CN101023331A - 生物细胞和其它对象的动态化学成像 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动态化学成像方法，包括细胞成像方法。所述方法包括用基本单色的光照射细胞的至少一部分并在多个离散时间评估从所述被照射部分散射的拉曼位移光。可以在每个所述离散时间在多个拉曼位移(RS)值评估所述拉曼位移光，并且在每个所述离散时间可以选择RS值以表征预选组分。如此得到图像的拉曼光谱特征的多变量分析可得到视场中组分的位置和化学身份。这种信息可以与从视场得到的其它光谱数据(例如可见显微图像)合并或重叠。

Description

生物细胞和其它对象的动态化学成像
技术领域
一般地，本发明涉及的领域是拉曼光谱学和生物细胞的显微成像。一般地，本发明还涉及动态化学成像。
背景技术
了解，特别是在分子尺度上了解，在生物细胞内部以及生物细胞之间正在发生什么，使得人们可以知晓细胞的行为并以期望的方式影响它们的行为。例如，大多数药物基于它们对细胞的影响而发挥它们的药学作用。但是，一直以来都难以在生物化学相关尺度上了解药物对单个细胞或一小群细胞的影响。相反，已经观察到药物对组织或整个有机体的宏观影响，并且需要大量实验和有根据的推测来了解药物的作用的生物化学基础。一个重要需求在于更好地观察细胞相互之间和细胞与化学品之间的相互作用以及发生于它们环境中的现象(例如温度或流体剪切应力)的方法。本发明通过在与了解单个细胞和它们的亚细胞组分的行为和特征相关的尺度上提供动态成像化学和生物系统的方法满足了这种需求。
Jian Ling和同事已经描述了用于从细胞获得有限的拉曼光谱信息的显微系统。参见例如Ling et al.，2002，Appl.Optics 41(28)：6006-6017；U.S.临时申请60/189123，2000年3月14日提交；U.S.非临时申请09/804774；和U.S.非临时申请10/750603。所述Applied Optics论文描述了据称被用于获得显示乳腺癌细胞中的紫杉醇(paclitaxel)分布的图像的单变量方法。所述方法包括合并细胞的光学图像和由以下方法获得的细胞图像：从1000cm-1处(据称在该拉曼位移(RS)值下，紫杉醇显示峰)并合拉曼散射的和荧光发射的辐射减去1080cm-1处(据称在该拉曼位移(RS)值下，由紫杉醇导致的散射是可忽略的)并合拉曼散射的和荧光发射的辐射。
不清楚Ling等人的数据是否支持他们的观点，即他们在乳腺癌细胞中观察紫杉醇。例如，他们获得了粉末形式的紫杉醇的拉曼光谱(在所述论文中的图3，所述专利申请中的图1)并证明1002cm-1处的散射远远大于1080cm-1处的散射。紫杉醇+乙醇+CREMAPHOR(RTM)+PBS的拉曼光谱(在所述论文中的图4)据称显示：混合物中保留了1002cm-1处的紫杉醇拉曼峰(但是移到1000cm-1)并且1080cm-1处有很少的或没有紫杉醇的RS。所述图显示了1000cm-1处的小峰以及1080cm-1处的可能的宽峰或肩峰，但是图中没有数据用来确定紫杉醇对1080cm-1特征做了什么贡献(如果有的话)。对于荧光发射，也未校正该图。
即使假设Ling等人能够在所述论文的图4中识别溶液中紫杉醇，但是却仍然不清楚当紫杉醇与细胞或细胞的组分例如微管缔合时紫杉醇的拉曼光谱是什么样子。简言之，并不清楚Ling等人在用紫杉醇处理的细胞中观察的拉曼信号能够实际与紫杉醇的存在进行关联。
比较所述拉曼图像(所述Ling论文的图8中的中间柱状图)，什么东西被成像仍然是不清楚的，尽管清楚地显示(第一行)所有被成像的东西中的至少一些在用紫杉醇处理所述细胞之前就存在。不能确定是否微管结合的紫杉醇将预期会如图8的图片中拉曼活性实体(entities)显示的那样结块。除了有丝分裂期间之外，微管通常基本上广泛分布于整个细胞中。
分析据称由紫杉醇引起的拉曼散射的单变量方法，即使它在据称存在于Ling等人研究的混合物中的情形下(即，据称对应于紫杉醇的单拉曼强峰和特定的消卷积方案)是正确的，它也可能被限于在他们的实验系统中的特定条件下使用。这样的单变量分析不太可能广泛应用。例如，它对于用于分析比Ling等人描述的系统据称显示的拉曼光谱显示更复杂拉曼光谱的系统就是不合适的方法。
Ling等人使用的光学系统的另一个缺点是它使用旋转介电带通滤光器(rotating dielectric bandpass filter)系统来选择用于分析的拉曼位移值。这种系统需要物理旋转以分析不同的拉曼位移值，使得不能快速分析多个拉曼位移值。此外，系统的旋转使图像移位，需要重新排列拉曼和光学图像。
Sharonov等人(1994，Analytica Chimica Acta 290：40-47)描述了一种细胞成像系统，该系统基于来自细胞和/或细胞环境中的化合物的荧光发射的评估。基于荧光检测的成像系统的一个重要缺点是此类系统展示出相当低的光谱分辨率，这是由于大部分(即使不是全部)荧光发射的宽谱宽。另一个缺点是所关注的很多分子和细胞组分并不发射荧光。除非被标记(一种可以改变所述分子或组分的行为和特征的方法)，否则此类分子和组分不能被荧光成像。此外，活和死细胞通常显示出强烈的荧光背景发射，而这种背景发射可能妨碍所关注目标的荧光观察。因为大部分荧光发射对于发射辐射的分子物质并不是特异的，所以此类背景可能使得对荧光的有意义的解读复杂化或不能解读。
美国专利5784162公开了在含有细胞或组织的环境中三维定量检测组分的方法。该专利公开了光谱成像方法。所述方法包括合并光谱和成像数据。在荧光显微术的上下文中描述了光谱分离技术。所述系统包括使用具有用于调制光学干涉的物理可旋转元件的光路。所述系统使用静态检测器，所述静态检测器被宣称为显示与样品被成像区域的一一对应。该专利描述了光谱成像，而不是化学成像。光谱成像分辨率低并且不能以光谱方式分辨单个分子物质。在该专利中描述的这种技术适于分析大信号，例如荧光发射，但是不适于分析弱信号，例如拉曼散射的辐射。
美国专利6070583公开了二维和三维荧光和拉曼成像方法。所述方法基于时间分辨在围绕被照射点的多个检测点评估的非弹性散射的辐射以确定散射体与每一个检测点的距离。从这些数据可以构建被照射的系统的二维和三维图像。该专利公开了散射的光的拉曼光谱特征可以用于表征散射体的化学身份。该专利没有公开所述方法是否可以用于检测小于组织损伤的散射体。此外，该专利没有公开将空间分辨数据与光学成像数据合并，因为该专利涉及宏观组织的平面断层分析。
化学成像是本领域已知的。用于化学成像的仪器的一个例子教导于授予Treado等人的美国专利6002476中，名称为“ChemicalImaging System”。美国专利6002476尤其教导了使用拉曼化学成像以分析静态样品，例如评估特定的组织样品是否对应于正常组织或乳腺癌组织。在本领域中存在用于评估静态样品的其它化学成像系统。
与现有技术相反，本发明使用化学成像来评估并观察非静态样品(即随时间发生变化的样品)。本发明尤其是可以用于检测在观察周期期间样品中发生的动态变化。
发明内容
本发明涉及一种细胞成像方法。所述方法包括用基本单色的光照射细胞的至少一部分并在多个离散时间评估从被照射部分散射的拉曼位移光。可以在各个离散时间在多个拉曼位移(RS)值评估拉曼位移光，并且在各个离散时间可以选择RS值以表征第一预选组分(例如药物)。接下来可以是表征第二预选组分的RS值，所述第二预选组分例如是药物的代谢产物或已知在细胞用化合物处理之前和之后显示不同的拉曼光谱的细胞成分(cellular constituent)。
本发明还涉及可以用于实施本文所描述的方法的系统和方法，而与被成像的样品是否含有细胞(活的，休眠的或死的细胞)无关。所述系统和方法使用样品的一系列的至少第一和第二顺序化学图像，可用于检测在第一时间间隔和第二时间间隔之间在样品中发生的动态变化，其中第一化学图像对应于在第一时间间隔期间样品的图像而第二化学图像对应于在第一时间间隔之后样品在第二时间间隔的图像。
在第一时间间隔期间：(i)用多个光子照射样品并且光子被样品散射或发射；(ii)使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段(wavelength band)散射的或发射的光子；和(iii)此后检测元件的二维阵列被额外使用一次或多次同时检测从样品上或样品内的不同位置在一个或更多预定波段(其可以与第一波段相同或不同)散射的或发射的光子。然后，合并在第一时间间隔期间检测元件的二维阵列的输出以产生样品的第一化学图像。
在第二时间间隔期间：(i)用多个光子照射样品并且光子被样品散射或发射；(ii)使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和(iii)此后检测元件的二维阵列被额外使用一次或多次同时检测从样品上或样品内的不同位置在一个或更多其它预定波段散射的或发射的光子。然后，合并在第二时间间隔期间检测元件的二维阵列的输出以产生样品的第二化学图像。
基于第一和第二化学图像之间的一个或多个差异，检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。
本发明使得可以以全空间信息快速观察样品，并且允许监控样品中自然进行或发生的(即在平衡条件下)进展和变化以及通过外界方式(例如施加到样品的一种或多种外部场或力)产生非平衡条件而额外强制或强加的那些。在某些实施方案中，所述外界方式可以施加到样品内的特定位置(而不是整个样品)。
附图说明
图1示意性地示出了根据本发明一个实施方案的仪器。
图2示意性地示出了根据本发明另一个实施方案的仪器。
具体实施方式
化学系统的拉曼光谱分析可以产生反应系统中存在的特定化学物质的信息。拉曼化学成像可以进一步指示化学物质在系统中的物理位置、物理或化学信息(例如物质的晶体状态和关于存在物质的环境的信息)和关于物质在系统中或在系统中特定位置的数量或浓度的信息。
可以在化学系统中评估药物(或具有一个或多个可区分拉曼光谱特征的任何其它化合物)，所述化学系统包括活细胞或死细胞，并受限于系统拉曼光谱分析的一般限制(例如，照射系统的相关部分以及从这些部分收集拉曼散射的光的能力)。因为单独的细胞在拉曼光谱中的很多用于照射样品的波长下或在很多发射被散射的辐射的波长下通常并不是不透光的，所以一般可以从单独细胞的全部体积得到拉曼光谱数据和化学图像(即通过在所述体积内的或包括所述体积的多个焦平面评估所述细胞的所述体积)。这提供了当细胞平放于用于拉曼检测的底物上时所有化学品或药物在整个细胞区域的投影。因此，应该可以在单独细胞的整个体积检测拉曼活性化合物。
可以获得单独的细胞的拉曼光谱数据或从整个三维细胞物质得到拉曼光谱数据，受限于拉曼光谱分析的一般限制。对于单个细胞，在细胞内使用不同的聚焦深度重复实施拉曼化学成像提供了在整个细胞体积内拉曼化学图像的此类投影的平面剖面。这些化学剖面显示精细的变化，可以对其进行汇集和加工以得到药物在细胞中的三维图像。这种立体成像取决于对每个‘化学’剖面(即每个焦平面)都精确地得到清晰和精确的药物化学图像，这对于这种全立体成像是至关重要的。因此对于立体成像来说，得到当细胞平放于底物上时的细胞的单层、剖面或二维投影的精确化学图像是重要的。
本文所描述的方法适合于基本上任何类型细胞的化学成像，包括一个或多个任何真核细胞或原核细胞(或甚至两种或更多种细胞类型的混合样品)。举例来说，合适的细胞包括如下的细胞：人，非人动物，农业上重要的植物(例如农作物和杂草)或其它植物，真菌，原生生物，真细菌，太古细菌和支原体。使用这些方法评估的细胞可以从样品得到并且远程成像，任选地在将细胞保持于培养物中、用固定剂处理细胞、用药物处理细胞、冷冻细胞或这些方式组合处理之后。或者，当细胞的位置和本文所描述的设备的设计相配合时，可以原位成像所述细胞，例如在人组织中，在目标表面，或在允许对其内部至少一部分进行拉曼光谱分析的三维物体的内部。
影响大多数包含活细胞的生物系统(以及其它系统)的拉曼光谱分析的复杂性在于活的和死的细胞通常含有当使用用于拉曼分析的辐射照射时强烈发荧光的组分。因为荧光发射的谱宽通常远宽于单个拉曼特征的谱宽并且荧光发射的强度通常大于拉曼散射的辐射的强度，其掩盖了拉曼信号使得难以从样品辨别拉曼和荧光辐射，并且为了做到这一点可能需要使用光谱处理技术。
为了从此类背景和细胞中的其它化学信号分离所述弱拉曼信号，需要特殊的技术和分析。Ling等人，在本文中提及的AppliedOptics论文中，声称使用药物的单一拉曼峰以成像其在细胞中的位置，这被称为单变量分析。申请人已发现另一种更优异的方法是使用分析物拉曼光谱的多个部分以收集化学图像和使用分析物(例如药物)的很多拉曼峰以及精细拉曼特征来确定其存在和在细胞环境中的位置。这种方法称为多变量分析。因为需要从相对强的荧光背景分离单峰并且在空间上确定该峰出现的位置，因此单变量分析是存在更多问题的。使用拉曼光谱标记图的多个特征，所述标记图对应于药物的多个峰和它们的相对强度，使得可以在视场中的拉曼散射和荧光实体之间出现更有效的差别，从而提供从背景和可能出现的其它峰辨别所述药物的显著更强的能力。单变量方法的使用需要很多假设以从宽荧光背景以及从系统中的其它化学品和拉曼峰中消卷积单峰。通常由于细胞中的化学相互作用造成的药物的这种单拉曼峰的任何变化都成为问题。
另一个非常重要的问题在于当药物与细胞或细胞组分结合时，所述药物化合物内通过拉曼检测的一些振动通常将发生位移，这反应了药物在细胞内相互作用和结合的类型。能够检测这些与成像模式无关的位移对于使用这些拉曼峰值来得到药物在细胞中的进一步详细信息来说是关键的。在一个波长使用单个滤光器妨碍了观察或成像此类重要变化。
细胞尺度拉曼成像系统
在本申请的上下文中，拉曼成像系统(RIS)基本上可以是装配有实施本文所描述的分析所需的仪器的任何拉曼显微镜。举例来说，所述RIS基本上可以是任何授予Treado的美国专利6002476中描述的系统、ChemImage的FALCON(TM)装置或类似装置。本文描述了另一种合适的装置和系统。
对于细胞内分析物的分析，取决于分析中所需的细节程度(即目标的尺寸或目标的各部分的期望分辨率)，所述装置应该装配有允许目测细胞或亚细胞结构的放大光学系统。在表征分析物的一个或多个拉曼位移(RS)值下获得了期望的目标(例如细胞或细胞的一部分)的拉曼光谱数据帧(frame)。举例来说，所述分析物可以是拉曼活性药物分子或者细胞源的拉曼活性分子，其是已知的或预期将受药物分子影响。在视场的焦平面中可以评估拉曼活性组分的存在、大致浓度或数量以及位置。拉曼光谱数据可以与通过其它光谱方法例如可见光反射显微术得到的图像数据帧合并(例如重叠)。所述其它光谱方法可以(并且优选)使用和拉曼光谱分析相同的光路，或使用用于收集拉曼散射的光的光路的同一部分(穿过所述样品)(即使使用各自的检测器来评估拉曼散射的和其它的辐射)。
一旦得到拉曼光谱数据帧，就可以在迟一些的时间点得到拉曼光谱数据的第二帧，所述两帧之间的间隔不少于从目标得到拉曼光谱(以及任选地得到其它光谱)并记录所述光谱花费的时间。如果需要，帧之间的时间可以比那个时间间隔长。例如，在其中拉曼活性目标的变化只有在不少于数秒的时间尺度上才可观测的系统中，每秒获得很多拉曼光谱数据帧可能几乎没有益处。因此，数据采集所需的时间帧(time frame)可以决定哪个生物或生化系统适合于用特定RIS进行分析。例如，RIS可能不适合于评估其中期望观察的变化的时间尺度明显(例如几个数量级)快于所述RIS的数据采集速率的过程。
因为本文所描述的RIS可以非常快速地在整个视场收集拉曼光谱数据，因此其可以为具有约数毫秒、数十毫米、数百毫秒或更长特征时间的过程收集有意义的数据。几乎没有药物显示以短于上述时间段的时限对细胞施加它们的生理作用。因此，本文所描述的RIS适合用于收集关于拉曼活性组分例如药物和它们的代谢物的细胞和亚细胞位置的拉曼光谱信息。因为这种信息可以以连续数据帧快速收集并且这些数据帧可以存储和重现，所以所述方法可用于检查其中拉曼活性组分随时间发生变化的过程。这些RIS克服了例如Ling等人的那些系统的缺点，因为它们不需要操纵移动部件并且能够在适合于分析高速过程的时间帧中在多个RS值得到拉曼光谱数据。因此，使用Ling等人的论文作为例子，本文所描述的这种类型的RIS能够收集对应于每一帧中紫杉醇的更宽范围的拉曼光谱数据，使得在紫杉醇和恰好1000cm-1处显示拉曼散射的其它细胞组分(例如，参见Ling论文中紫杉醇预处理的细胞对照物)之间的差别更大。
本文所描述的动态化学成像方法可以与在其它Chem Image专利文献(例如2004年6月30日提交的美国临时专利申请(序列号60/584719和60/584718)，关于多模式和多点分析系统)中公开的拉曼成像策略一起使用。在那些其它申请中描述的光谱分离和荧光校正方法可同等地适用于本文所描述的动态化学成像方法。
可以使用本文所描述的动态化学成像方法的过程的一个例子是评估拉曼活性颗粒(例如特定类型的细胞或聚合物球)在环境中的运动，所述环境可包括拉曼可区分的液体、气体或其它颗粒(例如一种或多种其它类型的细胞或其它种类的聚合物球)。所述动态化学成像方法也可用于评估其中目标的形状、尺寸或拉曼特征在多个数据采集帧期间发生变化的过程。举例来说，此类方法可以用于评估晶体生长、分子的颗粒或区域从一种拉曼活性形式到另一种拉曼活性形式或到拉曼非活性形式(反之亦然)的变化。
所述动态化学成像方法可以用于在评估所述颗粒的波长下跟踪尺寸接近所使用光学系统分辨率极限的单个拉曼活性颗粒。甚至在其中单个拉曼活性颗粒不能相互区分开的系统中，包含此类颗粒的区域的拉曼光谱特征也可以指示(至少平均地)这些颗粒正在发生的情况。以这种方式，例如，可以观察拉曼活性病毒颗粒的行为。
除了随时间在焦平面中获得拉曼光谱数据以外，通过评估多个相邻的或隔开的焦平面(例如，对应于通过样品的多个平行的相邻的‘切片’，对应于多个平行的规则隔开的‘切片’或对应于多个非平行的焦平面)可以得到第四维度的分析。得到每一组所述多个焦平面的拉曼光谱数据所需的时间可以限制与整个样品相应的数据采集速率。以这种方式，例如，通过重复评估来自含有细胞的体积的多个层叠‘切片’的拉曼散射可以以三维方式评估细胞中拉曼活性药物(或其它拉曼活性物质)的存在、位置和大致浓度或数量。
拉曼数据采集的速度主要受限于拉曼散射的辐射的数量，而拉曼散射的辐射的数量通常是很小的。拉曼散射检测系统的一个重要部分是其对偏振(polarization)敏感。也就是说，所述系统可以被设置使得它只检测具有一个或多个特定偏振的被散射光。因为被样品散射的拉曼散射的光不是在一个方向偏振化(其包括显示所有偏振的光子)，所以在检测阶段可能损失大约一半的光强度。增加数据采集速度的一种方法是在多个偏振方向中检测光(例如，通过检测具有正交偏振的散射的光可以使速度加倍)。例如，这可以用两个CCD照相机实现，两个CCD照相机中的每一个都检测独立的偏振通道。这两个照相机可以同时运行，但是却是在按时间顺序交错的模式下，从而当一个照相机正部分处于其数据收集周期中(例如，大约半程)时，另一个照相机开始其数据收集周期。此外，因为被有序细胞(例如，在诸如膜、肌肉或神经元组织的组织中以规定方式排列的细胞)散射的拉曼位移光可以显示显著地各向异性的偏振，所以评估具有不同方向或偏振度的散射的光也可以得到关于细胞的有用信息。可以容易地适用于分析拉曼散射的光的各向异性偏振的光学组件的例子描述于Tsuboi 2002，J.Biomed.Opt.7(3)：435-441。此外，因为显微视场中存在的细胞、药物、亚细胞组分、底物和其它组分可以显示各向异性偏振，所以所述RIS系统在这些偏振之中的辨析能力可以增加可从视场的拉曼分析得到的信息。
使用本文所描述的拉曼化学成像装置(例如ChemImage的FALCON(TM)系统)的一些优点如下面所述。
因为使用固态检测器(即没有移动的部件)，所以RIS可以在多个波长并以高空间分辨率快速评估被散射的辐射的强度(即，不操纵移动的部件而可以在RS值之间快速切换)，所述RIS在同一时间(即，以平行方式)在整个视场得到这样的数据，所述视场包括任意放大倍数下完整的一个或多个细胞，所述RIS可以用于从细胞和亚细胞区域收集拉曼光谱信息并且被收集的信息可以用于i)校正背景荧光和ii)以高特异性在所分析的视场中识别化学物质。和Ling等人描述的系统不同，本文所描述的RIS可以在多个RS值收集拉曼光谱信息，使得可以更好地区别具有类似结构的化学物质并使得可以更好地校正荧光背景。商业软件包，例如ChemImage Corporation的专有软件CHEMIMAGE EXPERT(TM)，可用于对视场中的差不多每一个像素进行拉曼活性物质的多变量分析。本文所描述的RIS的速度还允许以实际用于分析细胞组成的时间尺度对细胞和细胞区域进行拉曼光谱扫描。
例如，使用ChemImage FALCON(TM)仪器，只用一秒钟就可以得到在单一RS值下的拉曼图像。为了得到更好的空间分辨率，优选使用更长的时间。例如，10-30秒每帧，或甚至60秒每帧，得到适于细胞分析的空间分辨率。可以在时间和分辨率(空间和光谱分辨率)进行折衷。使用的确切参数取决于使用的设备和所需的空间和光谱分辨率。设备组件的改进将增加可能采集数据时的速率。例如，目前，合适的照相机能够以约50毫秒每帧的速率在单一RS值收集拉曼散射信息。其它系统组件的改进最终可以使得数据采集速率接近该速度。数据采集速率还取决于被成像系统的复杂性。举例来说，存在这样的情况，其中能够以0.1秒每帧的速率对局部的内源性分子进行拉曼成像。例子将包括岩石中的碳质材料(陨石中的钻石状碳)、无机基体中的碳酸盐、组织中的磷酸盐(钙化作用)和赋形剂中的高浓度药物化合物。
可以以三维方式采集数据的速度取决于单帧的数据采集速率和改变所用仪器的焦平面所需时间。例如，可以使用本文所描述的设备以2秒每帧的采集时间来得到细胞的三维的单一RS图像(通过改变细胞和显微镜物镜之间的距离)。在z方向在13个位置移动所述焦平面使得总采集时间为大约30秒(包括用于帧读出的一些时间)。在一些实施方案中，在大约半小时内对于单一成像体积已经得到多达180帧的数据。这可能比成像所述体积需要的数据量要多，但却说明了本文所描述的系统的一些能力。因为细胞系统中的过程的特征时间(即，其中系统中的变化可以以有意义的方式相互关联的时间段)变化(一些的特征时间为秒数量级，一些为小时、天或更长时间的数量级)，所以对特定RIS系统的要求取决于被观察的细胞特征。
本文所描述的RIS的速度与较慢RIS相比，使得可以对以更大速率移动的目标进行拉曼化学成像。因此，可以分析离散颗粒的移动，即使这些离散颗粒与其它拉曼特征(Raman-distinct)颗粒混合在一起。例如，可以近似实时地跟踪细胞内拉曼活性剂的移动。
因为本文所描述的RIS可以用于评估目标的其它光谱特征(例如，光学显微形态，荧光发射等)，所以可以容易地合并拉曼数据和其它光谱数据从而以多种信息方式呈现合并的信息。举例来说，指示拉曼活性剂在视场中特定位置出现的拉曼数据可以与视场中细胞的可见显微图像合并以指示在细胞各个部分中所述试剂的位置和数量(相当或绝对数量)。此外，因为所述RIS可以几乎同时地在多个RS值下评估拉曼数据，所以可以近似实时地评估一种拉曼活性剂到另一种拉曼活性剂的转化(例如，药物到该药物代谢物的转化)。本文所描述的RIS能够实现快速和大规模的数据采集，这使得能够进行多变量分析。
虽然可以如上述的那样实施所述方法，但是下面所述各项是改进所述系统性能的一些方式。
能够得到拉曼化学图像(RCI)数据的“帧”的快速性决定了所述系统的响应速率。降低得到数据帧所需时间的任何措施都将增加所述系统的响应速率(即每单位时间的帧数)。因此，测量系统响应时间或采集拉曼数据(或与所述帧相应的其它数据，如果所述其它数据限制数据采集速率的话)的速率或其两者的缩短将改进系统的响应速率。在更大数值的RS值下收集RCI数据，拉曼数据采集所需时间越长。因此，选择特别地相应于所关注目标(例如药物)并且不相应于被成像目标所处环境(例如其它细胞成分)的RS值可以降低必须收集数据的RS值的数目并改进响应速率。类似地，缩短检测器收集拉曼散射的辐射的时间段将改进响应速率(至少要到达可以区分信号和噪声的程度)。
可以通过沿着不同于收集拉曼散射光的轴的轴照射所述目标得到背景噪声。
可以通过许多方法增强拉曼散射的光的强度。例如，与用较长波长的光照射目标而散射的光相比，用较短波长的光照射目标将得到更强的拉曼散射的光。但是，更短波长的光产生更多的荧光背景，所述荧光背景掩盖或干扰(swamp)其它来自样品的非弹性信号例如拉曼信号。此外，使用拉曼增强性底物来承载目标(例如胶体银或金底物，以及其它已知的拉曼增强性表面)可以改进拉曼信号的强度。例如，可以在这样的底物上培养细胞，或将细胞沉积在包括这样的材料的底物上。
对于任何光学系统，都可以通过减少光学损失和增加检测器灵敏度改进信号强度，因此，本发明描述的RIS基本上可以与目前已有的或今后开发的任何拉曼相容性光学系统和检测器联用。使用多变量统计图像分析(“化学计量学”)将增加所述ChemImage RIS技术的灵敏度。优选的实施方案包括使用下述的一项或多项：i)关联分析以改进图像像素内药物目标信噪比(SNR)；ii)主成分分析(PCA)，作为噪声降低技术；和iii)渐进因子分析，作为检测拉曼光谱中动态变化的手段。
可以使用化学成像标准叠加方法(Chemical Imaging StandardAddition Method，描述于Chem Image的美国专利6734962中，涉及NIR显微术)作为细胞浓缩物中定位和半定量检测药物的手段。
可以使用Radiometric SNR检测器性能型号(performancemodels)以检测细胞内药物的浓度，而不用使用内标标准物。
动态化学成像系统和方法
在本部分中描述的方法可以使用用于检测在第一时间间隔和第二时间间隔之间在样品中发生的动态变化的系统或方法使用样品的一系列的至少第一和第二顺序化学图像来进行。所述第一化学图像对应于在第一时间间隔期间样品的图像。所述第二化学图像对应于在第一时间间隔之后样品在第二时间间隔的图像。
在所述第一时间间隔期间：(i)用多个光子照射所述样品从而产生被所述样品散射的或发射的光子；(ii)然后使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和(iii)此后所述检测元件的二维阵列被额外使用一次或多次同时检测从样品上或样品内的不同位置在一个或更多其它预定波段散射的或发射的光子。然后，在第一时间间隔期间所述检测元件的二维阵列的输出被合并以产生所述样品的第一化学图像。
在所述第二时间间隔期间：(i)用多个光子照射所述样品从而产生被所述样品散射的或发射的光子；(ii)然后使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和(iii)此后所述检测元件的二维阵列被额外使用一次或多次同时检测从样品上或样品内的不同位置在一个或更多其它预定波段散射的或发射的光子。然后，在第二时间间隔期间所述检测元件的二维阵列的输出被合并以产生所述样品的第二化学图像。
基于所述第一和第二化学图像之间的一个或多个差异，检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。
本发明使得可以以全空间信息快速观察所述样品，并且允许监控样品中自然进行或发生的(即在平衡条件下)进展和变化以及通过外界方式(例如施加到样品的一种或多种外部场或力)产生非平衡条件而额外强制或强加的那些。在某些实施方案中，所述外界方式可以施加到样品内的特定位置(而不是整个样品)。
图1示意性地示出了根据本发明一个实施方案的仪器。图1示出的仪器可以在不同放大倍数为微光成像提供高光通量。参见图1，将样品100放置在底物105上。底物105可以是任何常规显微载玻片或者用于接收以及任选地固定样品100的其它器具。设置光源110以向样品100提供入射光。光源110可包括任何常规光子源，包括激光器、LED和其它IR或近IR装置。也可以选择光源110以提供样品的迅衰照射。在一个实施方案中，所述光源的带宽为约15-25cm-1。
仍旧参见图1，应该注意，设置光源110以相对于样品100以一定的角度提供入射光，其与正交于样品100发射(shining)的光相对。换句话说，用于照射所述样品的辐射不需要经过常规显微镜(或显宏镜)的光学系统；相反地，它可以以倾斜角度从样品100上面或下面照射所述样品。光子束112被反光镜115接收并反射，穿过透镜120。透镜120可以任选地被用于将所述光聚焦在样品100上。或者，可以不需要反光镜115而将光子束112引向样品100。
到达样品100的光束112中的众多光子照射样品并且被样品散射或吸收，这可造成后续的在不同波长的发射(发光)。如本领域技术人员已知的那样，术语“发光”包括各种使用其它名称描述的光学过程。这些包括：荧光、磷光、光致发光、电致发光、化学发光、声致发光、热致发光和甚至升频转换。被散射的光子示意性地表示为光束116和118，而被镜反射的光子示意性地表示为光束114。发光发射的光子也表示为光束118。设置光学透镜125以接收光子束116和118。光学透镜125可以用于聚集并聚焦所接收的光子束。这包括聚集并聚焦偏振的和非偏振的光子。一般而言，样品尺寸决定聚光光学透镜125的选择。例如，可以使用显微镜透镜来分析亚微米至微米的样本。对于更大的样品，可以使用微距透镜(macro lenses)。光学透镜125(以及透镜120)可包括具有更大数值孔径的简单的低分辨率/像差的透镜，从而增加系统的光通量和效率。设置反光镜130以将发射的或散射的光子束118引向可调谐滤光器140。应该指出的是，反光镜130的放置是任选的，并且在其中可调谐滤光器被置于样品100上方的结构中，反光镜130可能是非必需的。
激光拒波滤光器135可以被置于可调谐滤光器140之前以过滤出光束116表示的散射的照射光并优化系统的性能。换句话说，拒波滤光器135能够在照射波长以光谱方式过滤光子。
可以使用常规可调谐滤光器(包括光电的、机械的或其它可调谐滤光器)以进一步说明本公开的原理。合适的可调谐滤光器的例子包括液晶可调谐滤光器(“LCTF”)或可以使用声-光可调谐滤光器(“AOTF”)来进一步说明本公开的原理。取决于控制器(未在图1中示出)加载在所述装置上的控制信号，所述光电滤光器(或其它可调谐滤光器)允许特定波长或波长范围的光作为图像通过。可以通过可调谐滤光器140的波长范围可以为200纳米(紫外)到2000纳米(即，远红外)。波长的选择取决于期望的光学区域和/或被分析样品的性质。
图像传感器145可以是数字装置，例如二维图像焦平面阵列(“FPA”)或CCD或CMOS传感器。用于表征所关注样品的光学区域决定FPA检测器的选择。例如，硅电荷耦合装置(“CCD”)检测元件的二维阵列可以与可见光波长荧光和拉曼光谱一起使用，而砷化镓(GaAs)和砷化铟镓(GaInAs)FPA检测器可以用于在近红外波长下的图像分析。此类装置的选择取决于被分析的样品的类型。在一个实施方案中，用于形成图像传感器145的检测元件的二维阵列中的每一个检测元件都用于检测从样品上或样品内的不同空间位置散射的或发射的光子。在一个实施方案中，图像传感器145通过可调谐滤光器140的处理产生样品的整个视图的数字图像。
图2示意性地示出了根据本发明另一个实施方案的仪器。更加具体地，图2示意性地示出在不同放大倍数用于微光成像的高光通量结构。聚光装置与图1中所示的类似，但是却从样品100的下面照射。
应注意，在图1和2中，样品100相对于光束116和118均以倾斜角度被照射。具体参见图2，光子束120和样品100的平面轴限定了倾斜角度。已经发现，通过倾斜照射，开发出所谓的“暗视场拉曼成像”。与常规明视场拉曼结构不同，暗视场拉曼成像使激发辐射的输送与图像捕获光学器件去偶。因此，入射辐射的内散射和衰减被最小化以改进信噪比(S/N)。此外，在光学系统之外的光源位置进一步使得可以使用更低的成本、更低功率的照射源以及使得可以更简单地、更便宜地将几个照射源集成到系统中。这种结构的使用并不限于拉曼和发光成像，其可成功用于例如常规光谱法。
在图1和2所示的每一个实施方案中，可以将计算机或处理器(未在图中示出)连接到光学装置并用于控制光学装置，所述光学装置包括光源(110)、透镜(120，125，135)、反光镜(115，130)和可调谐滤光器(140)。所述计算机也可以连接到图像传感器145并用于从图像传感器145的输出产生“化学图像”。在一个实施方案中，每个化学图像都是从多个“帧”形成的所述样品的空间精确波长分辨的图像；其中每一帧都具有多个空间维数并且由特定波长(或波数)的光子或由特定波段(或波数段)中的光子产生，所述光子在样品100上或样品100内从不同空间位置由图像传感器145同时收集。在每一个化学图像中，可以合并多个帧以形成跨越整个所关注波长(波数)的完整图像。计算机产生的化学图像可以进一步通过计算机进行分析和/或显示给使用者。
本发明使用例如示于图1和2中的那些仪器来使用样品100的一系列的至少第一和第二顺序化学图像以检测在第一时间间隔和第二后续时间间隔之间在样品100中发生的动态变化。在所述第一时间间隔期间：(i)用来自光源110的光子照射样品100从而产生被样品100散射的或发射的光子；(ii)然后使用图像传感器145同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段(通过可调谐滤光器140选择)散射的或发射的光子；和(iii)对于一个或多个其它预定波段(每一个都使用可调谐滤光器140顺序选择)的每一个波段，然后使用图像传感器145同时检测从样品上或样品内的不同位置散射的或发射的光子。然后，检测器145的输出(对于在第一时间间隔期间通过可调谐滤光器140选择的每一个波长或波段)通过计算机(未在图中示出)被合并以产生所述样品的第一化学图像。
在所述第二后续时间间隔期间：(i)用来自光源110的光子照射样品100从而产生被样品100散射的或发射的光子；(ii)然后使用图像传感器145同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段(通过可调谐滤光器140选择)散射的或发射的光子；和(iii)对于一个或多个其它预定波段(每一个都使用可调谐滤光器140顺序选择)的每一个波段，然后使用图像传感器145同时检测从样品上或样品内的不同位置散射的或发射的光子。然后，检测器145的输出(对于在第一时间间隔期间通过可调谐滤光器140选择的每一个波长或波段)通过计算机被合并以产生所述样品的第二化学图像。
基于所述第一和第二化学图像之间的一个或多个差异，检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。具有或不具有物理图像的化学图像的计算机分析可用于动态变化的检测(或增强检测)。所述动态变化也可以通过使用者观察所述化学图像的显示进行检测。
在各种实施方案中，快速顺序得到一系列的很多序列的化学图像以产生样品的“电影”。例如，为了基本实时地检测样品中的动态变化，可以得到所述样品每秒多达100幅化学图像。在一些实施方案中，序列中化学图像的时间分辨率可以细达1毫秒，即系统将每一毫秒产生一幅样品的化学图像。也可以选择其它的时间分辨率，包括例如一种折合为化学图像以相邻图像之间多至15分钟间隔的时间分辨率。当使用本发明来监控特定的过程或反应时，所选的时间分辨率应足以随时间检测样品中发生的所关注的动态变化。
本发明因此使得可以以全空间信息快速观察所述样品100，并且允许监控样品100中自然进行或发生的(即在平衡条件下)进展和变化以及通过外界方式(例如施加到样品的一种或多种外部场或力)产生非平衡条件而额外强制或强加的那些。在某些实施方案中，所述外界方式被施加到样品100内的特定位置(而不是整个样品)。使用本发明的动态化学成像技术可以分析和观察的样品的例子包括随时间发生变化的生物样品或微流路。这些变化可包括移位、化学相互作用、化学状态的变化、相变、生长、收缩、化学分解、化学代谢和物理应变。本领域技术人员将认识到可用于本发明的样品/变化的各种其它例子，并且所述样品/变化的各种其它例子同样在本发明的范围之内。
如上面指出的那样，本发明可用于检测由于向样品施加外部条件而导致的样品中的动态变化。这些外部条件包括，例如，在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品100或在样品100内的电场或磁场；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的外光场，其中所述外光场与开始用于照射样品的光场不同；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的光场，其中所述额外的光场是通过使用于照射样品的光场发生脉冲产生的；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的内部产生的光子；在第一和第二时间间隔之间改变用于照射样品的偏振光；在第一和第二时间间隔之间改变样品的温度；在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品的压力；或在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的应力。在其它实施方案中，与样品相关的化学梯度(例如施加到样品上的化学梯度)在第一和第二时间间隔之间发生变化。在另一个实施方案中，在第一和第二时间间隔之间在样品中引发生理或生物应力。在其它重要实施方案中，在多个时间观察向样品加入一种或多种化学物质(例如药物活性试剂、抗体或核酸)的动态效果。如本文中公开的那样，这样的样品可以从活细胞制备或包含活细胞。
在一些实施方案中，序列中的每个化学图像都是由所述样品的多个分开的空间精确波长分辨的图像(如上述那样，每一个都从多个“帧”形成)组成；其中所述多个分开的空间精确波长分辨的图像的每一个都对应于样品中多个不同深度中的一个。这些实施方案可用于检测在样品100整个体积中发生的化学变化，而不是在样品的单个表面或平面上发生的变化。
在其它实施方案中，序列中各个化学图像之间的差异可以与样品的正交(即互补)测量关联起来(使用例如上述的计算机或通过使用者进行)，所述正交测量在与所述序列相关联的每个时间间隔期间进行，从而增强样品中动态变化的检测或观察。可以使用的正交测量的例子包括使用下述形式进行的测量：拉曼散射、近红外吸收(NIR)、可视图像、视频或发光。也可以使用其它正交测量，并且这些测量被认为是在本发明的范围之内。
定义
如在本文中使用的那样，下面每一个术语都具有在该部分中的与其相关的意义。
“带宽”是指在一束辐射中的波长范围，使用半峰全宽法进行评估。
检测器或其它系统的“带通”是指所述检测器或系统可以分辩的波长范围，使用半峰全宽强度法进行评估。
所述“半峰全宽”(“FWHM”)法是一种通过识别连续波长范围来表征包括一定范围波长的辐射的方法，即在单一波长的辐射中，在该波长范围内，某一特性的值(例如强度或检测能力)等于所述特性的最大值的至少一半。
“光谱分辨率”是指辐射检测系统分辨两个光谱峰的能力。
虽然术语“光学的”和“光谱的”在本文中用于表示材料的性质(以及表示评估这些性质的方法)，但是，应理解这两个术语是指电磁辐射、电子或中子与所述材料的相互作用。例如，虽然电子显微术通常并不被认为是“光谱的”或“光学的”方法，但是这两个术语在本文中以包含性地方式进行使用，从而包括电子显微术。
实施例
现在参考下述实施例描述本发明。提供该实施例仅仅是用于说明目的，本发明并不限于该实施例而是包括在本发明的教导下而变得显而易见的所有变化形式。
乳腺癌细胞中拉曼活性化合物的拉曼化学成像。
将拉曼活性化合物与乳腺癌细胞进行接触。接着对细胞进行拉曼化学成像。在所述细胞与所述化合物接触之前和之后从所述细胞得到的拉曼光谱指示约900cm-1处和约2250cm-1处拉曼光谱特征的显著变化。在所述细胞与所述化合物接触之后所述细胞的拉曼化学成像证明了在细胞的细胞质中显示2250cm-1特征的化合物的位置。
本文引用的每一篇专利、专利申请和出版物的公开内容都通过引用而全部引入本文中。
虽然已经参考特定实施方案公开了本发明，但是显而易见，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域技术人员就可以设计本发明的其它实施方案和变化形式。所附的权利要求包括所有这些实施方案和等价变化形式。

Claims (43)

1.一种细胞成像方法，所述方法包括用基本单色的光照射细胞的至少一部分并在多个离散时间评估从被照射部分散射的拉曼位移光。
2.权利要求1的方法，其中在各个离散时间在多个拉曼位移(RS)值评估拉曼位移光。
3.权利要求2的方法，其中在各个离散时间在表征第一预选组分的多个拉曼位移(RS)值评估拉曼位移光。
4.权利要求3的方法，其中该组分是药物。
5.权利要求3的方法，其中该组分是细胞成分。
6.权利要求5的方法，其中该成分是一种在细胞用化合物处理之前和之后显示出不同拉曼光谱的已知成分。
7.权利要求6的方法，其中在用化合物处理细胞之前和之后评估拉曼位移光。
8.权利要求3的方法，其中在各个离散时间在表征第二预选组分的多个拉曼位移(RS)值评估拉曼位移光。
9.权利要求8的方法，其中第一组分是药物，第二组分是药物的代谢物。
10.权利要求8的方法，其中第一组分是结合到细胞成分的化合物，第二组分是没有结合到该成分的化合物。
11.权利要求10的方法，其中第一组分是共价结合到细胞成分的化合物，第二组分是没有共价结合到该成分的化合物。
12.权利要求2的方法，其中拉曼位移(RS)值是预选的。
13.权利要求1的方法，其中在单一显微视场中在基本上所有的被照射部分评估拉曼位移光。
14.权利要求1的方法，其中在单一显微视场中仅在显示出表征预选组分的另一种光谱性质的被照射部分评估拉曼位移光。
15.权利要求14的方法，其中该组分是药物。
16.权利要求14的方法，其中该组分是细胞成分。
17.权利要求14的方法，其中该成分选自特定的蛋白质、细胞器、蛋白质络合物、隔室和膜。
18.权利要求14的方法，其中另一种光谱性质选自吸收、荧光、衍射、偏振、显微形态和与粒子运动相关的光学性质。
19.权利要求1的方法，其中在评估拉曼位移光之前，拉曼位移光透射过滤光器。
20.权利要求19的方法，其中所述滤光器选自法布里-珀罗角度调谐滤光器、声-光可调谐滤光器、液晶可调谐滤光器、里奥滤光器、埃文斯分束元件液晶可调谐滤光器、索而克液晶可调谐滤光器、光谱多样性滤光器、光子晶体滤光器、固定波长法布里-珀罗可调谐滤光器、空气调谐法布里-珀罗可调谐滤光器、机械-调谐法布里-珀罗可调谐滤光器和液晶法布里-珀罗可调谐滤光器。
21.权利要求1的方法，其中在评估拉曼位移光之前，拉曼位移光透射过干涉仪。
22.权利要求21的方法，其中所述干涉仪选自与偏振无关的成像干涉仪、迈克耳孙干涉仪、沙哥纳克干涉仪、泰曼-格林干涉仪、马赫-曾德干涉仪和可调谐法布里-珀罗干涉仪。
23.权利要求1的方法，其中拉曼位移光被分束为使用各自检测器评估的多个光束。
24.权利要求23的方法，其中至少两个检测器检测具有不同偏振的拉曼位移光。
25.权利要求23的方法，其中至少两个检测器的检测帧是按时间顺序交错的。
26.权利要求1的方法，其中该细胞是定向组织的细胞，并且在与照射角相关的多个角度评估拉曼位移光的散射。
27.权利要求1的方法，其中该细胞是动物细胞。
28.权利要求1的方法，其中该动物是人。
29.一种使用样品的一系列的至少第一和第二顺序化学图像来检测在第一时间间隔和第二时间间隔之间在样品中发生的动态变化的方法，其中第一化学图像对应于在第一时间间隔期间样品的图像而第二化学图像对应于在第一时间间隔之后样品在第二时间间隔的图像，该方法包括：
(a)在第一时间间隔期间：
(i)用多个光子照射样品从而产生被样品散射的或发射的光子；
(ii)使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和
(iii)对于多个其它不同预定波段中的每一个，分别重复步骤(a)(ii)；
(b)合并步骤(a)(ii)和(a)(iii)的结果以产生样品的第一化学图像；
(c)在第二时间间隔期间：
(i)用多个光子照射样品从而产生被样品散射的或发射的光子；
(ii)使用检测元件的二维阵列同时检测从样品上或样品内的不同位置在所述第一预定波段散射的或发射的光子；和
(iii)对于多个其它不同预定波段中的每一个，分别重复步骤(c)(ii)；
(d)合并步骤(c)(ii)和(c)(iii)的结果以产生样品的第二化学图像；
(e)基于第一和第二化学图像之间的一个或多个差异，检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。
30.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的电场。
31.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的磁场。
32.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的外光场，其中该外光场与步骤(a)(i)中用于照射样品的光场不同。
33.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的内部产生的光子。
34.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变用于照射样品的偏振光。
35.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变样品的温度。
36.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品的压力。
37.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间改变施加到样品或在样品内的应力。
38.权利要求29的方法，其中与样品相关的化学梯度在第一和第二时间间隔之间发生变化。
39.权利要求29的方法，其中施加在样品上的化学梯度在第一和第二时间间隔之间发生变化。
40.权利要求29的方法，进一步包括在第一和第二时间间隔之间在样品中引发生理或生物应力。
41.权利要求29的方法，进一步包括：
在第一时间间隔期间，对于样品内多个深度中的每一个，重复步骤(a)(ii)和(a)(iii)，其中样品的第一化学图像包括与样品内多个深度中的每一个相关的空间精确波长分辨的图像化学图像；和
在第二时间间隔期间，对于样品内多个深度中的每一个，重复步骤(c)(ii)和(c)(iii)，其中样品的第二化学图像包括与样品内多个深度中的每一个相关的空间精确波长分辨的图像化学图像。
42.权利要求29的方法，其中步骤(e)进一步包括将第一和第二化学图像之间的差异与在第一和第二时间间隔期间进行的样品的正交测量关联，其中所述正交测量对应于使用至少下述形式之一进行的测量：拉曼散射、近红外吸收(NIR)、可视图像、视频或发光。
43.一种使用样品的一系列的至少第一和第二顺序化学图像来检测在第一时间间隔和第二时间间隔之间在样品中发生的动态变化的系统，其中第一化学图像对应于在第一时间间隔期间样品的图像而第二化学图像对应于在第一时间间隔之后样品在第二时间间隔的图像，所述系统包括：
(a)光源，其用多个光子照射样品从而产生被样品散射的或发射的光子；
(b)检测元件的二维阵列，其在第一时间间隔期间，(i)同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子；和(ii)此后，对于多个其它不同预定波段中的每一个，同时检测从样品上或样品内的不同位置散射的或发射的光子；
(c)处理器，其合并在第一时间间隔期间检测元件的二维阵列的输出以产生样品的第一化学图像；
(d)其中，在第二时间间隔期间，检测元件的二维阵列(i)同时检测从样品上或样品内的不同位置在第一预定波段散射的或发射的光子，和(ii)此后，对于多个其它不同预定波段中的每一个，同时检测从样品上或样品内的不同位置散射的或发射的光子；
(e)其中，处理器合并在第二时间间隔期间检测元件的二维阵列的输出以产生样品的第二化学图像；和
(f)其中，处理器基于第一和第二化学图像之间的一个或多个差异检测第一时间间隔和第二时间间隔之间样品中发生的动态变化。
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