠中是常用的技术。藻酸盐也显示是作为其它类型生物结构，包括组织工程应用和作为神经再生用的骨架的有用材料。
目前有各种制备藻酸盐水凝胶的方法。最常用的方法是透析/扩散法，该方法中藻酸盐溶液通过来自外部容器的胶凝离子的扩散而胶凝。这种方法是制备藻酸盐凝胶珠时最常用的方法并用于食品应用。制备藻酸盐微珠是一快速过程，受到胶凝离子扩散进入凝胶网状物的限制。虽然这一过程非常适合于将细胞截留在微珠内，但很少用于制备其它形状或结构。对于制备大尺寸的凝胶结构，扩散胶凝体系的可能性有限。这是因为扩散胶凝过程限制了凝胶结构成形的时间。
可以采用延缓胶凝过程，以在凝胶形成之前能够将溶液注入体内和/或将细胞或其它生物材料混入凝胶基质中。因此，已开发的另一种方法是制造其它类型的可生物相容的藻酸盐凝胶结构。通过使用内胶凝体系(internal gellingsystems)可以降低胶凝速度，在这种胶凝体系中，胶凝离子在形成的凝胶内释放更缓慢地释放，这种现象被描述为凝胶的内固化。通常，在内胶凝体系中，溶解度有限的钙盐或配位的Ca2+离子与藻酸盐溶液混合，钙离子缓慢释放到该溶液中。硫酸钙用于组织工程用的藻酸盐基细胞递送赋形剂。钙释放和胶凝动力学也可以通过使用具有依赖pH的溶解度的钙盐以及加入缓慢作用的酸如D-葡萄-β-内酯(GDL)加以控制。当pH变化时，释放出钙离子。含钙脂质体曾用作可控制的藻酸盐胶凝体系。基于内胶凝的藻酸盐凝胶体系的胶凝离子的供给受到更多的限制，这与允许钙离子扩散到藻酸盐溶液得到钙饱和的凝胶的扩散体系相反。
目前制造藻酸盐凝胶结构的方法有许多限制。一些技术只能用于制备具有限定的尺寸和形状的凝胶。根据应用，还存在许多与控制胶凝动力学相关的问题。某些情况下，在凝胶中存在不需要的材料，因为这类材料是化学控制的胶凝机理的残余物和副产物。某些情况下，为了胶凝而要求非生理性pH值，并且这些条件对采用这些方法也存在限制。因此，需要其它的胶凝体系和配方(formulation)。
发明概述
本发明涉及制备藻酸盐凝胶的成套工具。该成套工具包括包含可溶解的藻酸盐的第一容器和包含不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的第二容器。
本发明还涉及用于制备藻酸盐凝胶的组合物。该组合物包含速溶的藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。
本发明还涉及分配自胶凝的藻酸盐分散体的方法。该方法包括在可溶的藻酸盐溶液中形成不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的分散体，并分配该分散体，从而使分散体形成藻酸盐凝胶基质。
本发明还涉及将自胶凝的藻酸盐分散液分配到个体的方法。该方法包括在可溶的藻酸盐溶液中形成不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的分散体，并分配该分散体进入到个体，从而在该个体中形成藻酸盐凝胶基质。
本发明还涉及分配自胶凝的藻酸盐分散体进入到个体的方法，用作组织填充材料(tissue bulking material)、用于形成血管栓塞过程(vascularembolization procedure)、用来防止术后形成粘附、用于创伤处理过程、用于糖尿病治疗和用于治疗关节炎。
本发明还涉及使用可植入的藻酸盐凝胶的方法。该方法包括通过分配自胶凝的藻酸盐分散体来形成自胶凝的藻酸盐，然后形成凝胶，将该可植入的藻酸盐凝胶植入个体。
本发明还涉及制造可植入的器件的方法。
本发明还涉及厚度大于5mm的藻酸盐凝胶以及均质藻酸盐网状物。
本发明还涉及厚度大于5mm且不含以下的一种或多种物质的藻酸盐凝胶：硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乳酸盐、EDTA或脂质。
本发明还涉及包含均质藻酸盐凝胶涂层的可植入的器件。
本发明还涉及填充或修复由骨关节炎造成的软骨缺损的方法，该方法通过将包含软骨细胞的自胶凝藻酸盐分散体分配到个体体内或者将包含软骨细胞的生物相容基质植入个体体内来进行填充或修复。
本发明还涉及治疗糖尿病的方法，该方法通过将包含产生胰岛素的细胞或多细胞集合体的自胶凝藻酸盐分散体分配到个体体内或将包含产生胰岛素的细胞或多细胞集合体的生物相容基质植入个体体内进行治疗。
本发明还涉及改善分离后以及储存和运输期间胰岛或其它细胞集合体或组织的存活性的方法，包括加入该胰岛、或细胞集合体或组织到自胶凝的藻酸盐分散体中。
本发明还涉及超纯不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒及其制备方法。
附图简述
图1包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出储能模量，它被看作时间对具有下列不同藻酸钙(Protaweld TX 120)浓度的凝胶(混合物/凝胶中的浓度)的函数：混有1.0％藻酸钠的1.0％藻酸钙，混有1.0％藻酸钠的1.5％藻酸钙和混合有1.0％藻酸钠的2.0％藻酸钙。所用藻酸钠是Protanal SF 120。
图2包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出储能模量，它被看作时间对以下列浓度混合的等量藻酸钠(ProtanalSF 120)和藻酸钙(Protaweld TX 120)制备的凝胶的函数：0.75％，1％，1.25％或1.5％藻酸钠和藻酸钙。
图3包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对下列含有不同分子量的藻酸钙(框A)和藻酸钠(框B)的凝胶，作为时间函数的储能模量。框A中凝胶含有1％藻酸钠和1.5％藻酸钙，框B中凝胶含有1％藻酸钙和1％藻酸钠。框A中所用藻酸盐如下：藻酸钙：Protaweld TX 120和在60℃降解33天的Protaweld TX 120。两种藻酸钙的粘度(1％溶液，20℃)，按藻酸钠测定分别为270mPas和44mPas。藻酸钠：Protanal SF 120。框B中所用藻酸盐：藻酸钙：Protaweld TX 120。藻酸钠：Protanal SF 120和ProtanalSF/LF。藻酸钠粘度(1％溶液，20℃)分别为95mPas和355mPas。
图4包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对有锶或钙为胶凝离子制成的凝胶，作为时间函数的储能模量。调节凝胶中藻酸钠(Protanal SF 120)和藻酸锶/钙的各自量至0.75％。所用藻酸钙通过以下分散制备，在实验室捏合机中捏合藻酸(FMC方法产品)(65.2g)与碳酸钙(35.32g)1小时，然后干燥和碾碎。所用藻酸锶采用以下分散制备，在实验室捏合机中捏合藻酸(FMC方法产品)(65.2g)与碳酸锶(52.10g)1.5小时，然后干燥和碾碎。
图5包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对具有高含量和低含量古洛糖醛酸的含藻酸钠的凝胶，作为时间函数的储能模量。图5的框A中，所用的藻酸钙(Protaweld TX 120)和藻酸钠量各自调节为凝胶的1.0％。所用的藻酸钠是Protanal SF 120(69％G)和Protanal HF60D(32％G，MW：119000)。图5的框B中，5.5％藻酸锶(实施例14)与1.25％藻酸钠以1∶4的比例混合(最终藻酸盐浓度为2.1％)。所用藻酸钠是PRONOVA UPIOOG(69％G，MW：122000)和PRONOVA UP 100M(46％G，MW：119000)。选择两种藻酸钠批料使它们的MW(和粘度)类似(尽可能接近)。图5的框B中各曲线是三个独立测量(曲线)的平均值，具有对每个点示出的平均值的标准偏差。
图6示出由不同含量钙离子制备的藻酸盐凝胶在生理条件下储存6个月的稳定性和生物可降解性。凝胶盘通过混合高压蒸汽处理的藻酸钙分散体(Protaweld TX 120)和过滤的无菌藻酸钠(PRONOVA UP LVG)至各藻酸盐浓度为1.0％，该分散体在两个陪替氏培养皿中胶凝来制备。胶凝后一个培养皿中的凝胶盘(标为V)用50mM氯化钙洗涤10分钟，然后将两个盘都加入到细胞培养介质(悬浮有10％FBS的DMEM)。凝胶盘在无菌条件下储存于CO2-培养箱中，每周定时更换介质三次。每个培养皿中最大尺寸的凝胶盘的最初尺寸相同。所示图片是6个月后拍摄的。
图7示出使用截留在藻酸盐的自胶凝藻酸盐中的细胞进行试验的数据。图7的框A中，示出C2C12小鼠肌母细胞截留在自胶凝的藻酸盐凝胶中45天的照片。该凝胶按类似于图6制备和储存，但包含上述细胞。该照片是使用荧光显微镜，对用钙黄绿素(Molecular Probes，L-3224)作为细胞存活性标记进行着色后的细胞拍摄的。被照亮的区域和点显示活细胞的存在。活细胞位于凝胶结构物的内部和表面上。图7的框B示出截留在藻酸盐自凝胶中的人软骨细胞。该凝胶由5ml含人软骨细胞的PRONOVA SLG 20和藻酸钙(实施例14)混合的自凝胶制备。  胶凝后3天，用振动切片机将该凝胶切成600μm的切片。将该凝胶切片储存在CO2-培养箱的细胞生长介质中，6个月后拍摄照片。该照片是使用荧光显微镜，用钙黄绿素(Molecular Probes，L-3224)对细胞着色后拍摄，以说明存活性，该照片清楚地显示存在较多的活细胞(被照亮的点)。
图8包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对含有以4∶1比率混合的1.25％藻酸钠(PRONOVA UP 100G)与5.5％藻酸锶(实施例14)的(最终藻酸盐浓度为2.1％)的凝胶，在氯化钠或六偏磷酸钠存在下或没有氯化钠或六偏磷酸钠下，作为时间函数的。每个曲线是三个独立测量(曲线)的平均值，具有对每个点示出的平均值的标准偏差。
图9包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对含有以4∶1比率混合的1.25％藻酸钠(PRONOVA UP 100G)和5.5％藻酸钙(不同粒径)(实施例14)(最终藻酸盐总浓度为2.1％)的凝胶，作为时间函数的储能模量。通过磨碎冷冻干燥的藻酸钙并以所指出的粒径进行过滤制得不同的粒径。每个曲线是三个独立测量的平均值，具有对每个点示出的平均值的标准偏差。
图10包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对含有以9∶1比率混合的1.25％藻酸钠(PRONOVA UP 100G)与10％藻酸钙(不同温度)(实施例14)(最终藻酸盐浓度为2％)的凝胶，作为时间函数的储能模量。
图11包括流变仪测量的数据。振动测量使用Physica MCR300流变仪进行。图中示出对包含不同分子量的藻酸钠的凝胶，作为时间函数的。该凝胶含有1.25％未降解的藻酸钠(PRONOVA UP 100G)(对照)或同样的藻酸盐但发生间歇降解。凝胶还可以由降解的浓度为2.5％藻酸钠构成(上曲线)。在所有情况，藻酸钠以4∶1比率与5.5％藻酸锶(实施例14)混合。每个曲线是三个独立测量(曲线)的平均值，具有对每个点示出的平均值的标准偏差。
优选实施方式的详细说明
提供另一个藻酸盐胶凝体系。该体系可用于许多的生物医学应用以及其它应用。该体系包括藻酸盐和生物相容性高的胶凝离子。该体系可依据特定应用的需要来改变胶凝时间和凝胶强度。该体系提供的胶凝没有与其它体系相关的pH变化并且只需要最少数量的组分。
该体系包含两个组分：一个组分是可溶的藻酸盐；另一个组分是不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。当组分在溶剂存在下混合形成分散体时，由于颗粒的胶凝离子开始对来自颗粒的藻酸盐和溶液中的可溶藻酸盐聚合物进行交联，于是开始形成藻酸盐凝胶。这两种组分可以通过搅拌或使用适当的混合器件进行混合。配料的胶凝动力学取决于以下几个因素：溶液中可溶的藻酸盐的浓度，不溶的藻酸盐颗粒在分散体中的浓度，胶凝离子相对于藻酸盐的含量，存在非胶凝离子或其它碳水化物，温度，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的粒径，细胞含量，多细胞集合体，截留在凝胶内或在胶凝期间存在的组织或其它生物材料，(存在杂质)和所用的藻酸盐类型，以及不溶的藻酸盐颗粒的制造方法和藻酸盐原料的制备后处理。因此，这种藻酸盐体系能广泛适用于各种特定的应用。为了将细胞、多细胞集合体、组织或其它生物材料截留在形成的凝胶内，溶剂、藻酸盐溶液或分散体可以与要被截留的物质进行预混合。
分散体可以以液体/浆料的形式分配在个体内需要藻酸盐凝胶基质的部位。藻酸盐凝胶是在可溶性藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒在溶剂存在下混合时开始形成，并继续胶凝和原位固化。本文中所用术语“自胶凝的”意指当可溶性藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒在溶剂存在下混合时发生的胶凝过程。“自胶凝的藻酸盐”是包含溶剂中的可溶性藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的藻酸盐分散体或凝胶，或者由可溶性藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒在溶剂中形成的藻酸盐分散体或凝胶。
该体系所用的组分在使用前保持几种形式的任何一种。例如，可溶性藻酸盐可以维持为在溶液中或作为粉末。在一些实施方式中。可溶性藻酸盐可维持为速溶的粉末，如冷冻干燥时的粉末。类似地，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒可以维持为分散体或粉末。
在可溶性中使用的藻酸盐聚合物或聚合物的组合可以是与不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒中的聚合物相同或不同的聚合物。
在分散体中为可溶性藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐相对于溶剂的总浓度会影响胶凝时间、孔隙率、稳定性和生物可降解性、凝胶的凝胶强度和弹性，具有特定性质的凝胶可以以特定比使用可溶性藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒与溶剂来制备。通常，藻酸盐浓度越低(对特定比的可溶性藻酸盐与不溶的藻酸盐)，凝胶的可生物可降解性越高。一些实施方式中，可以使用约0.5％，0.75％，1％，1.25％，1.5％，2％，2.5％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％或更多的藻酸盐(可溶性藻酸盐和为不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐)。
可溶性藻酸盐与在分散体中不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐的相对浓度会影响胶凝时间、孔径、凝胶的凝胶强度和弹性，以及稳定性和生物可降解性，具有特定性质的凝胶可以使用特定比率的可溶性藻酸盐与不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒来制备。在一些实施方式中，可溶性藻酸盐的浓度大致等于为不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐的浓度(1∶1)。在一些实施方式中，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐的浓度为可溶性藻酸盐浓度的两倍(2∶1)。在一些实施方式中，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐浓度为可溶性藻酸盐浓度的二分之一(1∶2)。在一些实施方式中，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒形式的藻酸盐的浓度与可溶性藻酸盐浓度为1比0.7(1∶0.7)。通常，存在的胶凝离子越少，凝胶的生物可降解性越高。可以采用降低该体系中不溶的藻酸盐/胶凝离子的浓度的方法来形成较低稳定性和较高生物可降解性的凝胶，因为该凝胶网状物很少被交联离子饱和。自胶凝可以制备低胶凝离子浓度的凝胶，以制备特别适用于可生物降解用途的凝胶。在某些优选的实施方式中，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒与藻酸盐的藻酸盐比率如下：5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4或1∶5。
G单体和M单体在藻酸盐聚合物中的相对含量可影响孔径、稳定性和生物可降解性、凝胶的凝胶强度和弹性。藻酸盐聚合物的M和G的总含量可以有较大变化，且序列结构的相对含量(G-嵌段、M-嵌段和MG交替序列)以及序列沿聚合物链的长度也可以有较大变化。一般而言，所用藻酸盐聚合物中G含量相对于M含量越低，凝胶的生物可降解性越高。较高G含量藻酸盐的凝胶的孔径通常大于较高M含量的藻酸盐的凝胶的孔径，且其凝胶强度也高于M含量高的藻酸盐的凝胶，高M含量的藻酸盐的凝胶的孔径较小且凝胶强度较低。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有大于50％的α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有大于60％的α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有60-80％的α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有65-75％的α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有大于70％的α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有大于50％C-5差向异构体的β-D-甘露糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有大于60％的C-5差向异构体β-D-甘露糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有60-80％的C-5差向异构体β-D-甘露糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有65-75％的C-5差向异构体β-D-甘露糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物含有大于70％的C-5差向异构体β-D-甘露糖醛酸。制备糖醛酸(uronic)嵌段的方法披露于U.S.6,121,441。G-嵌段藻酸盐聚合物和其作为藻酸盐凝胶性质调节剂的用途披露于U.S.No.6,407,226。某些优选的实施方式中，为30％G，35％G，40％G，45％G，50％G，55％G，60％G，65％G，70％G，75％，80％G或85％G。
藻酸盐聚合物的平均分子量会影响胶凝时间、孔径、凝胶的凝胶强度和弹性。藻酸盐聚合物的平均分子量在2-1000kD范围。藻酸盐的分子量可影响凝胶形成和最终的凝胶性质。一般而言，所用藻酸盐的分子量越小，凝胶的生物可降解性越高。在可溶性藻酸盐组分中使用的藻酸盐聚合物或藻酸盐聚合物组合与在不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒中所用的藻酸盐聚合物相同或不同。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的藻酸盐聚合物的平均分子量为5-350kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的藻酸盐聚合物平均分子量为2-100kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的藻酸盐聚合物的平均分子量为50-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的藻酸盐聚合物的平均分子量为100-1000kD。在一些实施方式中，凝胶设计成具有较高的生物可降解性。因此，采用在此提出的这些参数中一个或多个的下限，可以制备具有较少藻酸盐，较少胶凝离子、较低G含量和较低分子量藻酸盐的凝胶，以制备较高生物可降解性的凝胶。
该藻酸盐按1％溶液测定，其20℃的粘度为25-1000mPas，在一些实施方式中，优选为50-1000mPas(1％溶液，20℃)。
在一些实施方式中，优选的制备不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法提供具有化学计量量(100％饱和)胶凝离子的产品。使用这种化学计量的盐提供自胶凝的藻酸盐体系更高的再现性。在一些实施方式中，优选的制备不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法提供具有低于化学计量量(＜100％饱和)胶凝离子的产品。使用这种低于化学计量的盐提供自胶凝的藻酸盐体系生物可降解性。
在一些实施方式中，藻酸盐是超纯藻酸盐。超纯藻酸盐可以市场购得，如从不同海藻来源，如Laminaria Hyperborea。市售的藻酸钙盐通常以下列方法制备：将组分简单混合和捏合在一起，将钙加入固相的藻酸中。可市场购得的藻酸钙盐的例子有Protaweld(来自FMC BioPolymer)和Kelset(来自ISPCorporation)。不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒可以使用超纯藻酸盐制备，即，使用该超纯藻酸和胶凝离子制备藻酸盐凝胶，洗涤除去钠或存在于超纯藻酸中的其它离子，干燥凝胶以除去水，并用干凝胶制成颗粒。在一些实施方式中，不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒是化学计量的盐。不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒优选具有高纯度凝胶离子，胶凝离子具有特定的、含量大致相同的胶凝离子，所述胶凝离子例如是钙或者锶、钡、锌、铁、锰、铜、铅、钴、镍或是它们的组合，以提供更精确预测的胶凝速度和凝胶强度。可以采用由溶液沉淀的方法制备有已知预定的碱土离子含量的不溶的藻酸碱土盐例如藻酸钙或藻酸锶(取决于所用胶凝离子)或不溶的藻酸过渡金属盐(如使用铜、镍、锌、铅、铁、锰或钴的胶凝离子的那些盐)。在一些实施方式中，首先用市场可购得的藻酸钠制备藻酸钠溶液。任选地，在该藻酸钠溶液中包含如碳酸钠的钠盐。使用含有用于不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的所需的胶凝离子的盐，例如，钙盐或锶盐，如氯化钙或氯化锶来制备溶液。藻酸钠溶液优选缓慢地与胶凝离子溶液合并。合并后的溶液在混合过程中优选进行连续搅拌。不溶的藻酸盐例如藻酸钙或藻酸锶(取决于所用的胶凝离子)从合并溶液中沉淀。然后，从溶液除去沉淀的不溶藻酸盐并用净化水反复洗涤，如2-10次，以除去所有可溶的离子。例如可通过测试不溶藻酸盐在净化水中电导率，与净化水的电导率相比较，确定除去了可溶的离子。洗涤后，不溶的藻酸盐可以例如真空干燥。干燥的藻酸盐可以进行磨碎，在一些实施方式中，并进行粒径选择。
在一些实施方式中，藻酸盐是无菌的。在某些优选的实施方式中，藻酸盐是无菌的超纯藻酸盐。常用来对材料进行灭菌的条件可能会使藻酸盐发生变化，如降低分子量。在一些实施方式中，无菌藻酸盐采用无菌过滤器制备。在一些实施方式中，藻酸盐的内毒素量＜25EU/克。
在一些实施方式中，在形成凝胶基质后，藻酸盐基质可涂覆聚阳离子聚合物，如聚氨基酸或壳聚糖。在一些实施方式中，聚阳离子聚合物是聚赖氨酸。在一些实施方式中，聚赖氨酸与另一个部分相连，因此聚赖氨酸用来促进该部分与凝胶的缔合。用聚阳离子聚合物与凝胶相连的部分的例子包括，例如，药物，肽，造影剂，连接受体的配体或其它可检测到的标记物。一些特定的例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和骨成形素蛋白质(bone morphogenic protein)(BMP)。药物可以包括癌症的化疗剂，如Taxol、顺铂和/或其它含铂衍生物。碳水化物聚合物可以包括透明质素(hyaluronan)、壳聚糖、肝素、昆布素、墨角藻聚糖、硫酸软骨素。在一些实施方式中，所用藻酸盐是改性的藻酸盐聚合物，如化学改性的藻酸盐，其中一种或多种聚合物与不同的藻酸盐聚合物相连。这种改性的藻酸盐聚合物的例子可在U.S.No.6,642,363中发现，该专利参考结合于本文中。
在一些实施方式中，藻酸盐聚合物包含非藻酸盐部分，例如，药物，肽，造影剂，连接受体的配体或其它可检测的标记物。在一个实施方式中，藻酸盐聚合物包括RDG肽(Arg-Asp-Gly)、放射性部分(如131I)或射线透不过的物质。与藻酸盐聚合物相连的部分的其它例子包括，例如，药物，肽，造影剂，连接受体的配体或其它可检测的标记物。一些具体例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和骨成形素蛋白质(BMP)。药物可以包括癌症化学治疗剂，如Taxol、顺铂和/或其它含铂衍生物。碳水化物聚合物可以包括透明质素(hyaluronan)、壳聚糖、肝素、昆布素、墨角藻聚糖、硫酸软骨素。
可溶的藻酸盐可以是例如Na+-藻酸盐，K+-藻酸盐，PEG-藻酸盐(聚乙二醇-藻酸盐)，NH4-藻酸盐或它们的组合的盐。
在一些实施方式中，可溶的藻酸盐进行冷冻干燥或者干燥。冷冻干燥的可溶性藻酸盐是“速溶的”。“速溶的”藻酸盐在不到1分钟，优选不到30秒，更优选小于15秒内可溶于水。“易溶的”藻酸盐需要1分钟以上，通常是几分钟成为溶液。
在不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒中使用的胶凝离子影响胶凝动力学、凝胶强度和弹性。胶凝离子还影响到细胞生长。在不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒中使用的胶凝离子可以是Ca++、Sr++、Ba++、Zn++、Fe++、Mn++、Cu++、Pb、Co、Ni或者它们的组合。
不溶的藻酸盐胶凝离子络合物是颗粒物。所述颗粒通常是基于一定L/D比值的非纤维状，颗粒形状可以用最大直径(L)和最小直径(D)来表征。非纤维状的L/D小于10，优选小于5，更优选小于2。L/D大于或等于10为短切的纤维。不溶的藻酸盐胶凝离子可以维持为分散体或干燥形式。如果是分散体，该分散体可以与含可溶的藻酸盐的溶液混合，或者与速溶的藻酸盐混合，形成不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒在含可溶的藻酸盐溶液中的分散体。如果不溶的藻酸盐的胶凝离子颗粒为干燥形式，这些颗粒可以与干的速溶的藻酸盐混合，然后与溶液混合，形成不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒在含可溶的藻酸盐的溶液中的分散体，或者干的不溶的藻酸盐的胶凝离子颗粒与含可溶的藻酸盐溶液混合，形成不溶的藻酸盐胶凝离子颗粒在含可溶的藻酸盐的溶液的分散体。
对形成分散体的组分进行搅拌混合，使固体颗粒分散在溶液内。这样制得的分散体可以是浆料形式，可以倾倒、注入模具或空腔内，或者在模具或空腔内自胶凝，形成模具或空腔的形状。
不溶的藻酸盐的胶凝离子颗粒形成在含可溶的藻酸盐溶液的分散体，将该分散体分配到发生自胶凝的部位，形成藻酸盐凝胶。在一些实施方式中，将分散体分配到体内的位置。在一些实施方式中，将分散体分配到在个体体内的位置。在一些实施方式中，分散体分配到模具或其它容器或表面上。
不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒中所用胶凝离子的浓度会影响胶凝动力学，凝胶强度和弹性。胶凝离子浓度越高，凝胶强度则越高。当凝胶被胶凝离子饱和时凝胶强度最高。相反，胶凝离子越低，则凝胶强度越低但生物可降解性越高。
不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的粒径可影响胶凝动力学和凝胶的最终性质。粒径越小，则凝胶形成得越迅速。较大的凝胶粒径产生强度较高的凝胶。粒径可以通过例如用不同尺寸的过滤器来过滤不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒来控制，以使颗粒一般可以在预定的粒径范围之内。在一些实施方式中，颗粒为＜25μm，25-45μm，45-75μm，75-125μm或＞125μm。
所用溶剂可以是例如，水、盐水、糖溶液、细胞培养液、诸如药物溶液、蛋白质或核酸溶液的溶液、诸如细胞悬浮液、脂质体或造影剂悬浮液的悬浮液。
形成的藻酸盐水凝胶可包含例如药物、核酸分子、细胞、多细胞集合体、组织、蛋白质、酶、脂质体、造影剂或生物活性物质。生物活性物质的例子是透明质酸盐和壳聚糖。造影剂包括钽和钆。蛋白质的一些具体例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和骨成形素蛋白质(BMP)。药物可以包括癌症化学治疗剂，如Taxol、顺铂和/或其它含铂衍生物。碳水化物聚合物可以包括透明质素、壳聚糖、肝素、昆布素、墨角藻聚糖、硫酸软骨素。
可用于凝胶的细胞包括非重组体细胞和重组体细胞。细胞封装在藻酸盐基质内的一些实施方式中，封装的细胞是哺乳动物的细胞，优选人细胞。在封装的细胞是非增殖细胞的一些实施方式中，非增殖细胞可选自下组：胰岛，肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮细胞、甲状腺和副甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、卵巢细胞和软骨细胞。封装的细胞是增殖细胞的一些实施方式中，增殖细胞可以是干细胞、原粒子细胞(progenitor cell)、特定器官的增殖细胞、纤维母细胞和角化细胞或者衍生自建立的细胞系，如293、MDCK和C2C12细胞系。在一些实施方式中，封装的细胞包含编码在维持细胞时表达的一种或多种蛋白的表达载体。在一些实施方式中，该蛋白是细胞因子，生长因子，胰岛素或血管生成抑制剂如血管抑制素或内皮抑制素，其它治疗蛋白质或其它治疗分子如药物。因为凝胶网状物的多孔性，分子量较低，小于约60-70kD的蛋白质是特别好的候选物。在一些实施方式中，细胞以多细胞集合体或组织存在。
自胶凝的藻酸盐可用来产生大于5mm的具有均匀藻酸盐网状物的藻酸盐凝胶。在一些实施方式中，均质藻酸盐凝胶大于10mm。采用扩散法形成的凝胶通常的大于1mm的非均质藻酸盐凝胶。在优选的实施方式中，通过自胶凝藻酸盐形成的藻酸盐凝胶不含硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐(TSPP：焦磷酸四钠和多磷酸盐与藻酸盐被用于具有藻酸盐布丁类(puddings)等的食品应用)、乳酸盐、EDTA(乙二胺四乙酸)和用脂质体封装胶凝离子的脂质。
自胶凝的藻酸盐有许多用途。在一些实施方式中，自胶凝的藻酸盐可用于食品。特别能用于食品的自胶凝的藻酸盐可以和食品的其它组分制成液体/浆料混合物，并将其分配到容器中。所述容器优选是凝胶/食品内固化形成均匀模具形状的固体或半固体的模具。可以制备糖果、可食用的装饰品、布丁类食品和其它成形的食品。
在一些实施方式中，自胶凝的藻酸盐可用于生物医学应用。生物相容的自胶凝的藻酸盐可以局部施用。生物相容的自胶凝的藻酸盐特别可用于需要凝胶基质来原位占据空间，将自胶凝的藻酸盐作为分散体分配到需要该基质的部位的生物医学应用。分散体以液体/浆料形式填充空腔或空间并在空腔或空间内固化形成固体。或者，在分散体固化之前将其局部铺展分配。在一些实施方式中，自胶凝的藻酸盐用于制造特定形状的基质，通过制备液体/浆料，将液体/浆料分配在模具中，固化形成一定形状的固体和/或制备有用作组织或器官替换的封装的细胞的基质。
提供的藻酸盐的自胶凝体系是可控制的、是生物相容性并特别设计成能原位形成凝胶的移植。提供的溶液可以方便地注入或以其它方式施用在体内或体外，固化形成固体凝胶基质。通过在溶剂存在下混合藻酸盐与胶凝离子源，所述胶凝离子限于不溶的颗粒的凝胶网状物内，可以凝胶形成材料以液体分配并以所需图形和时间量级固化。容易在预定的时间内硬化并形成凝胶。该配料是生物相容性的，其pH变化和存在的毒性化合物可以忽略。明显偏离生物学的pH是不利的。
在一些实施方式中，自胶凝的藻酸盐可用于生物医学应用，如组织填充，例如用于治疗回流问题(即治疗失禁，肾回流或食管回流问题)，栓塞，例如治疗良性或恶性肿瘤，外科手术后的抗粘附治疗和创伤处理。目前的技术可用于几种应用，包括在体外或体内的组织结构，将细胞或其它生物材料混入胶凝体系，从而形成支承细胞或组织的生物人工(bioartificial)细胞外基质。根据一些应用，可以移植生物相容性的固体储库，这种储库随时间释放活性组分如蛋白质和药物。
自胶凝的藻酸盐特别可用作组织填充材料，因为相对于其它类型的移植物，自胶凝的藻酸盐可以以液体浆料引入偏远可达到的部位并进行分配，完全填充空腔。分散体以足以替代和支撑其它组织和器官的量分配到体内，并原位形成凝胶，提供维持和支承其它组织和器官的结构。自胶凝的藻酸盐可包含能使其更好适用于组织填充应用的组分。例如，使用锶作为胶凝剂能产生抑制细胞过度生长和形成不希望的组织的凝胶。
自胶凝的藻酸盐特别可用于栓塞过程，因为相对于其它类型闭合如缝合，自胶凝的藻酸盐以液体浆料引入偏远可达到的部位并进行分配，完全填充内部或血管，并能完全有效地阻断。分散体以足够量分配，在原位形成凝胶后阻断循环。自胶凝的藻酸盐可以包含能使其更好适用于栓塞应用的组分。例如，选择的组分可以相对快速固化并具有高强度。用于栓塞应用的自胶凝藻酸盐可包含造影剂，来监测自胶凝藻酸盐的存在和位置。
自胶凝的藻酸盐可特别用于作为术后过程的抗粘附的处理，因为自胶凝的藻酸盐能以液体浆料引入到手术处理的整个区域，完全覆盖露出的表面，特别是在切开部位或空间切开部位。自胶凝的藻酸盐可包含使其能更好适用于抗粘附应用的组分。例如，使用锶作为胶凝剂能产生抑制细胞过度生长和形成不希望的组织的凝胶。
自胶凝的藻酸盐特别可用于创伤处理，因为自胶凝的藻酸盐能以液体浆料引入到创伤的整个区域，完全覆盖露出的表面。此外，自胶凝的藻酸盐通过创伤部位例如以液体浆料进行内部分配。分散体以足够量分配，完全填充内部空腔，在原位形成凝胶后，凝胶能隔开任何内部创伤并防止血液从内部渗出损失。自胶凝的藻酸盐可包含使其能更好适用于创伤处理的应用。例如，可包含凝血组分以及防腐和抗菌组合物。
自胶凝的藻酸盐特别可用于制造体外或体内的组织结构。细胞或其它生物材料可以混入胶凝体系内，从而形成支承细胞或组织的生物人工细胞外基质。根据一些应用，分散体可以以液体浆料原位引入组织/细胞的功能部位，达到治疗效果。组织结构的例子包括：骨、软骨、结缔组织、肌肉、肝、心脏、胰腺和皮肤。这种分散体的例子可以是用于治疗糖尿病的含分泌胰岛素细胞的制剂，用于修复缺损关节的含软骨细胞的配剂和用于治疗帕金森症的细胞。这种细胞可以加入到液体浆料并分配到一定部位，在形成凝胶后，这些细胞存在与生物相容性的藻酸盐基质中并发挥作用。凝胶还可以用作相对于受主免疫体系保护截留的细胞的免疫屏障。自胶凝的藻酸盐还可以用来体外封装细胞，从而使凝胶可以形成与其最终目的相适应的形状。在一些实施方式中，自胶凝的藻酸盐可用来封装细胞，如真皮细胞，并制备人工皮肤，如用来治疗烧伤对象和其它需要皮肤移植或大面积创伤复原。在一些实施方式中，自胶凝的藻酸盐可用来封装细胞并形成可植入的基质。
糖尿病的治疗可包括制备包含产生胰岛素的细胞的生物相容性基质，通过制备包含在可溶的藻酸盐溶液中不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒和产生胰岛素的细胞的分散体，并将该分散体分配到个体体内的部位，形成生物相容性的基质。个体体内的部位可以是移植在个体内的空腔或结构。分散体可以分配到模具、结构或容器内，形成生物相容性基质，该基质可移植到个体的体内。基质中的细胞产生的胰岛素是通过细胞分泌并从基质释放到个体体内，发挥缓解糖尿病症状的功能。在一些实施方式中，产生胰岛素的性能是胰岛细胞。在一些实施方式中，产生胰岛素的细胞是表达和分泌胰岛素的重组体细胞。
自胶凝的藻酸盐特别可用于制造覆盖的器件，如可植入的器件。在一些实施方式中，所述器件选自以下组：移植片固定模(stent)、心脏起搏器、导管、可植入修复假体、外科用螺钉、外科用金属线、组织填充移植物、食道回流抑制性移植物、失禁抑制性移植物、肾回流抑制性移植物、适用于支撑沉积在表面外和/或用藻酸盐基质封装的细胞的容器如固态装置或大胶囊、乳房移植物、颌移植物、颊移植物、胸移植物、臀肌移植物和牙移植物。使用自胶凝的藻酸盐的涂层产生与形状无关的有效涂层。使用锶作为胶凝离子对抑制移植后的细胞过度生长特别有用。
自胶凝的藻酸盐可用于制造能进行移植的基质。这种基质通过以下方式可以制成特定形状：制备液体/浆料混合物，将该混合物分配到一模具中，固化形成模具形状的固体。为移植物制备的基质可以包含生物活性剂和/或细胞。可制备凝胶并手术移植，通过外部开口局部施用或施用到器官内。
根据一些实施方式，提供用来制备藻酸盐凝胶的成套工具。该成套工具包括含可溶的藻酸盐的第一容器；含不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的第二容器。各容器是整合容器系统中独立的容器室。
在一些实施方式中，成套工具包含溶液形式的可溶的藻酸盐。在一些实施方式中，成套工具包含可溶的藻酸盐，不含溶剂。在一些实施方式中，成套工具包括含溶剂的另外容器。
在一些实施方式中，成套工具包含粉末形式的不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。在一些实施方式中，成套工具包含为分散体形式的不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。
在一些实施方式中，成套工具包括包含药物、肽、蛋白质、细胞、可检测的标记物或造影剂的另外容器。在一些实施方式中，成套工具包括包含在可溶的藻酸盐溶液的容器内和/或在包含不溶的藻酸盐/胶凝离子粉末或分散体的容器内的药物、肽、蛋白质、细胞、可检测的标记物或造影剂。
根据一些实施方式，提供用来制备凝胶的组合物。该组合物包含速溶的藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。组合物还可以包含药物、肽、蛋白质、细胞、可检测的标记物或造影剂(contrast reagent)。组合物可以是成套工具中的组分。这种成套工具还可以包括含溶剂的容器。
成套工具优选包含使用说明书。
在一些实施方式中，成套工具包括混合器件。混合器件可以整合作为容器或容器系统的一部分整合。在一些实施方式中，混合器件包括阀系统，可以使分散体从一个容器传输到另一个容器以实施混合。
在一些实施方式中，成套工具包括分配器件。该分配器件包括与混合器件和/或适合包含分散体的容器连通的施加器。在一些实施方式中，该分配器件包括导管。在一些实施方式中，分配器件包括注射器。
实施例
实施例1：  在不同钙浓度下胶凝
在此试验中，通过混合藻酸钠溶液(Protanal SF 120)和藻酸钙分散体(Protaweld TX 120)制备凝胶。改变藻酸钙的量(凝胶中1.0％，1.5％或2.0％)，同时藻酸钠的量不变(凝胶中1.0％)。自胶凝体系固化时间采用Physica MCR 300流变仪(测量系统：PP50，锯齿状的，温度：20℃，间隙：1mm，频率：1Hz，应变：0.005)。在向流变仪加入3ml样品之前，即刻混合上述溶液和分散体，并在18-24小时内进行振动测试。
如图1所示，在开始的1-2小时凝胶强度迅速提高，然后，随凝胶显示稳定化趋势，凝胶强度的变化减小。数据还表明在较高钙浓度，凝胶强度提高。
实施例2：不同藻酸盐浓度下胶凝
藻酸盐的自胶凝体系按照实施例1所述，通过混合藻酸钠溶液(ProtanalSF 120)与藻酸钙悬浮液制备并进行测量。在18-24小时内进行振动测量。使用等量的藻酸钠(Protanal SF 120)和藻酸钙(Protaweld TX 120)。在最终凝胶中藻酸钠和藻酸钙的量各自分别调节到0.75％、1％、1.25％和1.5％(图2)。在四种藻酸盐量情况下胶凝动力学都遵循类似的图形。但是，如实施例1中，凝胶强度随藻酸盐浓度增加而明显提高。
实施例3：不同分子量的藻酸盐下胶凝
在此试验中，比较了不同分子量的藻酸钠和藻酸钙的胶凝等离子(图3)。通过升高温度几天，获得该藻酸盐(Protaweld TX 120)的MW减小的样品(图3，框A)。还比较了具有不同MW的Protanal SF 120和Protanal SF/LF藻酸钠(图3，框B)。按照实施例1进行流变测量，数据示于图3。如该图所示，胶凝过程明显取决于藻酸钠和藻酸钙这两种藻酸盐的分子量。在这两种情况下，对高分子量藻酸盐，凝胶强度迅速提高并达到较高水平。与图3所示类似，图11也示出通过升高温度获得的藻酸钠(PRONOVA UP G 100)的MW减小的样品的胶凝。然而，在这种情况，通过与藻酸锶混合来引起胶凝。如图11所示，该胶凝过程明显取决于藻酸盐分子量，对高分子量藻酸盐达到较高的凝胶强度。图11中使用100％饱和化学计量的藻酸钙或藻酸锶的数据表明，藻酸盐浓度的提高弥补了MW对凝胶强度的下降。
实施例4：不同胶凝离子下的胶凝
在此试验中，藻酸钙或藻酸锶与藻酸钠(Protanal SF 120)混合。藻酸钙和藻酸锶通过将藻酸与碳酸钙捏合来制备。按照实施例1所述减小流变测量，数据示于图4。将藻酸钠和藻酸锶/藻酸钙量各自调节到为凝胶中0.75％。很清楚，用锶作为胶凝离子得到较高强度的凝胶结构以及更快速的胶凝动力学。
实施例5：不同古洛糖醛酸含量下的胶凝
已知，古洛糖醛酸在藻酸盐中的浓度是对藻酸盐凝胶的凝胶强度的主要影响因素，测试使用藻酸钠(Protanal SF 120和Protanal HF 60D)与不同浓度古洛糖醛酸的效果。图5的框A示出对含藻酸钠与高含量或低含量古洛糖醛酸的凝胶，作为时间函数的储能模量。在这两个曲线中，通过混合有高含量古洛糖醛酸的藻酸钙(Protaweld TX 120)的分散体使该体系胶凝。藻酸钙和藻酸钠用量各自调节到为凝胶的1.0％。按照实施例1所述进行测量。很清楚，虽然在这两种情况，都使用了有高含量古洛糖醛酸的藻酸钙，但使用有高浓度古洛糖醛酸的藻酸钠提高了体系的凝胶强度。图5的框B中，藻酸锶(FMC方法产品，具有高含量古洛糖醛酸，实施例14)还与有高含量和低含量的古洛糖醛酸的藻酸钠混合。所用藻酸钠是PRONOVA UP 100G(69％G，MW：122000)和PRONOVAUP 100M(46％G，MW：119000)。选择两种藻酸钠批料，使它们的MW(和粘度)类似(尽可能接近)。由数据清楚得显示，当使用藻酸锶作为胶凝离子源时，使用高古洛糖醛酸含量的藻酸钠与使用低古洛糖醛酸含量的藻酸钠相比提高了凝胶强度。
实施例6：在生理条件下由不同钙含量制备的凝胶的稳定性
在此实施例中，观察在不同钙含量制成的藻酸盐凝胶的稳定性和生物可降解性图6)。制备凝胶盘，即，将进行了高压蒸汽处理灭菌的藻酸钙(ProtaweldTX 120)与过滤的无菌藻酸钠(Pronova UP LVG)混合至最终浓度分别为1.0％和0.7％。分散体在两个陪替氏(Petri)培养皿中胶凝。引发胶凝后一个培养皿中的凝胶盘(标为V)用50mM氯化钙洗涤10分钟，然后将两个盘都加入到细胞培养介质(悬浮有10％FBS的DMEM)。培养皿中的介质每周定时更换新鲜介质三次，凝胶盘在无菌条件下37℃储存于CO2-培养箱中。每个培养皿中最大尺寸的凝胶盘的最初尺寸相同。6个月后，如图6示出的凝胶未被钙洗去的主要部分(major fraction)消失，而用另外的钙洗涤的凝胶盘的尺寸在这段时间维持不变或仅有很小的变化。这清楚表明：制成的钙含量有限的藻酸盐凝胶在生理条件下明显降解。
实施例7：细胞截留
将细胞封装在藻酸盐微珠中的方法在目前开发不同生物医学应用时广泛采用的方法。藻酸盐珠粒用作治疗物质的“生物工厂(biofactory)”。藻酸盐凝胶能够使如氧和葡萄糖的主要养分的流入和所需治疗剂分子和废产物流出。通过使用像胰岛细胞的响应细胞，“生物工厂”对受主作出响应。但是，凝胶网状物需要在外来细胞植入体内时保护截留的细胞免受受主的免疫体系作用。但是，已经显示细胞被成功截留在其他藻酸盐结构而不是微珠中。
还示出了凝胶对截留在本发明的自胶凝藻酸盐基质的细胞的作用(图7)。其中要过试验(图7的框A)中，C2C12小鼠肌母细胞细胞与PRONOVA UP MVG藻酸盐溶液混合，然后与高压蒸汽灭菌的藻酸钙分散体(Protaweld TX 120)混合。将含细胞和0.7％藻酸钠和1.0％藻酸钙的混合物注入一个陪替氏培养皿中，成形为培养皿形状。几分钟后，凝胶用50mM氯化钙清洗10分钟，以防止凝胶的降解(参见实施例6)，然后在该凝胶中加入细胞生长介质(DMEM，补充有10％FBS)。藻酸盐凝胶/细胞培养液储存在无菌条件下37℃的CO2培养箱中，每周定时更换介质三次。45天后，用钙黄绿素着色，显微镜下显现培养液中存在活细胞。使用荧光显微镜来目测活细胞。
在图7的框A中，示出在凝胶外部和内部都存在活细胞。由于显微镜在凝胶不同点的不同部分上的聚焦不同使图片或多或少清楚。许多活细胞或小细胞群落在凝胶内部被看成为发亮的点。覆盖图片大部分的较大的发亮区示出进入凝胶表面并繁殖的活细胞。这一部分的凝胶表面完全被单层生长的细胞覆盖。但是，凝胶表面上的一些细胞聚集体也存在于其它区域。
在另一个试验中(图7的框B)，人软骨细胞被截留在藻酸盐的自凝胶中。这种情况，凝胶由5ml混合的自凝胶PRONOVA SLG 20(高古洛糖醛酸含量的低粘度冻干的无菌藻酸盐)和藻酸钙(FMC方法产品，实施例14)观察，含有人软骨细胞。胶凝后3天，用振动切片机将该凝胶切片为600μm薄片。该凝胶薄片储存CO2-培养箱中的细胞培养介质中，6个月后拍摄照片。该照片是用钙黄绿素对细胞着色作为细胞存活性标记后，用荧光显微镜拍摄的。该照片清楚地表明存在大量的活细胞。因此，藻酸盐凝胶网状物必须是能长期支撑细胞的优良基质。总之，这些数据清楚地表明，该凝胶是可用于细胞和细胞生长的生物相容性的基质。
还制备了一系列含人软骨细胞的不同藻酸盐样品。在这种情况下，选择高分子量藻酸盐以在低胶凝离子和藻酸盐浓度下保持凝胶强度。这些藻酸盐是PRONOVA SLG 100和PRONOVA SLM 100(分别有高古洛糖醛酸含量和低古洛糖醛酸含量的高粘度冻干的无菌藻酸盐)。软骨细胞混入约2％藻酸盐在细胞介质中的溶液。然后，保持该藻酸盐/细胞悬浮液约0.5小时，在进一步使用之前使气泡释放。细胞悬浮液然后与不溶的无菌藻酸钙或藻酸锶混合(FMC方法产品，按实施例14制备，小瓶中含有5ml 10％藻酸盐分散体，藻酸盐总量为0.5mg)。不溶的藻酸盐的每个小瓶中包含用来搅拌的磁体，小瓶打开后当天使用。不溶的产物还可以磨碎并进行筛分，以控制粒径，并制备有高古洛糖醛酸含量和低古洛糖醛酸含量的藻酸锶和藻酸钙。藻酸盐/细胞悬浮液和不溶的藻酸盐分散体可以以小体积在小试管中混合。在从小瓶中取出所需体积的分散体时，保持磁力搅拌该不溶的藻酸盐分散体。按照下面表中所示混合不同的样品。
含细胞的凝胶体系(括号内为起始浓度)
  组   藻酸盐溶液   离子源，藻酸盐   混合比
  Alt.1   1.6％PRONOVA SLG 100(2.0％)   2.0％锶高G(10％)   4∶1
  Alt.2   1.6％PRONOVA SLG 100(2.0％)   2.0％钙高G(10％)   4∶1
  Alt.3   1.6％PRONOVA SLM 100(2.0％)   2.0％锶高G(10％)   4∶1
  Alt.4   1.6％PRONOVA SLG 100(2.0％)   2.0％锶高M(10％)   4∶1
混合物开始胶凝几分钟后，将小凝胶片储存在CO2培养箱的细胞培养介质中，一周后，用钙黄绿素着色来检测细胞存活性(按前面所述)。在此研究中，观察到在所有藻酸盐凝胶/细胞样品的良好的细胞存活性。或者，原位制备藻酸盐/软骨细胞样品。根据具体应用，不同的自凝胶制剂可适用于每一种特定的用途。凝胶可以直接含有细胞，但也可以含有微珠或者其它含细胞的生物结构。可以在完全胶凝之前注入该制剂，也可以在用作之前使凝胶在体外完全或者部分固化。此外，凝胶或多或少具有一定强度并是多孔的，以使细胞能够在凝胶内增殖或不发生增殖，以适应环境或者达到免疫保护。根据胶凝离子的类型和藻酸盐的类型，可以将凝胶配制成对细胞过度生长的影响较小。通过使用低钙含量(如实施例6和图6所示)、低分子量藻酸盐或低藻酸盐浓度，也可以使凝胶结构或多或少为可生物降解的。凝胶还可以与象透明质酸盐或壳聚糖的其它生物高分子混合以改善性质。凝胶还可以通过适当的浸渍或喷雾方法在凝胶结构中施加另外的钙得到进一步的增强。
实施例8：控制释放的系统
藻酸盐在用于药物或其它治疗分子传递的受控体系中的有效性已经得到证实。类似地还可以使用在此证实的类型的凝胶制剂，这种凝胶制剂在不同的配方中具有许多优点。一个例子是可生物降解凝胶的用途，即使用低浓度的胶凝离子以限制治疗周期。在治疗癌症患者时，可以在手术期间施用含药物或放射性同位素的填充空间的凝胶，以防止病症的复发。活性物质释放或者放射活性衰减后，要求凝胶能溶解并从体内排泄。当然，自胶凝的藻酸盐的受控的传递制剂也可以直接注入体内而无需任何手术过程，凝胶/藻酸盐溶液也可以用于口服的药物传递。对口服用途，在目前著名的藻酸盐制剂中是抗回流的药物。因此，藻酸盐的自胶凝制剂也可以有类似的用途。
实施例9：组织工程应用
在此提出的将细胞截留在藻酸盐凝胶内部可用来制造可植入的“生物工厂”，分泌用来治疗各种病症的活性物质。但是，将细胞截留在藻酸盐凝胶内的方法还可用于组织工程(tissue engineering)的应用。为进行组织工程，需要细胞在三维结构内或在三维结构上生长，因此，需要用于这类应用的生物材料。交联离子的缓时释放使得胶凝离子的藻酸盐悬浮液能够在发生胶凝之前成形为复杂的几何体。在体外条件下，这种藻酸盐结构在开发组织或人工器官中可以用作生长基体。当凝胶表面可以是细胞的生长基体时，细胞在藻酸盐凝胶珠的表面上生长。已经发现，细胞在藻酸盐凝胶上的生长取决于使用的藻酸盐和胶凝离子。现有的自胶凝制剂可以用来在藻酸盐片或其它形状凝胶结构的内部或表面形成多层细胞生长层。此外，藻酸盐胶凝之后可以通过用柠檬酸盐、磷酸盐或其它胶凝离子螯合剂处理后除去。这样可以将组织或器官结构中的几个细胞层组合。如果需要开发这种结构时，该凝胶结构内部或表面上的几种细胞类型可以组合。
神经再生是将藻酸盐用于组织工程内部的一个有益的例子。用自胶凝的藻酸盐填充人工神经管道适用于形成改进了导向和神经再生长的生物相容性的结构。与其它方法相比，这种体系具有更好的适应性并能更好控制成形过程和结构性质。
可注射的藻酸盐/细胞悬浮液体系即使在没有通过手术情况下，也可以传递到有缺陷或受损的组织部位。对这类应用，关键是在材料胶凝之前必须有一定的运作时间使材料成形。但是，也需要合理快速的胶凝速度，以避免延长患者等候的时间或施用该凝胶/溶液而产生的问题。如在此所示以及前面提到的自胶凝体系可以适应于不同的胶凝时间曲线和不同强度和稳定性性能。因此，这种可变性可适用于所有的注射过程。一个例子是修复软骨缺陷一直是使用自胶凝的藻酸盐结构的潜在的可能。已经发现，藻酸盐是能用于软骨组织工程的有用的生物材料，并且藻酸盐能刺激软骨形成(chondrogeraesis)。因此，可以在治疗关节缺陷时直接注入含有软骨细胞或其它细胞或不含这些细胞的自胶凝的藻酸盐溶液。目前，骨关节炎患者已经用“关节液”进行治疗，因此在市场上有两类产品，透明质酸钠(Hyalgan)和hylan G-F 20(Synvisc)，据信这些产品都是通过供给透明质酸起润滑剂作用，这种物质提供关节液其粘度。对某些人群疼痛缓解可延续6-13个月。这种治疗已经证实对患有轻度到中度膝关节炎的人群最有效。但是，已知透明质酸在体内会降解，因此使用如藻酸盐的低生物可降解性和良好生物相容性的其它生物高分子提供了诸多优点。
藻酸盐水凝胶可以冻干或者以其它方式处理除去部分或全部的水，以形成象海绵或纤维状的生物相容的结构。采用本文提出的技术，使用自胶凝的藻酸盐体系，也可以作为制造生物相容的海绵或用于组织工程或其它应用的其它结构的一个步骤。
自胶凝的藻酸盐制剂可以用于移植片固定模或移植物或其它移植器件中的覆盖物。根据藻酸盐制剂的类型，该覆盖物可以或多或少具有可生物可降解性，并多少维持寄主细胞向内生长或加入到该器件的细胞的生长。
实施例10：组织填充
藻酸盐可以传递到靠近尿道括约肌的粘膜下层，提供用于膀胱失禁治疗的填充，该方法已经在临床上实施。另一个例子是将藻酸盐制剂传递到食道和胃之间接合点，有助于治疗胃-食管回流紊乱。藻酸盐的高度相容性使藻酸盐能够用作整容过程中的可注射的溶液，并作为其它材料的有吸附力的替代品。
基于自胶凝的藻酸盐体系的制剂用来形成可注射的溶液或具有预定硬化时间的糊料，用来填充预定的体积。如前面所述，可以使凝胶制剂或多或少为可生物降解的，给予填充制剂所需的性质。
实施例11：血管栓塞
可以采用形成血管闭合的方法来治疗诸如动静脉畸形、动脉瘤、对肿瘤的过度血液供给的病症，控制大量血管出血以及其它需要栓塞来缓解病症的症状。一些栓塞体系包括使用在与血液或其它体液接触时开始固化或沉淀的聚合物溶液。但是，这种体系存在聚合物溶液迁移到不希望的体内部分，因为时间拖延必然导致形成固体聚合物或固体聚合物沉淀。将聚合物溶液注入“高流动”区域如血管体系时这些聚合物溶液体系中的迁移尤其是关注的问题。由聚合物溶液形成的纤维也会造成其它问题，如栓塞不良，过度脆性，或者不是生物相容的。已经发现，PVA(聚乙烯醇)的颗粒或珠粒或胶凝珠粒能用于栓塞，目前已经在临床广泛使用。
还已经提出，基于藻酸盐的制剂可用于栓塞过程。也提出血管内闭合可以使用藻酸盐，通过控制藻酸盐液体和氯化钙溶液注射在血管系统内用于闭合的目标部位和发生的聚合反应来引起闭合。与这种系统相比，使用本文提出的自胶凝的藻酸盐制剂有许多优点。治疗可以以简单的注射进行，自硬化制剂的强度可以通过控制该系统进行调节。特别在胶凝之前的时间和生物可降解性需要控制时这种自胶凝藻酸盐制剂是有用的。
实施例12：抗粘附制剂
粘附的形成可归因于手术操作、创伤、感染等。粘附经常发生在在腹部手术后，并且是导致肠梗阻、不育症和疼痛的主要临床问题。防止或较少粘附的各种努力大多未获成功；但是，已经证实近来开发的使用不同生物高分子的机械屏障是防止粘附方面的临床上的进步。
也已经提出将基于藻酸盐的制剂作为抗粘附的屏障。抗粘附屏障可以使用本文提出的自胶凝的藻酸盐体系进行配置。该溶液/凝胶制剂在使用之前即刻进行预混合，使具有合适的生物可降解性。这些类型的制剂还可以包含其它聚合物、药物或其它支撑化合物(supportive compound)。可以使用另外的聚合物，改善凝胶的性质，包括提高凝胶结构和组织之间的粘合性。
实施例13：创伤愈合制剂
藻酸盐敷料通常用来治疗渗出性创伤。目前用于创伤愈合的藻酸盐产品包含软的非织造纤维或垫。藻酸盐可以吸收其自重的几倍并在创伤内形成凝胶，填充死区(dead space)并维持一定湿度的环境。还提出藻酸盐可能通过更多未知的机理影响创伤愈合过程，并假定藻酸盐创伤敷料中的钙会通过对某些细胞的作用而影响创伤愈合的过程。
自胶凝的藻酸盐结构能够在愈合过程中顺应组织表面的三维结构。相对于其它制剂，可以获得可控制和限定的钙含量以及高度的再吸收性。
实施例14：不溶的藻酸钙的制备
藻酸钙可使用超纯(降低了内毒素含量)藻酸盐商品进行制备。此外，钙含量特性是化学计量量。具体是，将60克的PRONOVA UP LVG藻酸钠(批号FP-008-04)溶解于5L净化水中，该藻酸钠分子量约为130,000，粘度约为150mPas(1％溶液，20℃)，古洛糖醛酸盐含量为64％，内毒素含量为260 EU/克。加入26g碳酸钠。首先，将165克无水氯化钙溶解在500ml净化水中，用硝酸调节pH至中性。在连续搅拌条件下，将上述藻酸盐溶液小心加入到氯化钙溶液中。然后，沉淀出的藻酸钙用净化水连续洗涤4-8次，直到其电导率降低到类似于净化水的电导率。洗涤后的藻酸钙真空干燥，然后进行磨碎。按照类似的方法，但使用锶盐替代氯化钙，可制备不溶的藻酸锶。形成的不溶的藻酸盐具有受控的化学计量或亚化学计量量的钙或锶，当这种不溶的藻酸盐用于胶凝体系时，产生的凝胶的可重复稠度大于采用其它方法制备的不溶的藻酸盐的胶凝体系的稠度。
实施例15：在其它离子和钙结合剂存在下的胶凝
在这些试验中，按照前面(实施例1)所述进行振动测量。对含有1.25％藻酸钠(PRONOVA UP 100G)和5.5％藻酸锶(实施例14)以4∶1比率混合的凝胶(最终藻酸盐浓度为2.1％)，测定作为时间函数的储能模量。测定凝胶在氯化钠或六偏磷酸钠存在下或者没有氯化钠或六偏磷酸钠下的形成(图8)。测试两种不同的氯化钠浓度，数据清楚证实，当提高钠离子浓度时胶凝速度增加。在如六偏磷酸钠的钙结合剂存在下，也明显改变了胶凝动力学，并降低凝胶的最终强度。因此，数据显示存在如钠或钙配位化合物的非胶凝离子，如六偏磷酸盐下可改进胶凝动力学和凝胶的最终强度。
实施例16：用不同粒径的藻酸钙颗粒的胶凝
在制备不溶的藻酸盐过程中，可以控制最终产物的粒径。在此实施例中，通过以下方式制备一种藻酸钙批料，进行磨碎并用不同过滤器进行筛分，将不同粒径的颗粒分离。当不同的藻酸锶颗粒在相同条件下与藻酸钠胶凝时，胶凝过程和最终凝胶的性质存在较大差别(图9)。虽然较小粒径能迅速发生胶凝，较大粒径的总胶凝时间相对更长，并且这也使凝胶具有高得多的强度。但是，应注意，对较小粒径，因为胶凝速度很快，在将两种组分混合时凝胶很可能发生一定程度的降解(尤其对小于25μm的颗粒)。因此，这种效应也一定程度导致最终凝胶强度的差别。然而，总之数据显示需要考虑到粒径并应积极利用粒径来获得所需的性质。
实施例17：不同温度下的胶凝
还测试了是否可以主动利用温度调节来控制凝胶体系的固化。图10示出藻酸钙和藻酸钠的混合物在不同温度下的流变性。很清楚，与室温情况相比，10℃时胶凝速度下降，而在37℃胶凝速度提高。因此，数据显示可以主动利用温度，以控制胶凝动力学。其中，可以通过降低温度利用这一特性，使给予体内之前进行凝胶制备和处理的时间更长。
实施例18：用不饱和藻酸钙或藻酸锶颗粒的胶凝
制备藻酸钙和藻酸锶，它们与胶凝离子未达到化学计量饱和(小于100％饱和)。与饱和颗粒不同，这种未饱和的颗粒与含水溶液接触时迅速再水合。因此，未饱和的颗粒可用来形成凝胶颗粒组成的即时凝胶(instant gel)结构(非固体凝胶)。虽然该凝胶结构强度较低，但是容易成形保持较长的时间。细胞或其它材料通过简单加入含水容易然后与粉末混合，能容易地混入凝胶结构。其它颗粒或材料也可以通过与未饱和的颗粒预混合然后加入含水溶液而混入凝胶结构。这种方法的一个例子是预混合干藻酸钠、饱和的不溶的藻酸盐和未饱和的不溶的藻酸盐，然后加入含水溶液。在与水接触时，这种混合物如前面所述会产生即时吸水凝胶结构，但是，凝胶强度也会随时间进一步提高，因为凝胶中可溶的藻酸盐颗粒和不溶的饱和藻酸盐开始逐渐水合并在溶解后胶凝。本文所述的制剂利用了未饱和的不溶的藻酸盐的吸水性质，因此也可以用于和细胞或其它材料组合，并且对组织工程和其它应用特别有用。
实施例19：FP-411-03，制备具有化学计量量钙的(100％饱和)，富G-藻酸盐的，带有碳酸钠和硝酸的藻酸钙
将50克PRONOVA UP LVG藻酸钠，批号FP-008-04(古洛糖醛酸含量为64％，分子量为130,000g/mol，1％溶液在20℃的粘度为146mPas，内毒素含量为400 EU/克)溶解在3L净化水中。加入15克碳酸钠。加入钙溶液，该溶液包含139克CaCl2·2H2O，溶于300ml净化水中，并加有12ml HNO3(65％)。产生细小沉淀。测得该溶液的电导率为55mS/cm。沉淀物用净化水连续洗涤(8次)，直到电导率为0.08mS/cm。沉淀物真空干燥。
实施例20：FP-411-04，制备具有亚化学计量(sub-stioichiometric)量钙(50％饱和)的，富G藻酸盐的，带有碳酸钠和硝酸的藻酸钙
将25克PRONOYA UP LVG(如实施例19所述)溶解在1.5L净化水中。计算所需的钙量，25克藻酸盐代表0.146mol藻酸盐(采用的分子量为171g/mol)。所用藻酸盐PRONOVA UP LVG，批号FP-008-04，其古洛糖醛酸含量为64％，产生0.093mol的钙结合位点(0.146mol藻酸盐×64％古洛糖醛酸单体)。对于50％钙取代，需要0.0465mol的钙(0.093/2＝0.0465mol)。0.0465mol钙盐计算为二水合物为6.84克(0.0465mol×147.02g/mol(CaCl2·2 H2O)＝6.84克CaCl2·2 H2O。6.84克CaCl2·2 H2O溶解在150ml净化水和6ml HNO3(65％)中。在该藻酸盐溶液中加入7.5克碳酸钠。产生细小沉淀物。测量电导率为8mS/cm。该沉淀物连续洗涤(6次)，直到电导率为0.4mS/cm。沉淀物真空干燥。
实施例21：FP-411-05，制备有化学计量量的锶的(100％饱和)，富G藻酸盐的，带有碳酸钠和硝酸的藻酸锶。
将47克PRONOVA UP LVG藻酸钠，批号FP-008-04(古洛糖醛酸含量为64％，分子量为130,000g/mol，1％溶液在20℃的粘度为146mPas，内毒素含量为400 EU/克)溶解在3L净化水中。加入15克碳酸钠。加入锶溶液，该溶液由溶解在300ml净化水中的252克SrCl2·6H2O，并加有12ml HNO3(65％)所组成。产生细小沉淀物。测得该溶液的电导率为78mS/cm。测定物用净化水连续洗涤(8次)，直到电导率为0.0159mS/cm。测定物真空干燥。
实施例22：FP-411-06，制备亚化学计量量锶的(50％饱和)，富G藻酸盐的，带有碳酸钠和硝酸的藻酸锶。
将23.3克PRONOVA UP LVG(如实施例19中所述)溶解在1.5L净化水中。计算所需的钙量，23.3克藻酸盐代表0.136mol藻酸盐(采用的单体分子量为171g/mol)。所用的藻酸盐PRONOVA UP LVG，批号FP-008-04其古洛糖醛酸含量为64％，产生0.087mol的钙结合位点(0.136mol藻酸盐×64％古洛糖醛酸单体)。为了达到50％的锶替代，需要0.0435mol锶(0.087/2＝0.0435mol)。0.0435mol的锶盐计算成六水合物为11.6克(0.0435mol×266.62g/mol(SrCl2·6 H2O)＝11.6克SrCl2·6 H2O。11.6克SrCl2·6 H2O溶解在150ml净化水和6ml HNO3(65％)中。在该藻酸盐溶液中加入7.5克碳酸钠。产生细小沉淀物。测定电导率为22 mS/cm。该沉淀物连续洗涤(3次)，直到电导率为0.6 mS/cm。沉淀物真空干燥。
实施例23：FP-506-03，制备具有化学计量量锶的(100％饱和)，富M藻酸盐的，不含碳酸钠和硝酸的藻酸锶。
将50克PRONOVA UP LVM藻酸钠，批号即-408-01(古洛糖醛酸含量为44％，分子量为220,000g/mol，1％溶液在20℃的粘度为127mPas，内毒素含量为＜25EU/克)溶解在3L净化水中。加入锶溶液，该溶液由溶解在400ml净化水中的252克SrCl2·6 H2O组成。测得该溶液的电导率为43mS/cm。沉淀物用净化水连续洗涤(8次)，直到电导率为0.143mS/cm。沉淀物进行真空干燥，磨碎和分级。
实施例24：FP-505-05，制备具有化学计量量锶的(100％饱和)，富G藻酸盐的，不含碳酸钠和硝酸的藻酸锶。
将50克PRONOVA UP LVG藻酸钠，批号FP-408-02(古洛糖醛酸含量为69％，分子量为219,000g/mol，1％溶液在20℃的粘度为138mPas，内毒素含量为＜25 EU/克)溶解在3L净化水中。加入锶溶液，该溶液由溶解在400ml净化水中的252克SrCl2·6H2O组成。产生细小沉淀物。测定该溶液的电导率为40mS/cm。沉淀物用净化水连续洗涤(7次)，直到电导率为0.1mS/cm。沉淀物进行真空干燥、磨碎和分级。
实施例25：FP-505-02，制备具有化学计量量钙的(100％饱和)，富M藻酸盐的，不含碳酸钠和硝酸的藻酸钙。
将50克PRONOVA UP LVM藻酸钠，批号FP-408-01(古洛糖醛酸含量为44％，分子量为220,000g/mol，1％溶液在20℃的粘度为127mPas，内毒素含量为＜25 EU/克)溶解在3L净化水中。加入钙溶液，该溶液由溶解在300ml净化水中的137克CaCl2·2H2O组成。产生细小沉淀物。测定该溶液电导率为45mS/cm。沉淀物用净化水连续洗涤(8次)，直到电导率为0.0129mS/cm。沉淀物进行真空干燥、磨碎和分级。
实施例26：FP-504-02，制备具有化学计量量钙的(100％饱和)，富G藻酸盐的，不含碳酸钠和硝酸的藻酸钙。
将50克PRONOVA UP LVG藻酸钠，批号FP-408-02(古洛糖醛酸含量为69％，分子量为219,000g/mol，1％溶液在20℃的粘度为138mPas，内毒素含量为＜25 EU/克)溶解在5L净化水中。加入钙溶液，该溶液由溶解在500ml净化水中的231克CaCl2·2H2O组成。产生细小沉淀物。测定该溶液电导率为43mS/cm。沉淀物用净化水连续洗涤(8次)，直到电导率为0.0068mS/cm。沉淀物进行干燥、磨碎和分级。
实施例27：下表中示出有不同化学计量含量的钙和锶以及所用藻酸盐类型不同(富古洛糖醛酸盐(G)或富甘露糖醛酸盐(M))的产品的另一些例子。
  批号   盐   藻酸盐类型粘度，mPas   饱和度   Na％   Ca％   Sr％   粒径，μm
  FP-508-03   Ca   G113   100％   125，75，45，25
  FP-506-03   Sr   M127   100％   125，75，45，25
  FP-505-05   Sr   G425   100％   125，75，45，25
  FP-505-02   Ca   M410   100％   125，75，45，25
  FP-504-02   Ca   G993   100％
  FP-502-02   Sr   M663   100％   0.12   21.6   75
  FP-502-01   Ca   M663   100％   0.16   9.2   75
  FP-501-06   Sr   G149   100％   0.58   20.5
  FP-501-05   Ca   G149   100％   0.44   8.0
  FP-501-03   Sr   M110   100％
  FP-501-02   Ca   M110   100％   0.22   8.6
  FP-412-01   Sr   M110   90％   3.1   14.5
  FP-411-06   Sr   G146   64％
  FP-411-05   Sr   G146   100％   0.46   20.0
  FP-411-04   Ca   G146   64％   3.4   6.4
  FP-411-03   Ca   G146   100％   0.16   9.5
  2004.09.16   Ca   G190   100％   0.21   10.3

Claims (56)

1.一种用于制备藻酸盐凝胶的成套工具，该成套工具包括：
包含可溶的藻酸盐的第一容器；
包含不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的第二容器。
2.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，该成套工具还包括混合器件和/或分配器件。
3.如权利要求2所述的成套工具，其特征在于，所述混合器件是T型连接器。
4.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，该成套工具还包括包含溶剂的附加容器。
5.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，该成套工具还包括药物、肽、蛋白质、细胞、多细胞集合体、组织、可检测的标记物或造影剂。
6.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐的量超过不溶的藻酸盐的量。
7.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐的浓度与不溶的藻酸盐之比为5∶1至1∶5。
8.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，不溶的藻酸盐/胶凝离子的粒度选自下组：＜25μm、25-45μm、45-75μm、75-125μm和＞125μm。
9.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐包含高G含量的藻酸盐。
10.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐的分子量约为5-350kD。
11.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐包含＜25EU/g的内毒素。
12.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐是无菌的。
13.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，可溶的藻酸盐包含以下一种或多种：Na-藻酸盐、K-藻酸盐、PEG-藻酸盐、或NH4-藻酸盐。
14.如权利要求1所述的成套工具，其特征在于，不溶的藻酸盐包含以下一种或多种：钙、锶、钡、铜、锰、铅、钴或镍。
15.一种用于制备凝胶的组合物，该组合物包含速溶的藻酸盐和不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，该组合物还包含药物、肽、蛋白质、可检测的标记物或造影剂。
17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐包含高G含量的藻酸盐。
18.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐的分子量为5-350kD。
19.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐包含＜25EU/g的内毒素。
20.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐和/或不溶的藻酸盐是无菌的。
21.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐包含以下一种或多种：Na-藻酸盐、K-藻酸盐、PEG-藻酸盐、或NH4-藻酸盐。
22.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，不溶的藻酸盐包含以下一种或多种：钙、锶、钡、铜、锰、铅、钴或镍。
23.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐的量超过不溶的藻酸盐的量。
24.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，可溶的藻酸盐的浓度与不溶的藻酸盐的浓度之比为5∶1至1∶5。
25.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，不溶的藻酸盐/胶凝离子的粒度选自下组：＜25μm、25-45μm、45-75μm、75-125μm和＞125μm。
26.一种用于分配自胶凝的藻酸盐分散体的方法，该方法包括：
a)通过混合以下组分形成分散体：i)包含可溶的藻酸盐与不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的溶液，或ii)速溶的藻酸盐、不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒和溶剂，以及
b)分配该分散体，使该分散体形成藻酸盐凝胶基质。
27.一种用于将自胶凝的藻酸盐分散体分配在个体内的方法，该方法包括权利要求26的方法，其中，将分散体分配到个体内。
28.一种使用藻酸盐凝胶作为个体中的组织填充材料的方法，该方法包括按照权利要求27所述将自胶凝的藻酸盐分散体分配在个体内。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，使用藻酸盐凝胶作为组织填充材料，用于治疗膀胱失禁，其中，将所述自胶凝藻酸盐分散体分配到靠近个体的尿道括约肌的粘膜下层，或使用藻酸盐凝胶作为组织填充材料，用于治疗胃食管回流紊乱，其中，将所述自胶凝藻酸盐分散体分配在个体的食道和胃之间的接合点。
30.一种将自胶凝藻酸盐分散体用在个体的血管栓塞过程的方法，该方法包括按照权利要求27将自胶凝藻酸盐分散体分配在个体内，其中，将所述自胶凝藻酸盐分散体分配到个体的血管内。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，血管栓塞过程是在治疗良性或恶性肿瘤时进行的，其中，将所述自胶凝藻酸盐分散体分配到个体的血管内，供给血液至肿瘤。
32.一种使用自胶凝的藻酸盐分散体来防止个体形成术后粘附的方法，该方法包括按照权利要求27所述将自胶凝的藻酸盐分散体分配在个体内，其中，将自胶凝藻酸盐分散体分配在个体的手术部位。
33.一种使用自胶凝的藻酸盐分散体来治疗个体的创伤的方法，该方法包括按照权利要求27所述将自胶凝藻酸盐分散体分配在个体内，其中，将自胶凝藻酸盐分散体分配在个体的创伤部位。
34.一种使用自胶凝藻酸盐分散体来治疗个体的皮肤创伤的方法，该方法包括按照权利要求26所述将自胶凝藻酸盐分散体分配在个体内，其中，将自胶凝藻酸盐分散体分配在个体的创伤部位的皮肤上。
35.一种使用可植入的藻酸盐凝胶的方法，该方法包括按照权利要求26所述分配自胶凝藻酸盐分散体，形成自胶凝的藻酸盐，在形成凝胶后，将可植入的藻酸盐凝胶植入个体。
36.一种制造可植入的器件的方法，该方法包括按照权利要求26所述将自胶凝藻酸盐分散体分配到器件上。
37.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述分散体还包含一种或多种选自下组的组分：药物、肽、蛋白质、细胞、多细胞集合体、组织、可检测的标记物和造影剂。
38.一种藻酸盐凝胶，其厚度大于5mm并具有均匀的藻酸盐基质网状物。
39.如权利要求38所述的藻酸盐凝胶，其特征在于，所述凝胶的厚度大干10mm。
40.如权利要求38所述的藻酸盐凝胶，其特征在于，所述凝胶不含以下一种或多种物质：硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乳酸盐、EDTA或脂质。
41.一种藻酸盐凝胶，其厚度大于5mm且不含以下一种或多种物质：硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乳酸盐、EDTA或脂质。
42.如权利要求41所述的藻酸盐凝胶，其特征在于，所述凝胶的厚度大于10mm。
43.一种可植入的器件，该器件包含均匀的藻酸盐凝胶涂层。
44.如权利要求43所述的可植入的器件，其特征在于，所述器件选自下组：心脏起搏器、导管、可植入的修复假体、外科用螺钉、外科用金属线、组织填充移植物、食道回流抑制性移植物、失禁抑制性移植物、肾回流抑制性移植物、适用于支撑沉积在表面外和/或用藻酸盐基质封装的细胞的容器如固态装置或大胶囊、乳房移植物、颌移植物、颊移植物、胸移植物、臀肌移植物和牙移植物。
45.一种通过按照权利要求27所述分配自胶凝藻酸盐分散体来填充或修复骨关节炎造成的软骨缺陷的方法，其中，所述自胶凝藻酸盐分散体包含软骨细胞。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞是自体的。
47.一种通过按照权利要求27所述分配自胶凝藻酸盐分散体来治疗糖尿病的方法，其中，所述自胶凝的藻酸盐分散体包含胰岛素生成细胞或多细胞集合体。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述胰岛素生成细胞或多细胞集合体是胰岛或者培养的产生胰岛素的细胞系。
49.一种改善胰岛或其他细胞集合体或组织在分离后以及储存和运输期间的存活性的方法，该方法通过在按照权利要求26所述制备的自胶凝藻酸盐分散体中加入所述胰岛或细胞集合体或组织。
50.一种制备不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法，包括以下步骤：
将超纯藻酸钠溶解在水中并加入钠盐；
将胶凝离子盐溶解在水中，并调节pH至中性；
在连续搅拌的条件下混合上述藻酸盐溶液与氯化钙溶液；
收集沉淀的不溶的藻酸盐并用水洗涤，直到电导率降低到与净化的水的电导率相似的水平；
干燥洗涤后的不溶的藻酸盐；以及
由干的不溶的藻酸盐制成颗粒。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，胶凝离子是钙或锶。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
将超纯藻酸钠溶解在水中并加入碳酸钠；
将脱水的氯化钙溶解在水中，用硝酸调节pH至中性；
在连续搅拌的条件下混合上述藻酸盐溶液与氯化钙溶液；
收集沉淀的藻酸钙并用水洗涤，直到电导率降低到与净化的水的电导率相似的水平；
干燥洗涤后的藻酸钙；以及
将干的藻酸钙磨碎成颗粒。
53.一种超纯的不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒，它是采用权利要求52的方法制备的。
54.一种超纯的不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒，其含有＜25EU/g的内毒素。
55.如权利要求54所述的超纯的不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒，其特征在于，藻酸盐充满了胶凝离子。
56.如权利要求54所述的超纯的不溶的藻酸盐/胶凝离子颗粒，其特征在于，胶凝离子是钙或锶。
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